Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
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Wir danken unseren Kollegen und Mitarbeitern für ihren Beitrag zu unserer Arbeit. Diese Studie wurde unterstützt durch das NIH GM 29832 zu gewähren.

(1) Substrataufbereitung
Hinweis: RNA Substrate kürzer als ~ 65 Nukleotide mit Biotin (B) und der Foto-spaltbaren (pc)-Linker (zusammen bezeichnet als Foto-spaltbaren Biotin oder pcB) kovalent an die RNA 5'-Ende (Cis -Konfiguration) befestigt chemisch synthetisiert werden können. RNA-Substrate, enthält deutlich mehr Bindungsstellen generierten in Vitro durch T7 (oder SP6) Transkription sein müssen und anschließend geglüht, eine kurze ergänzende Adapter Oligonukleotid mit...

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	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

Die hier beschriebene Methode ist unkompliziert und neben der Einbeziehung eines Foto-spaltbaren Linkers und der UV-Elution Schritt unterscheidet sich nicht von den gängigen Methoden, die die extrem starke Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin nutzen. Der UV-Elution Schritt ist sehr effizient, in der Regel die Freigabe mehr als 75 % der immobilisierten RNA und Proteine aus Streptavidin Perlen, hinterlässt einen hohen Hintergrund von Proteinen, die unspezifisch an die Perlen zu binden verbunden. Durch den Wegf...

In den Eukaryotes unterzogen RNA-Polymerase II-generierte mRNA Vorstufen (Pre-mRNAs) mehrere Reifung Ereignissen im Zellkern vor immer voll funktionsfähige mRNA-Vorlagen für die Proteinsynthese im Zytoplasma. Eines dieser Ereignisse ist 3' End-Verarbeitung. Für die überwiegende Mehrheit der Pre-mRNAs umfasst 3' Ende Verarbeitung Spaltung an Polyadenylation gekoppelt. Diese zweistufige Reaktion ist katalysiert durch ein relativ reichlich Komplex bestehend aus mehr als 15 Proteine1. Tier-Replikation-abhängige Histon Pre-mRNAs werden am 3'-Ende durch einen anderen Mechanismus verarbeitet in denen die Schlüsselrolle von U7 SnRNP, eine niedrige Fülle Komplex bestehend aus U7 SnRNA ~ 60 Nukleotide und mehrere Proteine2,3 gespielt wird . Die U7 SnRNA Basenpaare mit einer bestimmten Reihenfolge in Histon Pre-mRNA und eine der Untereinheiten der U7 SnRNP katalysiert die Spaltung Reaktion, Generierung von Reifen Histon mRNA ohne eine poly(A) tail. 3' End-Verarbeitung von Histon Pre-mRNA erfordert auch Stem-Loop Binding Protein (SLBP), die eine erhaltene Stamm-Schleife befindet sich bindet die Spaltstelle stromaufwärts und fördert die Einstellung von der U7 SnRNP Substrat2,3. Studien zur Identifizierung einzelner Komponenten der U7-SnRNP wurden durch die geringe Konzentration von U7-SnRNP in tierischen Zellen und die Tendenz des Komplexes zu distanzieren oder teilweise Proteolyse zu unterziehen, während der Reinigung durch den Einsatz von anspruchsvoll Feinwaschmittel4,5,6, hohe Salz wäscht und/oder mehrere chromatographische Schritte7,8,9.
Vor kurzem, um die Zusammensetzung der U7-abhängige Verarbeitungsmaschinen zu ermitteln, wurde ein kurzes Fragment von Histon Pre-mRNA enthält Biotin auf 3' oder 5' mit einem nuklearen Extrakt inkubiert und die montierten Anlagen wurden gefangen genommen, auf Streptavidin beschichteten Agarose Korne5,6,10. Aufgrund der außergewöhnlich starken Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin Proteine auf Streptavidin Perlen immobilisiert eluiert unter denaturierenden Bedingungen durch Kochen in SDS und durch silberne Färbung und Massenspektrometrie analysiert. Während diesem einfache Ansatz eine Reihe von Komponenten der U7 SnRNP identifiziert, ergab es relativ primitiven Proben, oft mit einer großen Anzahl von Hintergrund-Proteinen nonspecifically verpflichtet Streptavidin Perlen, möglicherweise einige Komponenten der Maskierung kontaminiert die Verarbeitungsmaschinen und verhindern, dass ihre Erkennung auf Silber gefärbt Gele5,6,10. Wichtig ist, diesen Ansatz ausgeschlossen auch funktionellen Studien mit dem isolierten Material und dessen weitere Reinigung zur Homogenität durch zusätzliche Methoden.
Eine Reihe von Änderungen wurden vorgeschlagen, im Laufe der Zeit an die praktisch Unumkehrbarkeit Biotin/Streptavidin-Interaktion, die meisten davon entwerfend, entweder die Interaktion zu schwächen oder zu einem chemisch spaltbaren Abstandhalter Arm in die Biotin-haltigen Reagenzien11,12. Der Nachteil dieser Änderungen war, dass sie deutlich die Effizienz der Methode bzw. oft nicht physiologischen Bedingungen während der Elution Schritt, gefährden die Integrität oder die Aktivität der gereinigten Proteine reduzieren.
Hier beschreiben wir einen anderen Ansatz zur Lösung des inhärenten Problems der Biotin/Streptavidin-Strategie mittels RNA Substrate, in denen Biotin ist kovalent an das 5' Ende über eine Foto-spaltbaren 1-(2-Nitrophenyl) Ethyl-Verbindungsgruppe, die empfindlich gegen UV13,14lange Welle. Wir testeten diese Vorgehensweise für die Reinigung der begrenzende U7-abhängige Verarbeitungsmaschinen von Drosophila und Säugetieren nuklearen extrahiert15. Nach einer kurzen Inkubation von Histon Pre-mRNA enthalten Biotin und der Foto-spaltbaren Linker mit einem nuklearen Extrakt die versammelten Verarbeitung komplexe auf Streptavidin Perlen immobilisiert, gründlich gewaschen und sanft in eine Native Lösung veröffentlicht Form durch die Einwirkung von ~ 360 nm UV-Licht. Die UV-Elution Methode ist sehr effizient, schnell und unkompliziert, mit ausreichenden Mengen an der U7-SnRNP, seine Komponenten durch Splitter von weniger als 100 µL der Extrakt15Färbung zu visualisieren. Das UV-eluiert Material ist frei von Hintergrund-Proteine und für direkte Massenspektrometrie Analyse, zusätzliche Reinigungsschritte und enzymatische Assays geeignet. Die gleiche Methode kann zur Reinigung von anderen RNA/Proteinkomplexe angenommen werden, die relativ kurze RNA-Bindungsstellen erfordern. Biotin und der Foto-spaltbaren Linker können auch kovalent, Einzel - und doppelsträngige DNA, potenziell Verlängerung der UV-Elution Methode zur Reinigung von verschiedenen DNA/Protein-komplexe befestigt werden.
Chemische Synthese von RNA-Substrate mit kovalent angebracht Biotin und der Foto-spaltbaren Linker ist praktisch nur mit den Sequenzen, die nicht mehr als ~ 65 Nukleotide, teuer und ineffizient für deutlich längere Sequenzen. Um dieses Problem zu beheben, entwickelten wir auch einen alternativen Ansatz, der für viel länger RNA-bindende Ziele geeignet ist. Bei diesem Ansatz RNA von beliebiger Länge und Nukleotid-Reihenfolge ist generierten in Vitro durch T7 oder SP6 Transkription und geglüht, eine kurze ergänzende Oligonukleotid enthält Biotin und der Foto-spaltbaren Linker am 5'-Ende (trans (Konfiguration). Resultierende Duplex wird anschließend verwendet, um einzelne bindende Proteine oder makromolekulare komplexe auf Streptavidin-Perlen, die nach dem gleichen Protokoll beschrieben für die RNA-Substrate mit Foto-spaltbaren Biotin kovalent verbunden zu reinigen (GUS Konfiguration). Mit dieser Änderung kann die Foto-spaltbaren Biotin in Verbindung mit in Vitro generierten Protokolle mit Hunderten von Nukleotiden, Erweiterung der UV-Elution Methode zur Reinigung von einer breiten Palette RNS/Protein verwendet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

Seit vielen Jahren ist die außergewöhnlich starke und rasch gebildete Interaktion zwischen Biotin und Streptavidin erfolgreich für die partielle Reinigung der biologisch wichtigen RNA/Proteinkomplexe verwendet worden. Diese Strategie leidet jedoch einen großen Nachteil, die die breitere Nutzung begrenzt: die Biotin/Streptavidin-Interaktion kann gebrochen werden, nur unter denaturierenden Bedingungen, die die Integrität der eluierten komplexe, so dass auch stören ihre anschließenden Funktionsanalyse und/oder weitere Reinigung durch andere Methoden. Darüber hinaus sind die eluierten Proben häufig mit Hintergrund-Proteine verunreinigt, die nonspecifically mit Streptavidin-Perlen, erschwert die Analyse der gereinigten komplexe durch silberne Färbung und Massenspektrometrie zuordnen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir eine Variante der Biotin/Streptavidin-Strategie in dem Biotin ist eine RNA-Substrat über einen Foto-spaltbaren Linker angebracht und die komplexe an Streptavidin Perlen immobilisiert sind selektiv eluiert Lösung in einer nativen Form durch langwellige UV, so dass die Hintergrund-Proteine auf die Perlen. Kürzere RNA bindenden Substraten können chemisch mit Biotin und der Foto-spaltbaren Linker kovalent an das 5'-Ende der RNA angeschlossen synthetisiert werden, während längeren RNA Substrate mit den beiden Gruppen von komplementären Oligonukleotids bereitgestellt werden können. Diese beiden Varianten der UV-Elution Methode zur Reinigung der U7 SnRNP-abhängige Verarbeitung komplexe, die Histone Pre-mRNAs am 3'-Ende cleave getestet wurden und beide bewiesen, günstig im Vergleich zu anderen zuvor Reinigungsverfahren entwickelt. Die UV-eluiert Proben enthalten leicht nachweisbare Mengen an der U7-SnRNP, die frei von großen Protein Verunreinigungen und geeignet für die direkte Analyse von Massenspektrometrie und funktionelle Assays wurde. Das beschriebene Verfahren kann leicht für die Reinigung der andere RNA-bindende komplexe angepasst und verwendet in Verbindung mit Einzel- und Doppelstrang-DNA-Bindungsstellen zur Reinigung von DNA-spezifische Proteine und makromolekulare komplexe.

Die UV-Elution Methode wurde getestet mit zwei chemisch synthetisierte RNA-Substraten kovalent befestigt am 5'-Ende der Platine glyko-(Cis -Konfiguration): pcB-SL (Abbildung 1) und pcB-dH3/5 m RNAs (Abbildung 2). 31-Nukleotid-pcB-SL-RNA enthält eine Haarnadelstruktur, gefolgt von einen 5-Nukleotid einzelne gestrandeten Schweif und seiner Sequenz ist identisch mit dem 3' Ende der Reife Histon mRNA (i.e., nach de...

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Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

RNA/Proteinkomplexe gereinigt mit Botin Streptavidin-Strategie sind Lösung unter denaturierenden Bedingungen in einer Form ungeeignet für die weitere Reinigung und Funktionsanalyse eluiert. Hier beschreiben wir eine Änderung dieser Strategie, die einen Foto-spaltbaren Linker in RNA und einem sanften UV-Elution Schritt nachgeben native und voll funktionsfähige RNA/Proteinkomplexe nutzt.

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Diese Methode sollte für Forscher interessant sein, die versuchen, RNA-Proteinkomplexe zu isolieren und ihre Zusammensetzung durch Massenspektrometrie zu identifizieren. Wir glauben, dass unser Protokoll besonders nützlich sein wird, um Komplexe zu reinigen, die in Zellen in begrenzten Mengen existieren und dazu neigen, sich während langer mehrstufiger Reinigungsverfahren zu dissoziieren. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass sie nur einen einzigen Reinigungsschritt umfasst und mit RNA-Bindungsstellen beliebiger Länge und Sequenz verwendet werden könnte.Einige der Schritte werden Xiao-cui Yang demonstrieren, der ein leitender Forschungstechniker in unserer Gruppe ist. Für Bindungsstellen, die deutlich länger als 65 Nukleotide sind, erhalten Sie T7-generierte RNA und ein Adapter-PCB-Oligonukleotid, wie im Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie 20 Picomole der RNA mit 100 Picomolen des Adapters Oligonukleotid in einer 1,5 Milliliter Tube mit 100 Mikroliter Bindungspuffer.Legen Sie das Rohr in kochendes Wasser und lassen Sie es für 5 Minuten inkubieren. Dann lassen Sie das Wasser auf Raumtemperatur abkühlen. Erste Ergänzung 1 Milliliter Maus Kernextrakt mit 80 Millimolar EDTA bei pH 8 zu einer Endkonzentration von 10 Millimolar.Fügen Sie dann zwischen 5 und 10 Picomole des RNA-Substrats hinzu, das mit dem PCB-Moiety markiert wurde. Auf Eis für 5 Minuten inkubieren, um die Probe gelegentlich zu mischen. Als nächstes verwenden Sie eine vorgekühlte Mikrozentrifuge bei 4 Grad Celsius, um die Mischung bei 10.000 mal g für 10 Minuten zentrifugieren, um mögliche Ausscheidungen zu entfernen.Sammeln Sie den Überstand vorsichtig in eine neue Röhre auf Eis, während Sie darauf achten, das Pellet nicht zu übertragen. Übertragen Sie ca. 100 Mikroliter Streptavidin Agarose Perlensuspension in ein 1,5 Milliliter Rohr. Fügen Sie etwa 1 Milliliter Bindungspuffer hinzu, um mit dem Waschen der Perlen zu beginnen.Zentrifugieren Sie das Rohr 25 mal g für 2 bis 3 Minuten und aspirieren Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Wasch- und Zentrifugationsprozess 2 bis 3 Mal, um die Perlen mit dem Bindungspuffer zu ausdemieren. Laden Sie den zuvor gesammelten Überstand, der den zusammengebauten Komplex über die ausgegleichgewichteten Perlen enthält.Drehen Sie das Rohr mit einem Rohrrotator 1 Stunde bei 4 Grad Celsius, um die RNA und gebundene Komplexe auf die Perlen zu immobilisieren. Als nächstes drehen Sie das Rohr bei 25 mal g für 2 bis 3 Minuten, um die Perlen an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Aspirieren Sie den Überstand.Und spülen Sie die Perlen zweimal mit Bindungspuffer, mit dem zuvor beschriebenen Waschprozess. Nach dem Entfernen des Überstandes der zweiten Wäsche 1 Milliliter Bindungspuffer hinzufügen und die Probe 1 Stunde bei 4 Grad Celsius drehen. Drehen Sie die Probe 25 mal g für 2 bis 3 Minuten herunter.Als nächstes 1 Milliliter Bindungspuffer hinzufügen und die Suspension in ein neues Rohr übertragen. Drehen Sie die Probe bei 4 Grad Celsius für bis zu 1 Stunde. Zentrifugieren Sie die immobilisierten Komplexe 25 Mal g für 2 bis 3 Minuten.Dann aspirieren Überstand, und fügen Sie 200 Mikroliter Bindungspuffer. Übertragen Sie die Perlen in ein 500-Mikroliter-Rohr. Schalten Sie eine hochintensive UV-Lampe ein, die UV-Licht mit 365 Nanometern aussendet und sie die volle Brillanz erreichen lässt.Füllen Sie den Boden einer Petrischale mit dicht gepacktem Eis, das sie über den Deckel der Schale stapelt. Kurz wirbeln die Röhre mit den immobilisierten Komplexen. Legen Sie es dann horizontal auf das Eis und bedecken Sie es mit der vorgewärmten Lampe, um sicherzustellen, dass die Probe 2 bis 3 Zentimeter von der Oberfläche der Glühbirne entfernt ist.Bestrahlen Sie die Probe für insgesamt 30 Minuten, während häufig invertieren und Wirbel nustieren das Rohr, um eine gleichmäßige Exposition zu gewährleisten und eine Überhitzung zu verhindern. Danach drehen Sie die Perlen bei 25 mal g für 2 bis 3 Minuten und sammeln Sie den Überstand. Zentrifugieren Sie diesen Überstand noch einmal unter den gleichen Bedingungen.Sammeln Sie den resultierenden Überstand und stellen Sie sicher, dass Eine kleine Menge an der Unterseite des Rohres zu verlassen, um zu vermeiden, dass restliche Perlen übertragen. Mit SDS-PAGE Elektrophorese trennen Sie einen Bruchteil des UV-eluierten Überstandes und den entsprechenden Anteil vom Material, das nach uv-elution auf den Perlen verbleibt. Als nächstes verwenden Sie ein handelsübliches Silber Färbeset, um das Gel zu färben.Bewerten Sie die Effizienz der UV-Elution, indem Sie die Intensitäten der Proteine im UV-eluierten Überstand mit denen vergleichen, die nach der UV-Bestrahlung auf den Perlen verbleiben. Verbrauchen Sie die Proteinbänder von Interesse und bestimmen Sie ihre Identität durch Massenspektrometrie. Danach analysieren Sie direkt einen Bruchteil des UV-eluierten Überstandes durch Massenspektrometrie, um das gesamte Proteom des gereinigten Materials unvoreingenommen zu bestimmen.In dieser Studie wird Stammschleifen-RNA mit photoscleavablem Biotin mit 1 Milliliter eines zytoplasmatischen S100-Extrakts aus Myelomzellen von Mäusen inkubiert. Und die Wirkung und Effizienz der UV-Elution wird durch Silberfärbung analysiert. Eine Reihe von Proteinen werden auf den Streptavidin-Perlen vor der UV-Elution nachgewiesen.Die Bestrahlung mit langwelliger UV-Strahlung gibt nur einige dieser Proteine in den Überstand frei und hinterlässt einen unspezifischen Hintergrund auf den Perlen. Dies unterstreicht die Bedeutung des UV-Elutionsschritts. Die Massenspektrometrie identifiziert die wichtigsten UV-eluierten Proteine als 3'hExo und SLBP, wobei SLBP sowohl durch das Vollwertprotein als auch durch eine Reihe von kürzeren Abbauprodukten repräsentiert wird.Kleinere Mengen anderer Proteine, die als verschiedene RNA-bindende Proteine identifiziert wurden, werden durch die UV-Bestrahlung auch selektiv in lösungsweise freigesetzt. Die UV-Elution von immobilisiertem Drosophila-Histon-Prämnonmiten-Pre-mRNA, getaggt mit photo-cleavablem Biotin, das mit einem Kernextrakt inkubiert wurde, führte zu einer selektiven Freisetzung von nur einer kleinen Anzahl von Proteinen in den Überstand mit einem intensiven Hintergrund von unspezifischen Proteinen, die auf den Perlen verbleiben. Die Massenspektrometrie identifiziert diese Proteine als Bestandteile des U7 snRNP.Sie werden nicht in Gegenwart von Verarbeitungskonkurrenten nachgewiesen, die die Bindung von U7 snRNP an Histone pre-mRNA blockieren. Es ist wichtig, hochintensive UV-Lampe zu verwenden und sie in einem engen Abstand zur bestrahlten Probe zu platzieren, während sie gleichzeitig darauf achtet, dass sie nicht überhitzt. Die UV-Elutionsmethode liefert native RNA-Proteinkomplexe, denen größere Verunreinigungen fehlen und die sich direkt für zusätzliche Reinigungsschritte und funktionelle Assays eignen.Vermeiden Sie Augen- und Hautexposition während der UV-Bestrahlung.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Forschung

Biochemie

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...