Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Wij danken onze collega's en medewerkers voor hun bijdrage aan ons werk. Deze studie werd ondersteund door de NIH GM 29832 verlenen.

1. substraat voorbereiding
Opmerking: RNA substraten korter dan ~ 65 nucleotiden kunnen chemisch gesynthetiseerd worden met biotine (B) en de linker van de foto-cleavable (pc) (samen aangeduid als foto-cleavable biotine of pcB) covalent gekoppeld aan het RNA 5' einde (cis configuratie). RNA substraten met aanzienlijk langere bandplaatsen moeten gegenereerde in vitro van de Transcriptie T7 (of SP6) en vervolgens naar een korte aanvullende adapter oligonucleotide met PCB's deel a...

<ol>
	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

De hier beschreven methode is eenvoudig en naast het opnemen van een foto-cleavable linker en de UV-elutie stap verschilt niet van de gebruikte methoden die van de zeer sterke wisselwerking tussen Biotine en daar profiteren. De UV-elutie stap is zeer efficiënt, meestal het vrijgeven van meer dan 75% van de geïmmobiliseerdet RNA en eiwitten uit daar kralen, waardoor er achter een hoge achtergrond van proteïnen toe die niet-specifiek aan de kralen binden bijbehorende. Doordat deze achtergrond, levert de UV-elutie stap o...

In eukaryoten ondergaan RNA polymerase II gegenereerde mRNA precursoren (pre-mRNAs) verschillende evenementen van de rijping in de kern voordat hij volledig functionele mRNA sjablonen voor de eiwitsynthese in het cytoplasma. Een van deze gebeurtenissen is 3' eind verwerking. Voor de overgrote meerderheid van de pre-mRNAs omvat 3' eind verwerking decollete gekoppeld aan polyadenylatie. Deze twee stappen-reactie wordt gekatalyseerd door een relatief overvloedige complex bestaande uit meer dan 15 eiwitten1. Dierlijke replicatie-afhankelijke Histon pre-mRNAs worden verwerkt aan de 3'-eind door een ander mechanisme waarin de hoofdrol wordt gespeeld door U7 snRNP, een lage overvloed complex bestaande uit snRNA van de U7 van ~ 60 nucleotiden en meerdere eiwitten2,3 . De U7 snRNA baseparen met een specifieke opeenvolging Histon pre-mRNA en één van de subeenheden van de U7 snRNP katalyseert de splitsingsproducten-reactie, het genereren van volwassen Histon mRNA zonder een poly(A) staart. 3' eind verwerking van Histon pre-mRNA vereist ook stam-Loop bindende eiwit (SLBP), die een geconserveerde stam-lus ligt bindt stroomopwaarts van de breukzijde en verbetert de aanwerving van de U7 snRNP naar de substraat2,3. Studies die gericht zijn op het identificeren van de afzonderlijke onderdelen van de U7 snRNP geweest uitdagend vanwege de lage concentratie van de U7 snRNP in dierlijke cellen en de tendens van het complex te distantiëren of gedeeltelijke proteolyse ondergaan tijdens het zuiveringsproces ongehinderd door het gebruik van milde detergentia4,5,6, hoge zout wast en/of meerdere chromatografische stappen7,-8,9.
Onlangs, om te bepalen van de samenstelling van de machines voor het behandelen van de U7-afhankelijke, was een kort fragment van Histon pre-mRNA met biotine op 3' of 5' geïncubeerd met een nucleaire extract en de geassembleerde complexen werden vastgelegd op daar beklede agarose kralen5,6,10. Als gevolg van de uitzonderlijk sterke interactie tussen Biotine en daar, waren de eiwitten geïmmobiliseerd op daar kralen geëlueerd onder de voorwaarden door te koken in SDS denaturering en geanalyseerd door zilveren kleuring en massaspectrometrie. Terwijl deze eenvoudige aanpak een aantal onderdelen van de U7 snRNP vastgesteld, leverde het relatief ruwe monsters, vaak besmet met een groot aantal achtergrond eiwitten nonspecifically gebonden aan daar kralen, sommige onderdelen van potentieel te maskeren de machines voor het behandelen en voorkomen van hun detectie op zilver gekleurde gels5,6,10. Nog belangrijker is, deze aanpak ook uitgesloten geen functionele studies met de geïsoleerde materiaal en haar verdere zuivering aan homogeniteit door aanvullende methoden.
Een aantal wijzigingen werden voorgesteld na verloop van tijd inspelen op het vrijwel onomkeerbare karakter van de interactie van biotine/daar, met de meeste van hen wordt ontworpen ofwel verzwakken de interactie of een chemisch cleavable spacer arm in de Biotine-bevattende reagentia11,12. Het nadeel van alle wijzigingen van deze was dat ze aanzienlijk de doeltreffendheid van de methode en/of vaak vereist niet-fysiologische omstandigheden tijdens de elutie stap verminderen, de integriteit of de activiteit van de gezuiverde eiwitten in gevaar te brengen.
Hier beschrijven we een andere aanpak om de inherente probleem te verhelpen van de strategie van biotine/streptavidine met behulp van RNA substraten waarin Biotine covalent is bevestigd aan de 5' einde via een foto-cleavable 1-(2-nitrofenyl) ethyl-groep die is gevoelig voor de lange golf UV13,14. Wij testten deze aanpak voor de zuivering van de beperkende machines voor het behandelen van U7-afhankelijke van Drosophila en zoogdieren nucleaire extracten15. Na een korte broedtijd van Histon pre-mRNA met biotine en de foto-cleavable linker met een nucleaire extract, de geassembleerde verwerking complexen zijn geïmmobiliseerd op daar kralen, grondig gewassen en voorzichtig vrijgegeven aan oplossing in een native formulier door blootstelling aan ~ 360 nm UV licht. De UV-elutie-methode is zeer efficiënt, snel en eenvoudig, voldoende hoeveelheden van de U7 snRNP te visualiseren van de componenten ervan door Splinter kleuring van zo weinig zoals 100 µL van het extract15oplevert. Het materiaal UV-geëlueerd is gratis achtergrond eiwitten en geschikt voor directe massaspectrometrie analyse, extra zuivering stappen en enzymatische tests. Dezelfde methode kan worden vastgesteld voor de zuivering van andere RNA/eiwitcomplexen, die relatief korte RNA bandplaatsen vereisen. Biotine en de foto-cleavable linker kunnen ook worden covalent bevestigd aan één - en dubbelstrengig DNA, de UV-elutie-methode voor de zuivering van diverse complexen van de DNA/proteïne potentieel uit te breiden.
Chemische synthese van RNA substraten met covalent gekoppeld Biotine en de foto-cleavable linker is praktisch alleen met de sequenties die overschrijd niet ~ 65 nucleotiden, steeds dure en inefficiënte voor aanzienlijk langere sequenties. Om aan te pakken dit probleem, ontwikkelden we ook een alternatieve benadering die geschikt is voor veel langer RNA-bindende doelstellingen. In deze benadering RNA van elke lengte en nucleotide sequentie is gegenereerd in vitro van de Transcriptie T7 of SP6 en gegloeid om een korte aanvullende oligonucleotide dat bevat Biotine en de foto-cleavable linker eind 5' (trans configuratie). De resulterende duplex wordt vervolgens gebruikt voor het zuiveren van individuele bindende proteïnen of macromoleculaire complexen op daar kralen na hetzelfde protocol beschreven voor de RNA-substraten met foto-cleavable Biotine covalent aangesloten (cis configuratie). Met deze wijziging, kan de foto-cleavable Biotine worden gebruikt in combinatie met in vitro gegenereerd afschriften met honderden nucleotiden, uitbreiding van de UV-elutie-methode voor de zuivering van een brede waaier van RNA/proteïne.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

Voor vele jaren, is het uitzonderlijk sterk en snel gevormde interactie tussen Biotine en daar met succes gebruikt voor gedeeltelijke reiniging van biologisch belangrijke RNA/eiwitcomplexen. Echter deze strategie vertoont een grote nadeel dat het breder gebruik beperkt: de interactie van biotine/daar slechts onder voorwaarden die ook het verstoren van de integriteit van de eluted complexen, vandaar uitschakeling denaturering kan worden doorbroken hun latere functionaalanalyse en/of verdere zuivering door andere methoden. De eluted monsters zijn bovendien vaak besmet met de achtergrond eiwitten die nonspecifically met daar kralen associëren, bemoeilijken de analyse van de gezuiverde complexen door zilveren kleuring en massaspectrometrie. Deze beperkingen wilt opheffen, ontwikkelden we een variant van de biotine/daar strategie waarin Biotine is aangesloten op een substraat van RNA via een foto-cleavable linker en de complexen geïmmobiliseerd op daar kralen zijn selectief geëlueerd aan oplossing in een inheemse vorm door lange golf UV, verlaten de achtergrond eiwitten op de parels. Kortere RNA-bindende substraten kunnen gesynthetiseerd worden chemisch met biotine en de foto-cleavable linker covalent gekoppeld aan het einde 5' van het RNA, overwegende dat langer RNA substraten kunnen worden voorzien van de twee groepen door een aanvullende oligonucleotide. Deze twee varianten van de UV-elutie-methode zijn getest voor zuivering van de U7 snRNP-afhankelijke verwerking complexen die Histon pre-mRNAs aan de 3'-eind klieven en zij allebei bewezen te gunstig vergelijken met andere eerder zuivering methodes ontwikkeld. De UV-geëlueerd monsters bevatte gemakkelijk detecteerbare hoeveelheid de U7 snRNP dat gratis grote eiwit contaminanten en geschikt voor een directe analyse van massaspectrometrie en functionele testen was. De beschreven methode kan gemakkelijk worden aangepast voor de zuivering van andere RNA-bindende complexen en gebruikt in combinatie met single - en double-stranded DNA bandplaatsen om DNA-specifieke proteïnen en macromoleculaire complexen te zuiveren.

De UV-elutie-methode werd getest met twee chemisch gesynthetiseerde RNA substraten covalent aangesloten eind 5' op de pcB-groep (cis configuratie): pcB-SL (Figuur 1) en pcB-dH3/5 m RNAs (Figuur 2). De 31-nucleotide pcB-SL RNA bevat een structuur van de stam-lus gevolgd door een 5-nucleotide één gestrande staart en de volgorde is identiek aan de 3'-eind van volwassen Histon mRNA (dwz., na de splitsing van Histo...

Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

RNA/eiwitcomplexen gezuiverd met behulp van botin-streptavidine strategie worden geëlueerd oplossing onder denatureren voorwaarden in een vorm die ongeschikt zijn voor verdere zuivering en de functionaalanalyse. Hier beschrijven we een wijziging van deze strategie dat gebruik maakt van een foto-cleavable linker in RNA en een zachte UV-elutie stap, inheemse en volledig functionele RNA/eiwitcomplexen oplevert.

-Voor-stapmodus zuivering van macromoleculaire complexen met behulp van RNA gekoppeld aan biotine en een foto-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Deze methode moet van belang zijn voor onderzoekers die proberen RNA-eiwitcomplexen te isoleren en hun samenstelling te identificeren door middel van massaspectrometrie. Wij geloven dat ons protocol vooral nuttig zal zijn voor het zuiveren van complexen die in cellen in beperkte hoeveelheden bestaan en de neiging hebben om te scheiden tijdens lange meerstapszuiveringsprocedures. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het gaat om slechts een enkele zuivering stap en kan worden gebruikt met RNA bindende sites van elke lengte en volgorde.Het aantonen van een aantal van de stappen zal Xiao-cui Yang, die een senior onderzoekstechnicus in onze groep. Voor bindingssites die aanzienlijk langer zijn dan 65 nucleotiden, verkrijgen T7 gegenereerde RNA en een adapter PCB oligonucleotide zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng 20 picomolen van het RNA met 100 picomoles van de adapter oligonucleotide in een 1,5 milliliter buis met 100 microliter binding buffer.Plaats de buis in kokend water en laat het 5 minuten inbroeden. Laat het water vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Eerste aanvulling 1 milliliter van de muis kernextract met 80 millimolar EDTA bij pH 8 tot een uiteindelijke concentratie van 10 millimolar.Voeg vervolgens tussen de 5 en 10 picomoles van het RNA-substraat toe dat is gelabeld met de PCB moiety. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten, zorg ervoor dat af en toe meng het monster. Gebruik vervolgens een voorgekoelde microcentrifuge bij 4 graden Celsius om het mengsel gedurende 10 minuten op 10.000 g te centrifugeren om eventuele neerslagen te verwijderen.Verzamel de supernatant voorzichtig in een nieuwe buis op ijs, terwijl voorzichtig is om te voorkomen dat de pellet wordt overgebracht. Breng ongeveer 100 microliter streptavidin agarose kraal suspensie over naar een buis van 1,5 milliliter. Voeg ongeveer 1 milliliter bindende buffer toe om te beginnen met het wassen van de kralen.Centrifugeer de buis op 25 keer g gedurende 2 tot 3 minuten en aspirate de supernatant. Herhaal dit was- en centrifugatieproces 2 tot 3 keer om de kralen te equilibreren met de bindingsbuffer. Laad de eerder verzamelde supernatant, die het geassembleerde complex over de geëquilibreerde kralen bevat.Met behulp van een buis rotator, draai de buis voor 1 uur op 4 graden Celsius om de RNA en gebonden complexen immobiliseren op de kralen. Draai vervolgens de buis op 25 keer g gedurende 2 tot 3 minuten om de kralen te verzamelen aan de onderkant van de buis. Aspirate de supernatant.En spoel de kralen twee keer met bindende buffer, met behulp van de eerder beschreven wasproces. Na het verwijderen van de supernatant van de tweede was, voeg 1 milliliter bindende buffer en draai het monster gedurende 1 uur op 4 graden Celsius. Draai het monster 25 keer g af gedurende 2 tot 3 minuten.Voeg vervolgens 1 milliliter bindingsbuffer toe en breng de ophanging over naar een nieuwe buis. Draai het monster maximaal 1 uur op 4 graden Celsius. Centrifugeren de geïmmobiliseerde complexen op 25 keer g gedurende 2 tot 3 minuten.Dan aspirate supernatant, en voeg 200 microliter van bindende buffer. Breng de kralen over naar een 500 microliter buis. Zet een uv-lamp met hoge intensiteit aan die UV-licht uitzendt op 365 nanometer en laat het volledige schittering bereiken.Vul de bodem van een petrischaaltje met strak verpakt ijs dat het over het deksel van de schotel stapelt. Kort vortex de buis met de geïmmobiliseerde complexen. Plaats het vervolgens horizontaal op het ijs en bedek het met de voorverwarmde lamp, om ervoor te zorgen dat het monster 2 tot 3 centimeter van het oppervlak van de lamp verwijderd is.Bestraal het monster gedurende in totaal 30 minuten terwijl de buis vaak wordt omgedraaid en vortexing om een uniforme blootstelling te garanderen en oververhitting te voorkomen. Draai hierna 2 tot 3 minuten de kralen op 25 keer g en verzamel de supernatant. Centrifuge dit supernatant nogmaals onder dezelfde voorwaarden.Verzamel de resulterende supernatant om ervoor te zorgen dat een kleine hoeveelheid aan de onderkant van de buis te verlaten om te voorkomen dat de overdracht van eventuele resterende kralen. Met behulp van SDS-PAGE elektroforese, scheiden een fractie van de UV eluted supernatant en de overeenkomstige fractie van het materiaal links op de kralen na UV-elution. Gebruik vervolgens een commercieel verkrijgde zilveren kleuringkit om de gel te bevlekken.Evalueer de efficiëntie van UV-elutie door de intensiteit van de eiwitten die aanwezig zijn in de UV-eluted supernatant en die links op de kralen na UV-bestraling te vergelijken. Accijns de eiwit banden van belang en bepalen hun identiteit door massaspectrometrie. Daarna direct analyseren van een fractie van de UV eluted supernatant door massaspectrometrie om het volledige proteoom van het gezuiverde materiaal te bepalen op een onbevooroordeelde manier.In deze studie wordt stamlus RNA met foto-cleavable biotine geïncubeerd met 1 milliliter cytoplasmatisch S100-extract verkregen uit muizen myeloomcellen. En het effect en de efficiëntie van UV-elutie wordt geanalyseerd door zilveren vlekken. Een aantal eiwitten worden gedetecteerd op de streptavidin kralen voor UV-elutie.Bestraling met lange golf UV releases slechts een aantal van deze eiwitten in de supernatant waardoor een niet-specifieke achtergrond op de kralen. Dit benadrukt het belang van de UV-elutiestap. Massaspectrometrie identificeert de belangrijkste UV-eluted eiwitten als 3'hExo en SLBP met SLBP wordt vertegenwoordigd door zowel de volledige lengte eiwit en een aantal kortere afbraak producten.Kleinere hoeveelheden andere eiwitten geïdentificeerd als verschillende RNA bindende eiwitten ook selectief vrijgegeven in oplossing door de UV-bestraling. UV-elutie van geïmmobiliseerde Drosophila histone pre-mRNA gelabeld met foto-cleavable biotine geïncubeerd met een nucleair extract resulteerde in een selectieve release van slechts een klein aantal eiwitten in de supernatant met een intense achtergrond van niet-specifieke eiwitten die overblijven op de kralen. Massaspectrometrie identificeert deze eiwitten als componenten van de U7 snRNP.Ze worden niet gedetecteerd in aanwezigheid van verwerkingsconcurrenten die de binding van U7 snRNP blokkeren aan histone pre-mRNA. Het is belangrijk om een hoge intensiteit UV-lamp te gebruiken en plaats het een korte afstand tot het bestraalde monster, terwijl ook ervoor te zorgen dat het niet oververhit raakt. De UV-elutiemethode levert inheemse RNA-eiwitcomplexen op die grote verontreinigingen missen en direct geschikt zijn voor extra zuiveringsstappen en functionele testen.Vermijd blootstelling aan ogen en huid tijdens UV-bestraling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horizontale Gel Electroforese voor Verbeterde Detectie van Proteïne-RNA Complexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...