Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

אנו מודים העמיתים שלנו, משתפי פעולה על תרומתם לעבודה שלנו. מחקר זה נתמך על ידי NIH להעניק GM 29832.

1. הכנת הרקע
הערה: מצעים RNA קצרים יותר מאשר נוקלאוטידים ~ 65 יכול להיות מסונתז כימית עם ביוטין (B) והמקשר צילום-cleavable (pc) (המכונה יחד ביוטין צילום-cleavable או pcB) covalently המצורפת לקצה RNA 5' (תצורתציס ). מצעים RNA המכיל אתרי קישור באופן משמעותי יותר צריך להיות שנוצר במבחנה על ידי שעתו?...

<ol>
	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

השיטה המתוארת כאן היא פשוטה וחוץ שילוב מקשר צילום-cleavable, השלב • UV-תנאי אינו נבדל מן השיטות הנפוצות לנצל מאוד חזקה האינטראקציה בין ביוטין streptavidin. הצעד • UV-תנאי יעילה מאוד, בדרך כלל שחרור יותר מ-75 אחוזים הרנ א קיבוע ומקושרת מהחלבונים streptavidin חרוזים, כשמאחוריו רקע גבוה של חלבונים הלא ספציפית לא...

ב פרוקריוטים, מבשרי RNA פולימראז II-שנוצרו mRNA (pre-mRNAs) עוברים מספר אירועים ההבשלה בגרעין לפני שהפך תקינים mRNA תבניות עבור סינתזת החלבון בציטופלסמה. אחד האירועים הללו הוא עיבוד קצה 3'. עבור הרוב המכריע של טרום-mRNAs, עיבוד קצה 3' כרוך המחשוף מצמידים פוליאדנילציה. תגובה דו-שלבית זה מזורז על ידי קומפלקס יחסית שופע בהיקף של יותר מ-15 חלבונים1. בעלי חיים תלויי-שכפול היסטון pre-mRNAs מעבד בקצה 3' מנגנון שונה שבו הוא שיחק תפקיד מפתח על ידי U7 snRNP, שפע נמוך מורכבים בהיקף של snRNA U7 של נוקלאוטידים ~ 60 וחלבונים מספר2,3 . U7 snRNA בסיסי זוגות עם רצף מסוים היסטון pre-mRNA, לאחד subunits של snRNP U7 מזרז את התגובה המחשוף, יצירת היסטון בוגרת mRNA ללא poly(A) זנב. 3' עיבוד קצה של היסטון pre-mRNA דורש גם גזע לופ מחייב חלבון (SLBP), אשר נקשר שנשמרת גזע-לולאה ממוקם במעלה הזרם של אתר המחשוף ומגבירה את גיוס snRNP U7 המצע2,3. מחקרים שמטרתם זיהוי רכיבים בודדים של snRNP U7 היה מאתגר בשל ריכוז נמוך snRNP U7 בתאים בעלי חיים ואת הנטייה של המתחם מביצועם או עוברים proteolysis חלקית במהלך טיהור כתוצאה מהשימוש דטרגנטים קלים-4,-5,-6, שוטף מלח גבוהה ו/או מספר צעדים כרומטוגרפי7,8,9.
לאחרונה, כדי לקבוע את ההרכב של מכונות עיבוד U7 תלוית, נדגרה קטע קצר של ביוטין המכילים pre-mRNA היסטון 3' או 5' עם תמצית גרעיני, מתחמי שהורכב נתפסו על מצופים streptavidin agarose חרוזים5,6,10. בעקבות האינטראקציה בין ביוטין streptavidin חזק במיוחד, חלבונים ותשמרו על חרוזים streptavidin היו eluted תחת denaturing תנאים על ידי הרתחה ב מרחביות, נותחו על ידי צביעת כסף, ספקטרומטר מסה. בעת גישה פשוטה זו זוהו מספר מרכיבי snRNP U7, זה הניב דגימות גסה יחסית, לעיתים קרובות מזוהם עם מספר רב של חלבונים רקע מאוגדים nonspecifically streptavidin חרוזים, שעשוי להיות מיסוך רכיבים מסוימים של את מכונות עיבוד ומניעת אצלם הזיהוי על כסף מוכתם ג'לים5,6,10. חשוב, גישה זו גם מנעה כל מחקרים תפקודית ועם החומר המבודד שלו טיהור נוספת כדי הומוגניות על ידי שיטות נוספות.
הוצעו מספר שינויים לאורך זמן לפנות את אופי האינטראקציה ביוטין/streptavidin, עם רובם תוכננה גם להחליש את האינטראקציה או לספק זרוע מרווח מבחינה כימית cleavable ב כמעט בלתי הפיך ביוטין המכילות ריאגנטים11,12. החיסרון של כל השינויים האלה היה כי הם להפחית באופן משמעותי את יעילות השיטה ו/או נדרש לעיתים קרובות תנאים שאינם-פיזיולוגיים במהלך השלב • תנאי, לסכן את תקינות או פעילות של החלבונים מטוהרים.
כאן, אנו מתארים גישה שונה כדי לפתור את הבעיה הטבועה של האסטרטגיה ביוטין/streptavidin באמצעות ה-RNA סובסטרטים שבו ביוטין covalently מחובר 5' סוף דרך 1 צילום-cleavable-(2-nitrophenyl) moiety אתיל זה רגיש זמן לנופף UV13,14. בדקנו גישה זו לטיהור של מכונות עיבוד U7 תלוית המגביל מ דרוזופילה ותמצית מידע יונקים גרעיני15. בעקבות של דגירה קצרה של ה-pre-mRNA היסטון ביוטין המכיל את מקשר צילום-cleavable עם תמצית גרעיני, מתחמי עיבוד שהורכב ותשמרו על streptavidin חרוזים, ביסודיות שטופים בעדינות פרסמה פתרון ביליד טופס על-ידי חשיפה לאור nm UV ~ 360. השיטה • UV-תנאי היא מאוד יעילה, מהירה וישירה, מניב כמויות מספיקות של snRNP U7 להמחיש מרכיביו מאת נכספת מכתים מ קטנה כמו 100 µL של תמצית15. החומר UV-eluted היא חינם של חלבונים רקע מתאים ניתוח ישירה ספקטרומטר מסה, צעדים נוספים טיהור מבחני אנזימטיות. יכול להיות מאומץ באותה השיטה לטיהור של אחרים מתחמי RNA/חלבון שדורשים אתרי קישור RNA קצר יחסית. ביוטין והמקשר צילום-cleavable יכול גם להיות covalently מצורף אל יחיד, כפול-גדילי ה-DNA, פוטנציאל הרחבת בשיטת UV-• תנאי לטיהור של מתחמי DNA/חלבונים שונים.
סינתזה של סובסטרטים RNA המכיל covalently מצורף ביוטין, מקשר צילום-cleavable היא מעשית רק עם הרצפים עולה על ~ 65 נוקלאוטידים, נהיה יקר ולא יעיל עבור רצפי באופן משמעותי יותר. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו גם גישה חלופית מתאימה יותר מטרות איגוד ה-RNA. בגישה זו, ה-RNA של כל רצף נוקלאוטיד לאורכה שנוצר במבחנה על ידי שעתוק T7 או SP6 ואת annealed כדי oligonucleotide משלימה קצרה שמכיל ביוטין והמקשר צילום-cleavable בקצה 5' (טרנס תצורה). דופלקס תוצאות משתמשים לאחר מכן לטהר את הפרט מחייב חלבונים או קומפלקסים macromolecular על חרוזים streptavidin בעקבות באותו פרוטוקול המתואר לשם סובסטרטים RNA שמכיל ביוטין cleavable-צילום מצורף covalently (חבר העמים תצורה). עם השינוי הזה, ביוטין צילום-cleavable ניתן להשתמש בשילוב עם במבחנה שנוצר תעתיקים המכיל מאות נוקלאוטידים, הרחבת בשיטת UV-• תנאי לטיהור של רחב טווח של RNA/חלבון.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

במשך שנים רבות, חזק במיוחד, במהירות בנוי האינטראקציה בין ביוטין streptavidin יש כבר בהצלחה מנוצל לשם טיהור חלקי של מתחמי RNA/חלבון חשוב מבחינה ביולוגית. עם זאת, אסטרטגיה זו סובלת חיסרון מרכזי אחד המגביל את ניצול רחב יותר: האינטראקציה של ביוטין/streptavidin יכול להיות שבור רק תחת תנאים גם לשבש את תקינות מתחמי eluted, ומכאן מסלק denaturing שלהם אנליזה פונקציונלית עוקבות ו/או נוספות טיהור באמצעות שיטות אחרות. בנוסף, הדגימות eluted נגועים תכופות עם החלבונים רקע המשייכים nonspecifically streptavidin חרוזים, שמסבך הניתוח של מתחמי מטוהרת על ידי צביעת כסף ספקטרומטר מסה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו משתנה של האסטרטגיה ביוטין/streptavidin בו ביוטין מצורף של המצע RNA באמצעות מקשר צילום-cleavable, מתחמי ותשמרו על חרוזים streptavidin הם eluted באופן סלקטיבי על פתרון טופס מקורי על-ידי גלי ארוך UV, עוזב את החלבונים רקע על החרוזים. סובסטרטים איגוד ה-RNA קצר יותר יכול להיות מסונתז כימית עם ביוטין והמקשר צילום-cleavable covalently מצורף לסוף 5' RNA, ואילו עוד מצעים RNA יכול להתבצע עם שתי הקבוצות באמצעות oligonucleotide משלימים. אלה שתי גרסאות של השיטה • UV-תנאי נבדקו עבור טיהור של מתחמי עיבוד snRNP תלוית U7 זה קליב היסטון pre-mRNAs בקצה 3' והוכיח שניהם להשוות לשני בחיוב בעבר פיתחו שיטות טיהור. הדגימות UV eluted הכיל כמויות לזיהוי בקלות snRNP U7 שהיה ללא מזהמים חלבון גדול ומתאים לניתוח ישיר באמצעות ספקטרומטר מסה מבחני פונקציונלי. השיטה המתוארת ניתן להיות ברצון הותאם עבור טיהור של מתחמי מחייב אחרים RNA, הפועל בשיתוף עם אתרי קישור יחיד, כפול-גדילי DNA לטהר חלבונים ספציפיים הדנ א ואת מתחמי macromolecular.

השיטה • UV-תנאי נבדקה יחד עם שני מצעים RNA מסונתז כימית covalently מצורף בקצה 5' pcB moiety (תצורתציס ): pcB-SL (איור 1) ו- pcB-dH3/5 מ' RNAs (איור 2). 31-נוקלאוטיד pcB-SL RNA מכיל מבנה גזע לופ ואחריו זנב תקועים 5-נוקלאוטיד יחיד והוא רצף שלו זהה 3' סוף היסטון בוגרת mRNA (כ?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

מתחמי RNA/חלבון מטוהרים באמצעות אסטרטגיה botin-streptavidin הם eluted פתרון תחת תנאים denaturing בטופס אינו מתאים עוד טיהור, אנליזה פונקציונלית. כאן, אנו מתארים שינוי של אסטרטגיה זו אשר מנצל מקשר צילום-cleavable RNA, צעד • UV-תנאי עדין, מניב את מתחמי ה-RNA/חלבון המקורי והמלא.

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

שיטה זו צריכה לעניין חוקרים המנסים לבודד קומפלקסים של חלבוני RNA ולזהות את הרכבם על ידי ספקטרומטריית מסה. אנו מאמינים שהפרוטוקול שלנו יהיה שימושי במיוחד לטיהור קומפלקסים הקיימים בתאים בכמויות מוגבלות ונוטים להתנתק במהלך הליכי טיהור רב שלובים ארוכים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא כרוכה רק בשלב טיהור אחד ו ניתן להשתמש בה עם אתרי איגוד RNA בכל אורך ורצף.הדגמת חלק מהצעדים תהיה שיאו-קוי יאנג, שהיא טכנאית מחקר בכירה בקבוצה שלנו. עבור אתרי איגוד ארוכים משמעותית מ- 65 נוקלאוטידים, השג את ה- RNA שנוצר T7 ואת אוליגונוקלאוטיד PCB מתאם כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מערבבים 20 picomoles של RNA עם 100 picomoles של אוליגונוקלאוטיד מתאם בצינור 1.5 מיליליטר המכיל 100 microliters של חיץ מחייב.מניחים את הצינור במים רותחים ולתת לו דגירה במשך 5 דקות. ואז לאפשר למים להתקרר לטמפרטורת החדר. תוספת ראשונה 1 מיליליטר של תמצית גרעינית העכבר עם 80 מילימולר EDTA ב pH 8 לריכוז הסופי של 10 מילימולר.לאחר מכן להוסיף בין 5 ל 10 picomoles של מצע RNA כי כבר מתויג עם מויטי PCB. דגירה על קרח במשך 5 דקות, הקפדה מדי פעם לערבב את המדגם. לאחר מכן השתמש microcentrifuge מקורר מראש ב 4 מעלות צלזיוס כדי צנטריפוגה את התערובת ב 10, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות כדי להסיר את כל המשקעים הפוטנציאליים.בזהירות לאסוף את supernatant לתוך צינור חדש על הקרח, תוך הקפדה על הימנעות העברת גלולה. להעביר כ 100 microliters של השעיית חרוזים agarose סטרפטבידין לצינור 1.5 מיליליטר. הוסף כ 1 מיליליטר של חיץ מחייב כדי להתחיל לשטוף את חרוזים.צנטריפוגה הצינור ב 25 פעמים g במשך 2 עד 3 דקות ושואפים את supernatant. חזור על תהליך כביסה וצנטריפוגה זה 2 עד 3 פעמים כדי לצייד את חרוזים עם מאגר הכריכה. טען את העל-טבעי שנאסף בעבר, המכיל את המתחם המורכב מעל חרוזים שצוידים.באמצעות מסובב צינור, לסובב את הצינור במשך 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס כדי לשתק את RNA ומתחמים כבולים על חרוזים. הבא לסובב את הצינור ב 25 פעמים g במשך 2 עד 3 דקות כדי לאסוף את חרוזים בתחתית הצינור. שאף את העל-טבעי.ולשטוף את חרוזים פעמיים עם חיץ מחייב, באמצעות תהליך הכביסה שתואר קודם לכן. לאחר הסרת supernatant של לשטוף השני, להוסיף 1 מיליליטר של חיץ מחייב לסובב את המדגם במשך 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס. לסובב את המדגם ב 25 פעמים g במשך 2 עד 3 דקות.הבא להוסיף 1 מיליליטר של חיץ מחייב ולהעביר את ההשעיה לצינור חדש. סובבו את הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס עד שעה. צנטריפוגה המתחמים משותקים ב 25 פעמים g במשך 2 עד 3 דקות.לאחר מכן שאפו על-טבעי, והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מאגר מחייב. מעבירים את חרוזים לצינור 500 microliter. הפעל מנורת UV בעוצמה גבוהה הפולגת אור UV ב-365 ננומטר ומאפשרת לו להגיע לגאונות מלאה.ממלאים את החלק התחתון של צלחת פטרי עם קרח ארוז היטב לערום אותו על המכסה של המנה. בקצרה מערבולת הצינור המכיל את מתחמים משותקים. לאחר מכן מניחים אותו אופקית על הקרח ומכסים אותו עם המנורה מחוממת מראש, לוודא כי המדגם הוא 2 עד 3 ס"מ מפני השטח של הנורה.הקרין את המדגם במשך 30 דקות בסך הכל תוך היפוך ומערבולת לעתים קרובות של הצינור כדי להבטיח חשיפה אחידה ולמנוע התחממות יתר. לאחר מכן, לסובב את חרוזים ב 25 פעמים g במשך 2 עד 3 דקות ולאסוף את העל טבעי. צנטריפוגה זה על טבעי שוב באמצעות אותם תנאים.לאסוף את supernatant וכתוצאה מכך הקפד להשאיר כמות קטנה בתחתית הצינור, כדי למנוע העברת כל חרוזים שיורית. באמצעות אלקטרופורזה SDS-PAGE, להפריד שבריר של על טבעי UV eluted ואת השבר המתאים מהחומר שנותר על חרוזים לאחר אלוטיון UV. לאחר מכן השתמש בערכת כתמי כסף זמינה מסחרית כדי להכתים את הג'ל.להעריך את היעילות של אלוטיון UV על ידי השוואת התעצמות של החלבונים הקיימים UV אלנטנט ואלו שנותרו על חרוזים לאחר הקרנת UV. יש למלמל את רצועות החלבון המעוניינות ולקבוע את זהותן לפי ספקטרומטריית מסה. לאחר מכן, לנתח ישירות שבריר של UV מרומם על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לקבוע את הפרוטומה כולה של החומר המטוהר באופן משוחד.במחקר זה, לולאת גזע RNA מתויג עם ביוטין photo-cleavable הוא דגירה עם 1 מיליליטר של תמצית S100 ציטופלסמי המתקבל תאים מיאלומה עכברים. ואת ההשפעה והיעילות של אלוטיון UV מנותח על ידי כתמי כסף. מספר חלבונים מזוהים על חרוזי סטרפטבידין לפני אלוטיון UV.הקרנה עם UV גל ארוך משחרר רק חלק חלבונים אלה לתוך על טבעי משאיר רקע לא ספציפי על חרוזים. זה מדגיש את החשיבות של צעד אלוטיון UV. ספקטרומטריית מסה מזהה את החלבונים הגדולים UV eluted כמו 3'hExo ו SLBP עם SLBP להיות מיוצג על ידי חלבון באורך מלא ומספר מוצרים השפלה קצר יותר.כמויות קטנות יותר של חלבונים אחרים שזוהו כחלבונים קשירה RNA שונים גם שוחרר באופן סלקטיבי לפתרון על ידי הקרנת UV. אלוטציה UV של דרוסופילה משותקת היסטון טרום mRNA מתויג עם ביוטין photo-cleavable דגירה עם תמצית גרעינית הביא לשחרור סלקטיבי של רק מספר קטן של חלבונים לתוך supernatant עם רקע אינטנסיבי של חלבונים לא ספציפיים שנותרו על החרוזים. ספקטרומטריית מסה מזהה חלבונים אלה להיות רכיבים של U7 snRNP.הם אינם מזוהים בנוכחות מתחרים עיבוד לחסום איגוד של U7 snRNP כדי histone pre-mRNA. חשוב להשתמש במנורת UV בעוצמה גבוהה ולמקום אותה במרחק קרוב לדגימה מוקרנת וגם לוודא שהיא לא התחממות יתר. שיטת אלוטיון UV מניבה קומפלקסים מקוריים של חלבוני RNA חסרי מזהמים עיקריים ומתאימים ישירות לצעדי טיהור נוספים ולתהלומות תפקודיות.יש להימנע מחשיפה לעיניים ולעור במהלך הקרנת UV.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

ג &#39;ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ&quot;א קומפלקסים

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...