Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
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Nous remercions nos collègues et collaborateurs pour leur contribution à nos travaux. Cette étude a été financée par les NIH accorder GM 29832.

1. préparation du substrat
NOTE : Substrats RNA inférieurs à 65 ~ nucléotides peuvent être synthétisés chimiquement avec la biotine (B) et le linker de photo-clivables (pc) (ensemble dénommé photo-clivables biotine ou pcB) par covalence attaché à l’extrémité 5' RNA (configurationcis ). RNA substrats contenant des sites de liaison significativement plus longues doivent être générés in vitro de transcription T7 (ou SP6) et ensuite recuit à un oligonucléotide...

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	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

La méthode décrite ici est simple et outre incorporant un linker photo-clivables et l’étape d’élution UV ne diffère pas des méthodes couramment utilisées qui tirent parti de la très forte interaction entre la biotine et la streptavidine. L’étape d’élution UV est très efficace, généralement libérant plus de 75 % de l’ARN immobilisée et protéines de streptavidine beads, laissant derrière elle un fond important de protéines qui se lient non spécifiquement aux talons associées. En éliminant cet...

Chez les eucaryotes, les précurseurs de l’ARN polymérase II généré ARNm (pré-ARNm) subissent plusieurs événements de maturation dans le noyau avant de devenir des modèles de mRNA entièrement fonctionnel pour la synthèse des protéines dans le cytoplasme. Un de ces événements est 3' fin au traitement. Pour la grande majorité des pré-ARNm, 3' fin traitement implique de clivage couplé à la polyadénylation. Cette réaction en deux étapes est catalysée par un complexe relativement abondant composée de plus de 15 protéines1. Animaux dépendante de réplication histone pré-ARNm est traitées à l’extrémité 3' par un mécanisme différent, dont le rôle est joué par U7 snRNP, une faible abondance complexe consistant en U7 snRNA de ~ 60 nucléotides et plusieurs protéines2,3 . Les paires de bases U7 snRNA avec une séquence spécifique en histone pré-ARNm et l’une des sous-unités de la snRNP U7 catalyse la réaction de clivage, générant des histones mature ARNm sans un poly (a) la queue. fin traitement de 3' de l’ARN pré-messager histone exige également la tige-boucle Binding Protein (PBEL), qui lie une tige-boucle conservée située en amont du site de clivage et améliore le recrutement de la snRNP U7 au substrat2,3. Des études visant à identifier les différents composants de la snRNP U7 ont été difficiles en raison de la faible concentration de la snRNP U7 dans les cellules animales et la tendance du complexe à dissocier ou subir une protéolyse partielle durant la purification suite à l’utilisation détergents doux4,5,6, lavages de sels élevées et/ou plusieurs étapes chromatographiques7,8,9.
Récemment, afin de déterminer la composition de la machinerie U7-dépendant de traitement, un court fragment de biotine contenant de histone pré-ARNm à 3' ou 5' est incubé avec un extrait nucléaire et l’assemblé complexes ont été capturés sur la streptavidine d’agarose perles5,6,10. Due à l’interaction exceptionnellement forte entre la biotine et la streptavidine, protéines immobilisées sur des billes de streptavidine ont été élués dans des conditions dénaturantes par ébullition en SDS et analysées par coloration à l’argent et la spectrométrie de masse. Bien que cette approche simple a identifié un certain nombre de composants de la snRNP U7, il a donné des échantillons relativement grossières, souvent contaminées par un grand nombre de protéines de fond non spécifique lié à la streptavidine perles, potentiellement masquant certaines composantes du les machines de traitement et d’empêcher leur détection sur argent souillé gels5,6,10. Ce qui est important, cette approche empêche également toute étude fonctionnelle avec le matériel isolé et sa purification plus poussée à l’homogénéité des méthodes supplémentaires.
Un certain nombre de modifications ont été proposé au fil du temps d’aborder le caractère pratiquement irréversible de l’interaction de la streptavidine/biotine, avec la plupart d'entre eux étant conçu soit affaiblir l’interaction ou fournir un bras chimiquement clivables entretoise dans la biotine-contenant les réactifs11,12. L’inconvénient de ces modifications était qu’ils réduisent significativement l’efficacité de la méthode et/ou des conditions non physiologiques souvent requises lors de l’étape d’élution, compromettre l’intégrité ou l’activité des protéines purifiées.
Nous décrivons ici une approche différente pour résoudre le problème inhérent de la stratégie de streptavidine/biotine en utilisant RNA substrats dans lequel biotine est covalente à la 5' mettre fin via une photo-clivables 1-(2-nitrophényl) portion d’éthyle qui est sensible à la longue vague UV13,14. Nous avons testé cette approche pour la purification de la machinerie de traitement limitante U7 dépendant de drosophile et mammifères nucléaire extrait15. Après une courte incubation de biotine contenant de l’ARN pré-messager histone et l’éditeur de liens clivables-photo avec un extrait nucléaire, les complexes de traitement assemblé sont immobilisés sur des billes de streptavidine, lavés et doucement libérés dans la solution en natif se forment par exposition à une lumière ~ 360 nm UV. La méthode UV-élution est très efficace, rapide et simple, ce qui donne une quantité suffisante de la snRNP U7 pour visualiser ses composantes par sliver coloration d’aussi peu que 100 µL de l' extrait15. Le matériel UV-élué est exempt de protéines de fond et approprié pour l’analyse directe par spectrométrie de masse, des étapes de purification supplémentaire et des essais enzymatiques. La même méthode peut être adoptée pour la purification des autres complexes ARN/protéines qui nécessitent des sites de fixation de RNA relativement courtes. Biotine et l’éditeur de liens clivables-photo peuvent également être par covalence fixés à single - et ADN bicaténaire, potentiellement étendre la méthode d’élution UV pour la purification de divers complexes ADN/protéine.
Synthèse chimique des substrats de RNA contenant par covalence attaché biotine et l’éditeur de liens photo-clivables pratique qu’avec les séquences qui ne dépassent pas 65 ~ nucléotides, plus coûteuse et inefficace pour les séquences significativement plus longues. Pour résoudre ce problème, nous avons développé également une autre approche qui convient à des objectifs contraignants RNA beaucoup plus longues. Dans cette approche, l’ARN de n’importe quelle séquence de longueur et de nucléotide est généré en vitro par transcription T7 ou SP6 et recuite à un court oligonucléotide complémentaire qui contient de la biotine et l’éditeur de liens photo-clivables à l’extrémité 5' (trans configuration). Le duplex qui en résulte est ensuite utilisé pour purifier les protéines de liaison individuelle ou complexes macromoléculaires streptavidine perles suivant le même protocole décrit pour les substrats de RNA contenant photo-clivables biotine attaché de façon covalente (CEI configuration). Avec cette modification, la biotine photo-clivables peut être utilisée en conjonction avec in vitro généré transcriptions, contenant des centaines de nucléotides, d’étendre la méthode d’élution UV pour la purification d’une large gamme d’ARN/protéines.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

Pendant de nombreuses années, l’interaction exceptionnellement forte et rapidement formée entre la biotine et la streptavidine a été utilisée avec succès pour la purification partielle de biologiquement importants complexes ARN/protéines. Cependant, cette stratégie souffre d’un inconvénient majeur qui limite son utilisation plus large : l’interaction de la streptavidine/biotine peut être cassée seulement dans des conditions qui perturbent également l’intégrité des complexes éluées, excluant par conséquent dénaturantes leur analyse fonctionnelle et/ou encore de purification par d’autres méthodes. En outre, les échantillons éluées sont fréquemment contaminés avec les protéines de fond qui associent non spécifique avec des perles de streptavidine, ce qui complique l’analyse des complexes purifiées par coloration à l’argent et la spectrométrie de masse. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé une variante de la stratégie de streptavidine/biotine dans lequel biotine est attaché à un substrat ARN via un linker photo-clivables et les complexes immobilisés sur des billes de streptavidine sont élués sélectivement à la solution dans un forme native de grande longueur d’onde UV, laissant les protéines de fond sur les perles. Substrats de liaison RNA plus courtes peuvent être synthétisés chimiquement avec la biotine et l’éditeur de liens photo-clivables covalente à l’extrémité 5' de l’ARN, tandis que des substrats de RNA plus longues peuvent être fournis avec les deux groupes par un oligonucléotide complémentaire. Ces deux variantes de la méthode d’élution UV ont été testés pour la purification des U7 snRNP-dépendant de traitement complexes qui coupent les histones pré-ARNm à l’extrémité 3' et ils ont tous deux prouvèrent pour comparer favorablement aux autres précédemment développé des méthodes de purification. Les échantillons UV-élué contiennent facilement détectable de la snRNP U7 qui était exempt de contaminants de la protéine majeure et adapté à l’analyse directe par spectrométrie de masse et de tests fonctionnels. La méthode décrite peut être facilement adaptée pour la purification des autres complexes de liaison ARN et utilisée en conjonction avec des sites de liaison simple et double-brin de l’ADN pour purifier les protéines ADN spécifiques et complexes macromoléculaires.

La méthode UV-élution a été testée avec deux substrats de RNA synthétisés chimiquement de façon covalente à l’extrémité 5' de la portion de pcB (configurationcis ) : pcB-SL (Figure 1) et pcB-dH3/5 m RNAs (Figure 2). Le 31-nucléotide pcB-SL RNA contient une structure de tige-boucle suivie d’une queue de brin unique 5-nucléotide et sa séquence est identique à l’extrémité 3' de l’histone mature ARN...

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Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Les complexes ARN/protéines purifiées à l’aide de la stratégie de streptavidine-botin sont éluées à solution dans des conditions dénaturation sous une forme impropre pour davantage de purification et d’analyse fonctionnelle. Nous décrivons ici une modification de cette stratégie qui utilise un linker photo-clivables en ARN et une étape d’élution UV douce, ce qui donne des complexes ARN/protéines natives et pleinement fonctionnels.

Seule étape Purification des Complexes macromoléculaires utilisant l’ARN attaché à la biotine et un éditeur de liens Photo-clivables

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Cette méthode devrait intéresser les chercheurs qui tentent d’isoler les complexes protéiques de l’ARN et d’identifier leur composition par spectrométrie de masse. Nous croyons que notre protocole sera particulièrement utile pour purifier les complexes qui existent dans les cellules en quantités limitées et ont tendance à se dissocier au cours de longues procédures de purification en plusieurs étapes. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle n’implique qu’une seule étape de purification et pourrait être utilisée avec des sites de liaison arn de n’importe quelle longueur et séquence.Xiao-cui Yang, technicien de recherche principal dans notre groupe, démontrera certaines étapes. Pour les sites de liaison significativement plus longs que 65 nucléotides, obtenir l’ARN généré par T7 et un oligonucléotide PCB adaptateur tel que décrit dans le protocole de texte. Mélanger 20 picomoles de l’ARN avec 100 picomoles de l’oligonucléotide adaptateur dans un tube de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de tampon liant.Placer le tube dans l’eau bouillante et laisser incuber pendant 5 minutes. Laissez ensuite l’eau refroidir à température ambiante. Premier supplément 1 millilitre d’extrait nucléaire de souris avec 80 millimolaire EDTA au pH 8 à une concentration finale de 10 millimolar.Ajoutez ensuite entre 5 et 10 picomoles du substrat d’ARN qui a été marqué avec la moiety PCB. Incuber sur la glace pendant 5 minutes, en s’assurant de mélanger occasionnellement l’échantillon. Ensuite, utilisez une microcentrifugeuse pré-refroidie à 4 degrés Celsius pour centrifuger le mélange à 10 000 fois g pendant 10 minutes pour éliminer les précipités potentiels.Recueillir soigneusement le supernatant dans un nouveau tube sur la glace, tout en prenant soin d’éviter de transférer la pastille. Transférer environ 100 microlitres de suspension de perle d’agarose streptavidine dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter environ 1 millilitre de tampon de liaison pour commencer à laver les perles.Centrifuger le tube à 25 fois g pendant 2 à 3 minutes et aspirer le surnatant. Répétez ce processus de lavage et de centrifugation 2 à 3 fois pour équilibrer les perles avec le tampon de liaison. Chargez le supernatant précédemment recueilli, qui contient le complexe assemblé sur les perles équilibrées.À l’aide d’un rotateur à tube, faire pivoter le tube pendant 1 heure à 4 degrés Celsius pour immobiliser l’ARN et ligoté les complexes sur les perles. Tournez ensuite le tube à 25 fois g pendant 2 à 3 minutes pour recueillir les perles au fond du tube. Aspirez le surnatant.Et rincer les perles deux fois avec tampon de liaison, en utilisant le processus de lavage précédemment décrit. Après avoir enlevé le supernatant du deuxième lavage, ajouter 1 millilitre de tampon de liaison et faire pivoter l’échantillon pendant 1 heure à 4 degrés Celsius. Faites tourner l’échantillon à 25 fois g pendant 2 à 3 minutes.Ajouter ensuite 1 millilitre de tampon de liaison et transférer la suspension dans un nouveau tube. Faites pivoter l’échantillon à 4 degrés Celsius jusqu’à 1 heure. Centrifugeuse les complexes immobilisés à 25 fois g pendant 2 à 3 minutes.Puis aspirer supernatant, et ajouter 200 microlitres de tampon de liaison. Transférer les perles dans un tube de 500 microlitres. Allumez une lampe UV de haute intensité qui émet de la lumière UV à 365 nanomètres et lui permettent d’atteindre son plein éclat.Remplissez le fond d’une boîte de Pétri avec de la glace bien emballée qui l’empile sur le couvercle du plat. Vortex brièvement le tube contenant les complexes immobilisés. Placez-le ensuite horizontalement sur la glace et couvrez-le de la lampe préchauffée, en vous assurant que l’échantillon est à 2 à 3 centimètres de la surface de l’ampoule.Irradier l’échantillon pendant un total de 30 minutes tout en inversant et vortexant fréquemment le tube pour assurer une exposition uniforme et prévenir la surchauffe. Après cela, faire tourner les perles à 25 fois g pendant 2 à 3 minutes et recueillir le surnatant. Centrifugeuse ce supernatant une fois de plus en utilisant les mêmes conditions.Recueillir le supernatant résultant en s’assurant de laisser une petite quantité au fond du tube pour éviter de transférer des perles résiduelles. À l’aide de l’électrophorésie SDS-PAGE, séparez une fraction du supernatant uv et de la fraction correspondante du matériau laissé sur les perles après l’élitution UV. Ensuite, utilisez un kit de coloration d’argent disponible dans le commerce pour tacher le gel.Évaluer l’efficacité de l’élitution UV en comparant les intensités des protéines présentes dans le supernatant uv éludé et celles laissées sur les perles après irradiation UV. Exciser les bandes protéiques d’intérêt et déterminer leur identité par spectrométrie de masse. Après cela, analysez directement une fraction du supernatant élit uv par spectrométrie de masse pour déterminer le protéome entier du matériel purifié d’une manière impartiale.Dans cette étude, l’ARN de boucle souche marqué avec la biotine photo-clivable est incubé avec 1 millilitre d’un extrait cytoplasmique de S100 obtenu des cellules de myélome de souris. Et l’effet et l’efficacité de l’élitution UV est analysé par coloration d’argent. Un certain nombre de protéines sont détectées sur les perles de streptavidine avant l’élitution UV.L’irradiation avec uv à ondes longues libère seulement quelques-unes de ces protéines dans le supernatant laissant un fond non spécifique sur les perles. Cela souligne l’importance de l’étape d’élitution UV. La spectrométrie de masse identifie les principales protéines uv éluquées comme étant 3'hExo et SLBP, le SLBP étant représenté à la fois par la protéine pleine longueur et un certain nombre de produits de dégradation plus courts.De plus petites quantités d’autres protéines identifiées comme diverses protéines liant l’ARN ont également sélectivement libéré dans la solution par l’irradiation UV. L’élitution UV de l’histone immobilisé Drosophila pré-ARNm marqué avec de la biotine photo-clivable incubée avec un extrait nucléaire a entraîné une libération sélective de seulement un petit nombre de protéines dans le supernatant avec un fond intense de protéines non spécifiques restant sur les perles. La spectrométrie de masse identifie ces protéines comme composants du SnRNP U7.Ils ne sont pas détectés en présence de concurrents de traitement qui bloquent la liaison de U7 snRNP à l’histone pré-ARNm. Il est important d’utiliser une lampe UV de haute intensité et de la placer à une distance proche de l’échantillon irradié tout en s’assurant qu’elle ne surchauffe pas. La méthode d’élitution UV donne des complexes de protéines ARN indigènes qui n’ont pas de contaminants majeurs et qui conviennent directement à des étapes de purification supplémentaires et à des analyses fonctionnelles.Évitez l’exposition des yeux et de la peau pendant l’irradiation uv.

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Biochemistry

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