Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
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Ringraziamo i nostri colleghi e collaboratori per il loro contributo al nostro lavoro. Questo studio è stato sostenuto dal NIH concedere GM 29832.

1. preparazione del substrato
Nota: Substrati RNA inferiore a ~ 65 nucleotidi possono essere sintetizzati chimicamente con biotina (B) e il linker di foto-spaccabili (pc) (insieme denominati foto-spaccabili biotina o pcB) legame covalente all'estremità 5' RNA (configurazionecis ). Substrati di RNA contenenti siti di legame significativamente più lunghi devono essere generati in vitro da T7 (o SP6) trascrizione e successivamente ricotto per un oligonucleotide di breve adattato...

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	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

Il metodo qui descritto è semplice e oltre che incorporano un foto-spaccabili linker e il passaggio di UV-eluizione non differisce dai metodi comunemente usati che sfruttano estremamente forte interazione biotina streptavidina. Il passaggio di UV-eluizione è molto efficiente, rilasciando in genere oltre il 75% del RNA immobilizzato e proteine da streptavidina perline, lasciando dietro di sé un elevato background di proteine che legano non specificamente ai talloni associate. Eliminando questo sfondo, il passo di UV-el...

Negli eucarioti, precursori di RNA polimerasi II-generato mRNA (pre-mRNA) sottoporsi a diversi eventi di maturazione nel nucleo prima di diventare pienamente funzionali modelli di mRNA per la sintesi proteica nel citoplasma. Uno di questi eventi è di processamento dell'estremità 3'. Per la stragrande maggioranza dei pre-mRNA, 3' fine trattamento comporta clivaggio accoppiato di poliadenilazione. Questa reazione in due fasi è catalizzata da un complesso relativamente abbondante composto da più di 15 proteine1. Animale replica-dipendente dell'istone pre-mRNA vengono elaborati all'estremità 3' da un meccanismo differente in cui il ruolo chiave è giocato da U7 snRNP, una scarsa abbondanza complesso composto da U7 snRNA di ~ 60 nucleotidi e più proteine2,3 . Le coppie di basi U7 snRNA con specifiche sequenze di istone pre-mRNA e uno delle subunità della snRNP U7 catalizza la reazione di scissione, generando maturo istone mRNA senza un poli (a) coda. 3' terminare l'elaborazione di istone pre-mRNA richiede anche gambo-ciclo Binding Protein (SLBP), che associa un gambo-ciclo conservato situato a Monte del sito di clivaggio e migliora l'assunzione delle snRNP U7 al substrato2,3. Gli studi finalizzati ad individuare i singoli componenti delle snRNP U7 sono stati impegnativi a causa della bassa concentrazione delle snRNP U7 in cellule animali e la tendenza del complesso di dissociare o subiscono parziale proteolisi durante la purificazione come conseguenza dell'utilizzo detergenti delicati4,5,6, lavaggi sale alte e/o più passaggi cromatografici7,8,9.
Recentemente, per determinare la composizione dell'apparato di elaborazione U7-dipendente, un breve frammento di biotina contenenti pre-mRNA di istone 3' o 5' è stato incubato con un estratto nucleare e i complessi montati sono stati catturati su rivestite con streptavidina agarosio perline5,6,10. A causa di eccezionalmente forte interazione biotina streptavidina, proteine immobilizzate su streptavidina perline sono stati eluiti sotto condizioni di denaturazione bollendo in SDS e analizzati dalla macchiatura d'argento e spettrometria di massa. Mentre questo approccio semplice ha individuato una serie di componenti delle snRNP U7, ha reso relativamente grezzi campioni, spesso contaminati con un gran numero di proteine sfondo non specifico associato a perle di streptavidina, potenzialmente mascherare alcuni componenti di i macchinari di lavorazione e prevenire la loro rilevazione su argento macchiato gel5,6,10. D'importanza, questo approccio anche precluso qualsiasi studi funzionali con il materiale isolato e suo ulteriore purificazione per omogeneità di metodi aggiuntivi.
Sono state proposte una serie di modifiche nel tempo per affrontare la natura praticamente irreversibile dell'interazione biotina/streptavidina, con la maggior parte di loro essendo progettato per indebolire o l'interazione o per fornire un braccio spaziatore chimicamente spaccabili nella biotina-contenere i reagenti11,12. L'inconveniente di tutte queste modifiche era che riducono in modo significativo l'efficienza del metodo e/o condizioni di non-fisiologica spesso richieste durante la fase di eluizione, compromettere l'integrità o la attività delle proteine purificate.
Qui, descriviamo un approccio diverso per risolvere il problema inerente della strategia di biotina/streptavidina utilizzando RNA substrati in cui la biotina è covalente al 5' estremità tramite una foto-spaccabili 1-(2-nitrofenil) frazione etilico che è sensibile alla lunghezza d'onda UV13,14. Abbiamo testato questo approccio per la purificazione dell'apparato di elaborazione limitante U7-dipendente dalla drosofila e mammiferi nucleari estratti15. Dopo una breve incubazione di biotina contenenti pre-mRNA di istone e il linker foto-spaccabili con un estratto nucleare, i complessi di elaborazione assemblati sono immobilizzati su perle di streptavidina, lavati accuratamente e delicatamente rilasciati alla soluzione in un nativo forma di esposizione a ~ 360 nm UV luce. Il metodo UV-eluizione è molto efficiente, veloce e semplice, producendo una quantità sufficiente delle snRNP U7 per visualizzare i componenti di scheggia colorazione da appena 100 µ l di Estratto di15. Il materiale UV-eluito è privo di proteine sfondo e adatto per analisi di spettrometria di massa diretto, fasi di purificazione supplementare e saggi enzimatici. Lo stesso metodo può essere adottato per la purificazione di altri complessi di RNA/proteine che richiedono relativamente brevi siti di legame di RNA. Biotina e il linker foto-spaccabili può anche essere in covalenza collegati al singolo - e double-stranded DNA, potenzialmente estendendo il metodo UV-eluizione per la depurazione di vari complessi di DNA/protein.
Sintesi chimica di substrati di RNA contenenti covalenza collegato biotina e il linker foto-spaccabili è pratico solo con le sequenze che non superano i nucleotidi ~ 65, diventando costoso e inefficiente per sequenze significativamente più lungo. Per risolvere questo problema, abbiamo anche sviluppato un metodo alternativo che è adatto per molto più tempo obiettivi vincolanti di RNA. In questo approccio, RNA di qualsiasi sequenza del nucleotide e lunghezza è generato in vitro di T7 e SP6 la trascrizione e ricotto per un breve oligonucleotide complementare che contiene biotina e il linker foto-spaccabili all'estremità 5' (trans configurazione). Il duplex risultante viene successivamente utilizzato per purificare proteine leganti singoli o complessi macromolecolari su streptavidina perline seguendo lo stesso protocollo descritto per i substrati di RNA contenenti foto-spaccabili biotina associata covalentemente (cis configurazione). Con questa modifica, la biotina foto-spaccabili utilizzabile in combinazione con le trascrizioni in vitro generato contenente centinaia di nucleotidi, estendendo il metodo UV-eluizione per la purificazione di una vasta gamma di RNA/proteine.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

Per molti anni, eccezionalmente forte e rapidamente formato interazione biotina streptavidina è stata utilizzata con successo per purificazione parziale dei complessi RNA/proteine biologicamente importanti. Tuttavia, questa strategia soffre di uno dei principali svantaggi che limita il suo utilizzo più ampio: l'interazione biotina/streptavidina può essere rotto solo sotto denaturare condizioni che anche compromettere l'integrità dei complessi eluiti, quindi precludendo loro successive analisi funzionale e/o ulteriore purificazione da altri metodi. Inoltre, i campioni eluiti sono spesso contaminati con le proteine di sfondo che non specifico associano con streptavidina perline, che complica l'analisi dei complessi purificati dalla macchiatura d'argento e spettrometria di massa. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una variante della biotina/streptavidina strategia in cui biotina è collegata a un RNA substrato tramite un linker foto-spaccabili e i complessi immobilizzati su streptavidina perline sono eluiti selettivamente alla soluzione in un formato nativo di onda lunga UV, lasciando le proteine di sfondo sui branelli. Substrati di associazione più breve RNA possono essere sintetizzati chimicamente con biotina e il linker foto-spaccabili legame covalente all'estremità 5' del RNA, mentre più substrati di RNA possono essere forniti con i due gruppi di un oligonucleotide complementare. Queste due varianti del metodo UV-eluizione sono state testate per la purificazione dei complessi elaborazione snRNP-dipendente U7 che fendono istone pre-mRNA all'estremità 3' e hanno entrambi dimostrato di reggono il confronto ad altri precedentemente sviluppato metodi di purificazione. I campioni eluiti UV contengono quantità molto facilmente rilevabile delle snRNP U7 che era esente dagli agenti inquinanti principali proteine e adatto per l'analisi diretta di spettrometria di massa e saggi funzionali. Il metodo descritto può essere prontamente adattato per la purificazione di altri complessi di associazione di RNA e utilizzato in combinazione con siti di legame del DNA singolo - e double-stranded per purificare proteine DNA-specifico e complessi macromolecolari.

Il metodo UV-eluizione è stato testato con due substrati di RNA sintetizzati chimicamente legate covalentemente all'estremità 5' ad il pcB (configurazionecis ): pcB-SL (Figura 1) e pcB-dH3/5m RNAs (Figura 2). Il 31-nucleotide pcB-SL RNA contiene una struttura di gambo-ciclo seguita da una coda di filamento singola 5-nucleotide e la sua sequenza è identica all'estremità 3' dell'istone maturo mRNA (cioè., dop...

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Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Complessi RNA/proteici purificati mediante botin-streptavidina strategia sono eluiti per soluzione in condizioni denaturanti in forma inadatta per ulteriore purificazione e analisi funzionale. Qui, descriviamo una modifica di questa strategia che utilizza un linker foto-spaccabili in RNA e un delicato passaggio di UV-eluizione, producendo complessi RNA/proteine native e completamente funzionale.

Single-step purificazione di complessi macromolecolari usando RNA attaccato alla biotina e un Linker foto-spaccabili

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Questo metodo dovrebbe interessare i ricercatori che stanno cercando di isolare i complessi proteici dell'RNA e identificarne la composizione mediante spettrometria di massa. Crediamo che il nostro protocollo sarà particolarmente utile per purificare i complessi che esistono nelle cellule in quantità limitate e tendono a dissociarsi durante lunghe procedure di purificazione in più step. Il vantaggio principale di questo metodo è che coinvolge solo un singolo passaggio di purificazione e potrebbe essere utilizzato con siti di legame RNA di qualsiasi lunghezza e sequenza.A dimostrare alcuni dei passaggi sarà Xiao-cui Yang, che è un tecnico di ricerca senior nel nostro gruppo. Per i siti di associazione significativamente più lunghi di 65 nucleotidi, ottenere l'RNA generato da T7 e un adattatore PCB oligonucleotide come delineato nel protocollo di testo. Mescolare 20 picomoli dell'RNA con 100 picomoli dell'oligonucleotide dell'adattatore in un tubo da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di tampone legante.Posizionare il tubo in acqua bollente e lasciarlo incubare per 5 minuti. Quindi lasciare raffreddare l'acqua a temperatura ambiente. Primo supplemento 1 millilitro di estratto nucleare di topo con EDTA da 80 millimolare a pH 8 ad una concentrazione finale di 10 millimolare.Quindi aggiungere tra 5 e 10 picomoli del substrato di RNA che è stato taggato con la moiety PCB. Incubare sul ghiaccio per 5 minuti, assicurandosi di mescolare occasionalmente il campione. Successivamente utilizzare un microcentrifugo pre-raffreddato a 4 gradi Celsius per centrifugare la miscela a 10.000 volte g per 10 minuti per rimuovere eventuali precipitati.Raccogliere con cura il supernatante in un nuovo tubo sul ghiaccio, facendo attenzione a evitare di trasferire il pellet. Trasferire circa 100 microlitri di sospensione di perline di agarosio streptavidina in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere circa 1 millilitro di tampone di legame per iniziare a lavare le perline.Centrifugare il tubo a 25 volte g per 2-3 minuti e aspirare il supernatante. Ripetere questo processo di lavaggio e centrifugazione da 2 a 3 volte per equilibrare le perline con il tampone di legame. Caricare il supernatante raccolto in precedenza, che contiene il complesso assemblato sulle perline equilibrate.Utilizzando un rotatore a tubo, ruotare il tubo per 1 ora a 4 gradi Celsius per immobilizzare l'RNA e i complessi legati sulle perline. Successivamente ruotare il tubo a 25 volte g per 2-3 minuti per raccogliere le perline nella parte inferiore del tubo. Aspirare il supernatante.E sciacquare le perline due volte con tampone di legame, utilizzando il processo di lavaggio descritto in precedenza. Dopo aver rimosso il supernatante del secondo lavaggio, aggiungere 1 millilitro di tampone di legame e ruotare il campione per 1 ora a 4 gradi Celsius. Far girare il campione a 25 volte g per 2-3 minuti.Aggiungere quindi 1 millilitro di tampone di legame e trasferire la sospensione su un nuovo tubo. Ruotare il campione a 4 gradi Celsius per un massimo di 1 ora. Centrifugare i complessi immobilizzati a 25 volte g per 2-3 minuti.Quindi aspirare il supernatante e aggiungere 200 microlitri di buffer di legame. Trasferire le perline in un tubo da 500 microliter. Accendere una lampada UV ad alta intensità che emette luce UV a 365 nanometri e permettergli di raggiungere la piena brillantezza.Riempire il fondo di una piastra di Petri con ghiaccio ben imballato impilarlo sul coperchio del piatto. Vortice brevemente il tubo contenente i complessi immobilizzati. Quindi posizionarlo orizzontalmente sul ghiaccio e coprirlo con la lampada pre-riscaldata, assicurandosi che il campione sia da 2 a 3 centimetri dalla superficie del bulbo.Irradiare il campione per un totale di 30 minuti invertendo e vortexando frequentemente il tubo per garantire un'esposizione uniforme e prevenire il surriscaldamento. Dopodi questo, gira giù le perline a 25 volte g per 2-3 minuti e raccogli il supernatante. Centrifuga questo supernatante ancora una volta usando le stesse condizioni.Raccogliere il supernatante risultante assicurandosi di lasciare una piccola quantità nella parte inferiore del tubo per evitare il trasferimento di perline residue. Utilizzando l'elettroforesi SDS-PAGE, separare una frazione del supernatante eluitato UV e la frazione corrispondente dal materiale lasciato sulle perline dopo l'eluizione UV. Successivamente utilizzare un kit di colorazione in argento disponibile in commercio per macchiare il gel.Valutare l'efficienza dell'eluizione UV confrontando le intensità delle proteine presenti nel supernatante eluitato UV e quelle lasciate sulle perline in seguito all'irradiazione UV. Asportare le bande proteiche di interesse e determinarne l'identità mediante spettrometria di massa. Successivamente, analizzare direttamente una frazione del supernatante eluito dai raggi UV mediante spettrometria di massa per determinare l'intero proteoma del materiale purificato in modo imparziale.In questo studio, l'RNA ad anello stelo taggato con biotina foto-cleavabile viene incubato con 1 millilitro di un estratto citoplasmatico S100 ottenuto dalle cellule del mieloma dei topi. E l'effetto e l'efficienza dell'eluizione UV viene analizzato dalla colorazione dell'argento. Un certo numero di proteine vengono rilevate sulle perline di streptavidina prima dell'eluizione UV.L'irradiazione con UV ad onde lunghe rilascia solo alcune di queste proteine nel supernatante lasciando uno sfondo non specifico sulle perline. Ciò sottolinea l'importanza della fase di eluizione UV. La spettrometria di massa identifica le principali proteine eluite uv come 3'hExo e SLBP con SLBP rappresentato sia dalla proteina a lunghezza intera che da una serie di prodotti di degradazione più corti.Piccole quantità di altre proteine identificate come varie proteine leganti l'RNA rilasciate selettivamente in soluzione dall'irradiazione UV. L'eluizione UV della Drosophila istone immobilizzata pre-mRNA taggata con biotina foto-cleavabile incubata con un estratto nucleare ha portato a un rilascio selettivo di solo un piccolo numero di proteine nel supernatante con un intenso sfondo di proteine non specifiche che rimangono sulle perline. La spettrometria di massa identifica queste proteine come componenti dell'U7 snRNP.Non vengono rilevati in presenza di concorrenti di elaborazione che bloccano l'associazione di U7 snRNP al pre-mRNA istono. È importante utilizzare la lampada UV ad alta intensità e posizionarla a distanza ravvicinata dal campione irradiato, assicurandosi al contempo che non si suscaldi. Il metodo di eluizione UV produce complessi proteici di RNA nativi privi di contaminanti principali e direttamente adatti per ulteriori fasi di purificazione e test funzionali.Evitare l'esposizione di occhi e pelle durante l'irradiazione UV.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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