Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
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हम अपने काम के लिए उनके योगदान के लिए हमारे सहकर्मियों और सहयोगियों को धंयवाद । इस अध्ययन NIH अनुदान जीएम २९८३२ द्वारा समर्थित किया गया था ।

1. सब्सट्रेट तैयारी
नोट: आरएनए सब्सट्रेट से कम ~ ६५ न्यूक्लियोटाइड बायोटिन के साथ रासायनिक संश्लेषित किया जा सकता (ख) और फोटो-सट (पीसी) linker (एक साथ फोटो-सट बायोटिन या पीसीबी के रूप में संदर्भित) covalently...

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	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

यहां वर्णित विधि सीधी है और इसके अलावा एक फोटो-सट linker और यूवी-रेफरेंस स्टेप में आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तरीकों से अलग नहीं होती है जो बायोटिन और streptavidin के बीच बेहद मजबूत बातचीत का लाभ उठाते हैं । यूव...

eukaryotes में, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय जनित mRNA पुरोगामी (pre-mRNAs) mRNA में प्रोटीन संश्लेषण के लिए पूरी तरह कार्यात्मक कोशिका द्रव्य टेम्पलेट्स बनने से पहले नाभिक में कई परिपक्वता घटनाओं से गुजरना । इन घटनाओं में से एक 3 ' अंत प्रसंस्करण है । पूर्व mRNAs, 3 ' अंत प्रसंस्करण के विशाल बहुमत के लिए polyadenylation के साथ मिलकर दरार शामिल है । यह दो कदम प्रतिक्रिया एक अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में 15 से अधिक प्रोटीन1से मिलकर जटिल द्वारा catalyzed है । पशु प्रतिकृति-निर्भर हिस्टोन पूर्व mRNAs एक अलग तंत्र जिसमें महत्वपूर्ण भूमिका U7 snRNP, एक कम बहुतायत के U7 snRNA से मिलकर जटिल द्वारा खेला जाता है द्वारा 3 ' अंत में संसाधित कर रहे है ~ ६० न्यूक्लियोटाइड और एकाधिक प्रोटीन2,3 . हिस्टोन प्री-mRNA में एक विशिष्ट अनुक्रम के साथ U7 snRNA आधार जोड़े और U7 snRNP catalyzes की उपइकाईयों में से एक, एक पाली (एक) पूंछ के बिना परिपक्व हिस्टोन mRNA पैदा करने वाली । 3 ' हिस्टोन पूर्व mRNA के अंत प्रसंस्करण भी स्टेम लूप बाध्यकारी प्रोटीन की आवश्यकता है (SLBP), जो एक संरक्षित स्टेम-पाश बांध दरार साइट के ऊपर स्थित है और सब्सट्रेट2,3करने के लिए U7 snRNP की भर्ती को बढ़ाता है । U7 snRNP के व्यक्तिगत घटकों की पहचान करने के उद्देश्य से अध्ययन पशु कोशिकाओं में U7 snRNP की कम एकाग्रता और अलग कर देना करने के लिए जटिल की प्रवृत्ति के कारण चुनौतीपूर्ण हो गया है या उपयोग करने का एक परिणाम के रूप में शुद्धि के दौरान आंशिक प्रोटियोलिसिस से गुजरना हल्के डिटर्जेंट4,5,6, उच्च नमक बहाकर और/या एकाधिक क्रोमेटोग्राफिक कदम7,8,9।
हाल ही में, U7-निर्भर प्रसंस्करण मशीनरी, हिस्टोन पूर्व की एक छोटी टुकड़ा या तो 3 ' या 5 ' पर बायोटिन युक्त mRNA की संरचना का निर्धारण करने के लिए एक परमाणु निकालने के साथ मशीन था और इकट्ठे परिसरों streptavidin पर कब्जा कर लिया गया लेपित agarose मोती५,६,१०. बायोटिन और streptavidin के बीच असाधारण मजबूत बातचीत के कारण, प्रोटीन streptavidin मोतियों पर मैटीरियल एसडीएस में उबलते द्वारा denaturing शर्तों के तहत eluted और चांदी धुंधला और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया । हालांकि इस सरल दृष्टिकोण U7 snRNP के घटकों के एक नंबर की पहचान की, यह अपेक्षाकृत कच्चे तेल के नमूनों की उपज, अक्सर पृष्ठभूमि प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के साथ दूषित विशेष रूप से streptavidin मोती के लिए बाध्य, संभवतः के कुछ घटकों मास्किंग प्रसंस्करण मशीनरी और चांदी सना हुआ जैल5,6,10पर उनके पता लगाने को रोकने के । महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण भी अलग सामग्री और इसके अतिरिक्त तरीकों से एकरूपता के लिए इसके आगे शुद्धि के साथ किसी भी कार्यात्मक अध्ययन precluded ।
संशोधनों के एक नंबर समय पर प्रस्तावित करने के लिए बायोटिन की वस्तुतः अपरिवर्तनीय प्रकृति का पता/streptavidin बातचीत कर रहे थे, उनमें से ज्यादातर के साथ या तो बातचीत को कमजोर करने के लिए या में एक रासायनिक वि हाथ प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया जा रहा बायोटिन युक्त रिएजेंट11,12. इन सभी संशोधनों के नकारात्मक पक्ष यह था कि वे काफी विधि की क्षमता को कम करने और/या अक्सर रेफरेंस कदम के दौरान गैर शारीरिक स्थितियों की आवश्यकता है, या तो अखंडता या शुद्ध प्रोटीन की गतिविधि को ख़तरे में डालना ।
यहां, हम एक अलग दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए बायोटिन की अंतर्निहित समस्या को हल करने के लिए streptavidin रणनीति आरएनए सब्सट्रेट जिसमें बायोटिन एक फोटो के माध्यम से 5 ' अंत करने के लिए संलग्न covalently है-सट 1-(2-nitrophenyl) एथिल moiety है कि लंबी लहर यूवी13,14के प्रति संवेदनशील । हम Drosophila और स्तनधारी परमाणु अर्क15से सीमित U7-निर्भर प्रसंस्करण मशीनरी की शुद्धि के लिए इस दृष्टिकोण का परीक्षण किया । हिस्टोन पूर्व की एक छोटी सी मशीन के बाद बायोटिन युक्त mRNA और फोटो-एक परमाणु उद्धरण के साथ सट linker, इकट्ठे प्रसंस्करण परिसरों streptavidin मोतियों पर स्थिर हैं, अच्छी तरह से धोया और धीरे से एक देशी में समाधान के लिए जारी ~ ३६० एनएम यूवी लाइट करने के लिए जोखिम से फार्म । यूवी-रेफरेंस विधि बहुत ही कुशल, तेज और सीधी, U7 snRNP की पर्याप्त मात्रा में उपज के रूप में कम से धुंधला अभिजात्य द्वारा अपने घटकों की कल्पना करने के लिए १०० µ एल निकालने के15। यूवी eluted सामग्री पृष्ठभूमि प्रोटीन और प्रत्यक्ष जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण, अतिरिक्त शुद्धि कदम और एंजाइमी परख के लिए उपयुक्त से मुक्त है । एक ही विधि अंय आरएनए/प्रोटीन परिसरों कि अपेक्षाकृत कम आरएनए बाइंडिंग साइटों की आवश्यकता की शुद्धि के लिए अपनाया जा सकता है । बायोटिन और फोटो-सट linker भी एकल और दोहरे फंसे हुए डीएनए से जुड़ी covalently हो सकती है, संभावित रूप से विभिन्न डीएनए/प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की शुद्धि के लिए यूवी-रेफरेंस विधि का विस्तार ।
covalently संलग्न बायोटिन और फोटो-सट linker युक्त आरएनए के रासायनिक संश्लेषण केवल अनुक्रम है कि ~ ६५ न्यूक्लियोटाइड से अधिक नहीं है, महंगी और अक्षम बनने के लिए काफी लंबे समय अनुक्रम के साथ व्यावहारिक है । इस समस्या को हल करने के लिए, हम भी एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि बहुत लंबे समय तक आरएनए बाध्यकारी लक्ष्य के लिए उपयुक्त है विकसित की है । इस दृष्टिकोण में, किसी भी लंबाई और न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के आरएनए में T7 या SP6 प्रतिलेखन और annealed द्वारा इन विट्रो में उत्पन्न होता है एक छोटी पूरक oligonucleotide कि बायोटिन शामिल हैं और फोटो-' 5 अंत में सट लिंकर (ट्रांस विन्यास). परिणामी द्वैध बाद में व्यक्तिगत बाध्यकारी प्रोटीन या macromolecular परिसरों streptavidin मोतियों पर एक ही प्रोटोकॉल के लिए वर्णित के बाद शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें फोटो-सट बायोटिन संलग्न covalently (सीआईएस विन्यास). इस संशोधन के साथ, फोटो-सट बायोटिन के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ इन विट्रो उत्पन्न न्यूक्लियोटाइड के सैकड़ों युक्त टेप, आरएनए की एक विस्तृत श्रृंखला की शुद्धि के लिए यूवी-रेफरेंस विधि का विस्तार/

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

कई वर्षों के लिए, असाधारण मजबूत और तेजी से बायोटिन और streptavidin के बीच बातचीत का गठन सफलतापूर्वक जैविक रूप से महत्वपूर्ण आरएनए के आंशिक शुद्धि के लिए उपयोग किया गया है/ हालांकि, यह रणनीति एक प्रमुख नुकसान से ग्रस्त है कि अपने व्यापक उपयोग सीमा: बायोटिन/streptavidin बातचीत denaturing शर्तों के तहत ही तोड़ा जा सकता है कि eluted परिसरों की अखंडता को भी बाधित है, इसलिए precluding उनके बाद में कार्यात्मक विश्लेषण और/या अंय तरीकों से आगे शोधन । इसके अलावा, eluted नमूने अक्सर streptavidin मोतियों के साथ विशेष रूप से संबद्ध है कि पृष्ठभूमि प्रोटीन के साथ प्रदूषित कर रहे हैं, चांदी धुंधला और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा शुद्ध परिसरों के विश्लेषण उलझी । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम बायोटिन/streptavidin रणनीति है जिसमें बायोटिन एक आरएनए सब्सट्रेट करने के लिए एक तस्वीर के माध्यम से संलग्न है के एक संस्करण विकसित-सट linker और परिसरों streptavidin मोतियों पर मैटीरियल चुनिंदा एक में हल करने के लिए eluted हैं लंबी लहर यूवी द्वारा देशी फार्म, मोतियों पर पृष्ठभूमि प्रोटीन जा. छोटे शाही सेना के बंधन सब्सट्रेट एक पूरक oligonucleotide द्वारा दो समूहों के साथ प्रदान किया जा सकता है, जबकि अब आरएनए सब्सट्रेट, आरएनए के 5 ' अंत करने के लिए संलग्न फोटो-सट लिंकर covalently और बायोटिन के साथ रासायनिक संश्लेषित किया जा सकता है । यूवी रेफरेंस विधि के इन दो वेरिएंट U7 snRNP-निर्भर प्रसंस्करण परिसरों कि 3 ' अंत में हिस्टोन पूर्व mRNAs सट और वे दोनों दूसरे पहले से विकसित शुद्धि तरीकों के लिए अनुकूल तुलना करने के लिए साबित कर दिया के शोधन के लिए परीक्षण किया गया । यूवी eluted नमूने U7 snRNP कि प्रमुख प्रोटीन संदूषण और जन स्पेक्ट्रोमेट्री और कार्यात्मक परख द्वारा प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए उपयुक्त से मुक्त किया गया था की आसानी से पता लगाने की मात्रा में निहित । वर्णित विधि आसानी से अन्य आरएनए बाध्यकारी परिसरों की शुद्धि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और डीएनए विशिष्ट प्रोटीन और macromolecular परिसरों को शुद्ध करने के लिए एकल और डबल असहाय डीएनए बंधन साइटों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया.

यूवी रेफरेंस विधि दो रासायनिक संश्लेषित आरएनए सब्सट्रेट covalently के साथ परीक्षण किया गया था 5 ' अंत करने के लिए पीसीबी moiety (सीआईएस विन्यास): पीसीबी-SL (चित्रा 1) और पीसीबी-dH3/5m RNAs (च...

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Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

आरएनए/प्रोटीन परिसरों botin का उपयोग कर शुद्ध-streptavidin रणनीति आगे शोधन और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक अनुपयुक्त रूप में denaturing शर्तों के तहत समाधान के लिए eluted हैं । यहां, हम इस रणनीति का एक संशोधन है कि एक फोटो-आरएनए में सट linker और एक सज्जन यूवी-रेफरेंस कदम का इस्तेमाल, देशी और पूरी तरह कार्यात्मक आरएनए उपज/

बायोटिन से जुड़ी आरएनए का उपयोग करके Macromolecular परिसरों का एकल-चरण शुद्धिकरण और एक फोटो-सट linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

यह विधि उन शोधकर्ताओं के लिए रुचि होनी चाहिए जो आरएनए प्रोटीन परिसरों को अलग करने और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उनकी संरचना की पहचान करने की कोशिश कर रहे हैं। हमारा मानना है कि हमारा प्रोटोकॉल उन जटिलताओं को शुद्ध करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी होगा जो सीमित मात्रा में कोशिकाओं में मौजूद हैं और लंबे बहु-चरण शुद्धिकरण प्रक्रियाओं के दौरान अलग होते हैं। इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि इसमें केवल एक ही शुद्धिकरण कदम शामिल है और इसका उपयोग किसी भी लंबाई और अनुक्रम के आरएनए बाध्यकारी साइटों के साथ किया जा सकता है।कुछ कदमों का प्रदर्शन जिओ-कुई यांग होगा, जो हमारे समूह में एक वरिष्ठ अनुसंधान तकनीशियन है । बाध्यकारी साइटों के लिए 65 न्यूक्लियोटाइड से काफी अधिक समय तक, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित T7 उत्पन्न आरएनए और एक एडाप्टर पीसीबी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राप्त करें। 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एडाप्टर ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के 100 पिकोमोल्स के साथ आरएनए के 20 पिकोमोल्स मिलाएं जिसमें बाइंडिंग बफर के 100 माइक्रोलीटर होते हैं।ट्यूब को उबलते पानी में रखें और इसे 5 मिनट तक इनक्यूबेट करें। फिर पानी को कमरे के तापमान तक ठंडा होने दें। पीएच 8 में 80 मिलीमोलर ईडीटीए के साथ माउस परमाणु निकालने का पहला पूरक 1 मिलीलीटर 10 मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता के लिए।फिर आरएनए सब्सट्रेट के 5 और 10 पिकोमोल्स के बीच जोड़ें जिसे पीसीबी मोगरी के साथ टैग किया गया है। 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट, कभी कभी नमूना मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित कर रही है। इसके बाद किसी भी संभावित वर्षा को दूर करने के लिए 10 मिनट के लिए 10, 000 बार जी पर मिश्रण को अपकेंद्रित्र करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व-ठंडा माइक्रोसेंट्रफ्यूज का उपयोग करें।सावधानी से बर्फ पर एक नई ट्यूब में सुपरनैंट इकट्ठा, जबकि गोली स्थानांतरित करने से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है। स्ट्रेप्टाविडिन एगरेवर बीड के लगभग 100 माइक्रोलीटर को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। मोतियों को धोना शुरू करने के लिए लगभग 1 मिलीलीटर बाइंडिंग बफर जोड़ें।ट्यूब को 2 से 3 मिनट के लिए 25 बार जी पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को एस्पिरेट करें। इस धुलाई और अपकेंद्रित्र प्रक्रिया को 2 से 3 बार दोहराएं ताकि मोतियों को बाध्यकारी बफर के साथ बराबर किया जा सके। पहले एकत्र किए गए सुपरनेट लोड करें, जिसमें समान मोतियों पर इकट्ठे परिसर शामिल हैं।एक ट्यूब रोटेटर का उपयोग करके, मोतियों पर आरएनए और बंधे परिसरों को स्थिर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ट्यूब घुमाएं। अगले ट्यूब के नीचे मोती इकट्ठा करने के लिए 2 से 3 मिनट के लिए 25 बार जी पर ट्यूब स्पिन । सुपरनेट को एस्पिरेट करें।और पहले वर्णित धोने की प्रक्रिया का उपयोग करके, बाध्यकारी बफर के साथ दो बार मोतियों को कुल्लाएं। दूसरे वॉश के सुपरनेट को हटाने के बाद, 1 मिलीलीटर बाइंडिंग बफर जोड़ें और 1 घंटे के लिए नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं। 2 से 3 मिनट के लिए 25 बार जी पर नमूना नीचे स्पिन।अगले बाध्यकारी बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक नई ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण। 1 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना घुमाएं। 2 से 3 मिनट के लिए 25 बार जी पर स्थिर परिसरों को अपकेंद्रित्र करें।फिर सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और बाइंडिंग बफर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। मोतियों को 500 माइक्रोलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक उच्च तीव्रता वाला यूवी लैंप चालू करें जो 365 नैनोमीटर पर यूवी प्रकाश उत्सर्जित करता है और इसे पूर्ण प्रतिभा तक पहुंचने की अनुमति देता है।कसकर पैक बर्फ यह पकवान के ढक्कन पर स्टैकिंग के साथ एक पेट्री पकवान के नीचे भरें । संक्षेप में स्थिर परिसरों युक्त ट्यूब भंवर। फिर इसे क्षैतिज रूप से बर्फ पर रखें और इसे पूर्व-गर्म दीपक के साथ कवर करें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि नमूना बल्ब की सतह से 2 से 3 सेंटीमीटर है।एक समान जोखिम सुनिश्चित करने और ओवरहीटिंग को रोकने के लिए ट्यूब को अक्सर उलटा और भंवर करते हुए कुल 30 मिनट के लिए नमूना विकिरणित करें। इसके बाद 2 से 3 मिनट तक 25 बार जी पर मोतियों को स्पिन करें और सुपरनेट को इकट्ठा करें। अपकेंद्रित्र इस सुपरनेट एक बार फिर एक ही शर्तों का उपयोग कर ।किसी भी अवशिष्ट मोतियों को स्थानांतरित करने से बचने के लिए ट्यूब के तल पर एक छोटी राशि छोड़ना सुनिश्चित करने के लिए परिणामी सुपरनाटेक्ट करें। एसडीएस-पेज इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके, यूवी एल्यूटेड सुपरनेट का एक अंश और यूवी एल्यूशन के बाद मोतियों पर छोड़ी गई सामग्री से संबंधित अंश को अलग करें। अगले जेल दाग करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चांदी धुंधला किट का उपयोग करें।यूवी eluted supernatant में मौजूद प्रोटीन की तीव्रता और यूवी विकिरण के बाद मोतियों पर छोड़ दिया उन की तुलना करके यूवी संलयूशन की दक्षता का मूल्यांकन करें। ब्याज के प्रोटीन बैंड उत्पादित करें और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उनकी पहचान निर्धारित करें। इसके बाद, सीधे एक निष्पक्ष तरीके से शुद्ध सामग्री के पूरे प्रोटेम का निर्धारण करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा यूवी एल्यूटेड सुपरनेट्ट के एक अंश का विश्लेषण करें।इस अध्ययन में, फोटो-क्लीवेबल बायोटिन के साथ टैग किए गए स्टेम लूप आरएनए को चूहों मायलोमा कोशिकाओं से प्राप्त साइटोप्लाज्मिक S100 निकालने के 1 मिलीलीटर के साथ इनक्यूबेटेड किया गया है। और यूवी एल्यूशन के प्रभाव और दक्षता का विश्लेषण चांदी के धुंधला द्वारा किया जाता है। यूवी एल्यूशन से पहले स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों पर कई प्रोटीन का पता लगाया जाता है।लंबी लहर यूवी के साथ विकिरण मोतियों पर एक गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि छोड़ने वाले सुपरनैंट में इनमें से कुछ प्रोटीन जारी करता है। यह यूवी एल्यूशन स्टेप के महत्व पर जोर देता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री 3'एचेक्सो और एसएलपीपी के रूप में प्रमुख यूवी एलुट किए गए प्रोटीन की पहचान करता है जिसमें एसएलबीपी दोनों पूर्ण लंबाई प्रोटीन और कई छोटे क्षरण उत्पादों द्वारा प्रतिनिधित्व किया जा रहा है।विभिन्न आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के रूप में पहचाने जाने वाले अन्य प्रोटीनों की छोटी मात्रा भी चुनिंदा रूप से यूवी विकिरण द्वारा समाधान में जारी की जाती है। परमाणु निकालने के साथ फोटो-क्लीवेबल बायोटिन के साथ टैग किए गए स्थिर ड्रोसोफिला हिस्टोन प्री-एमआरएनए के यूवी एल्यूशन के परिणामस्वरूप मोतियों पर शेष गैर-विशिष्ट प्रोटीन की तीव्र पृष्ठभूमि के साथ सुपरनेट में केवल थोड़ी संख्या में प्रोटीन की चयनात्मक रिहाई हुई। मास स्पेक्ट्रोमेट्री इन प्रोटीनों को U7 snRNP के घटकों के रूप में पहचानती है।प्रसंस्करण प्रतियोगियों की उपस्थिति में उनका पता नहीं लगाया जाता है जो U7 snRNP के बाध्यकारी को हिस्टोन प्री-एमआरएनए में अवरुद्ध करते हैं। उच्च तीव्रता वाले यूवी लैंप का उपयोग करना महत्वपूर्ण है और इसे विकिरणित नमूने के लिए एक करीबी दूरी रखना महत्वपूर्ण है, जबकि यह भी सुनिश्चित करें कि यह ओवरहीट न हो। यूवी एल्यूशन विधि देशी आरएनए प्रोटीन परिसरों की पैदावार करती है जिनमें प्रमुख प्रदूषकों की कमी होती है और वे सीधे अतिरिक्त शुद्धिकरण चरणों और कार्यात्मक परख के लिए उपयुक्त होते हैं।यूवी विकिरण के दौरान आंख और त्वचा के संपर्क में आने से बचें।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Oligonucleotide निर्देशित क्षालन का उपयोग कोशिकाओं से आत्मीय आरएनए प्रोटीन परिसरों का अलगाव

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

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Thermostabilization, अभिव्यक्ति, शोधन, और मानव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर के क्रिस्टलीकरण के लिए बाध्य<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

कोशिकाओं से मिलकर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

निलंबन सेल संस्कृतियों में डीएनए नुकसान-प्रेरित प्रोटीन परिसरों का पता लगाने और विज़ुअलाइज़ेशन निकटता के बंधन परख का उपयोग करना

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

प्रोटीन-आरएनए परिसरों की बढ़ी हुई जांच के लिए क्षैतिज जेल वैद्युतकणसंचलन

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

स्तनधारी mRNAs पर अनुवाद दीक्षा परिसर गठन का Toeprinting विश्लेषण

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 में 1: प्रोटीन और प्रोटीन-Metabolite परिसरों के समानांतर विश्लेषण के लिए एक कदम संबध शुद्धि

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए TRPV1 का शुद्धिकरण और पुनर्गठन

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

एक Oligonucleotide आधारित मिलकर आरएनए अलगाव प्रक्रिया Eukaryotic mRNA-प्रोटीन परिसरों को पुनर्प्राप्त करने के लिए

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...