Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
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同僚と協力者の貢献のために我々 の仕事に感謝します。この研究は、NIH によって支えられた GM 29832 を付与します。

1. 基板の準備
注: ~ 65 ヌクレオチドより短い RNA 基板は、ビオチン (B) と共有結合 RNA 5' 側 (cis構成) に接続 (一緒に写真分解ビオチンまたは pcB と呼ばれる) 写真分解 (pc) リンカーを化学的に合成できます。大幅に長く結合部位を含む RNA 培地生成された体外T7 (または SP6) 転写する必要があるし、その後 5' 端 (トランスで基板部分を有する短い補完アダプ?...

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	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

ここで説明する方法は簡単で、写真分解のリンカーを組み込むほか、UV 溶出のステップはビオチンとストレプトアビジンの非常に強い相互作用を活用する一般的に使用されるメソッドから違いはありません。UV 溶出のステップは非常に効率的で、通常固定化 RNA の 75% 以上をリリース、ストレプトアビジン ビーズ、ビーズに非特異に結合するタンパク質の高いバック グラウンドを残してから?...

真核生物の RNA ポリメラーゼ II によって生成された mRNA 前駆体 (Mrna) は細胞質でのタンパク質合成のための完全に機能の mRNA テンプレートになる前に核の成熟イベントがいくつかを受けます。これらのイベントの 1 つは、3' 端処理です。Mrna の大半には、3' 端処理には胸の谷間に起こる結合が含まれます。この 2 段階の反応は比較的豊富な複合体によって触媒以上 15 の蛋白質1から成る。動物レプリケーション依存性ヒストン Mrna は 3' 末端で U7 snRNP、U7 に snRNA の ~ 60 のヌクレオチドと複数タンパク質2,3から成る複雑な低豊富で、重要な役割を果たした別の機構によって処理されます。.ヒストン mRNA と U7 snRNP のサブユニットの 1 つの特定のシーケンスで U7 に snRNA 塩基対が開裂反応を触媒する、成熟したヒストンを生成せず、多 mRNA 尾します。ヒストン mRNA の 3' 端処理も必要と茎ループ結合タンパク質 (SLBP)、保存された茎ループの位置を結合する胸の谷間サイトの上流と基板2,3U7 snRNP の募集を強化します。目的で U7 snRNP の個々 のコンポーネントを識別する研究は、動物細胞で U7 snRNP の低濃度として分離または使用した結果浄化中に部分的な分解を受ける複合体の傾向のために挑戦されています。中性洗剤4,5,6、高い塩の洗浄および/または複数のクロマト グラフの手順7,8,9。
最近、U7 に依存した処理機械の組成を決定するヒストン mRNA が 3' または 5' でビオチンを含むの短い断片だった核エキスと培養および組み立ての複合体は、ストレプトアビジン コーティングで捕えられました。アガロース ビーズ5,6,10。ビオチンとストレプトアビジンの非常に強力な相互作用のためストレプトアビジン ビーズに固定化した蛋白質は SDS の沸騰によって条件の変化の下で溶出され銀製の汚損及び質量分析法によって分析します。比較的粗サンプル、しばしば多数の背景蛋白質特異的行きの可能性のいくつかのコンポーネントをマスキング、ストレプトアビジン ビーズ混入が得られた一方、この単純なアプローチは、U7 snRNP のコンポーネントの数を識別加工機械と銀の検出を防止する染色ゲル5,6,10。重要なは、このアプローチはまた追加のメソッドによって分離材料と同質性にさらに精製機能研究を排除しました。
ビオチン/ストレプトアビジン相互作用には、いずれかの相互作用を弱めるかで化学分解スペーサー アームを提供するために設計されているそれらのほとんどの事実上不可逆的な性質に対処するため時間の経過と共に変更の数を提案した、ビオチンを含む試薬11,12。すべてのこれらの変更の欠点は、彼らが著しく整合性または浄化された蛋白質の活動を危険にさらす、溶出のステップ中にメソッドおよび/または多くの場合必要な非生理的条件の効率を減らすことだった。
ここでは、固有の問題を解決する別のアプローチについて述べる RNA を用いたビオチン/ストレプトアビジン戦略の 5 ' ビオチンが共有結合に接続された基板を経由で終了写真分解 1-(2-ニトロフェニル) はエチル基UV13,14を長波長に敏感。我々 はショウジョウバエから制限 U7 依存処理機械の浄化のためのこのアプローチをテストし、哺乳類の核抽出15。ヒストン mRNA 含んでいるビオチンの短い潜伏と核エキスで写真分解のリンカー、組み立て加工団地のストレプトアビジン ビーズに固定化した、徹底的に洗って、やさしくネイティブ ソリューションをリリース~ 360 nm の紫外線ライトへの露出によってフォーム。UV 溶出方法は非常に効率的、迅速かつ簡単な U7 snRNP エキス15として 100 μ L から染色スライバーでそのコンポーネントを視覚化するための十分な量を収穫します。UV 溶出素材は背景蛋白質の無料直接質量分析、追加精製工程、酵素アッセイに最適です。同じメソッドは、比較的短い RNA 結合部位を必要とする他の RNA ・ タンパク質複合体の精製に採用されることがあります。ビオチンと写真分解リンカーも共有可能にシングル- と二本鎖 DNA の可能性のある様々 な DNA/タンパク質複合体の精製の UV 溶出法を拡張します。
ビオチンが共有結合を含む RNA 基板の化学合成に接続されているし、写真分解のリンカーで高価になり大幅に長い系列を非効率的な 〜 65 ヌクレオチドを超えないようにシーケンスのみ実用的ですが。この問題に対処するため、はるかに長い RNA バインディング ターゲットに適している方法を開発しました。このアプローチで任意の長さとヌクレオチドのシーケンスの RNA は生成された体外T7 または sp6 によってトランスクリプションによって、ビオチンおよび 5' 端 (トランスで写真分解のリンカーを含む短い相補的なオリゴヌクレオチドをアニールしました。構成)。結果二重個々 結合蛋白質または共有添付写真分解のビオチンを含む RNA の培地について同じプロトコルに従うストレプトアビジン ビーズの高分子複合体の浄化に使用後 (cis構成)。この変更には、UV 溶出の広範な範囲の RNA ・ タンパク質精製法の拡張のヌクレオチドの数百を含む体外生成成績と組み合わせて写真分解のビオチンを使用できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

長年、ビオチンとストレプトアビジンの非常に強力な急速に形成された相互作用を生物学的に重要な RNA ・ タンパク質複合体の部分的な浄化のため正常に利用されています。しかし、この戦略に苦しんでのより広範な利用を制限する 1 つの主要な欠点: ビオチン/ストレプトアビジン相互作用はまた排除したがって溶出の複合体の整合性を混乱させる条件の変化の下でだけ分けることができます、その後の機能的分析および/または他の方法でさらに精製。さらに、溶出サンプルは頻繁にストレプトアビジン ビーズ、銀染色及び質量分析法によって精製した複合体の解析を複雑に関連付ける特異的背景蛋白質と汚染されています。これらの制限を克服するために開発したビオチンは写真分解リンカーにより RNA 基板に接続されているし、ストレプトアビジン ビーズに固定化した複合体のソリューションに選択的に溶出されますビオチン/ストレプトアビジン戦略のバリアント、長波長紫外線、ビーズの背景蛋白質を残してネイティブ フォーム。一方、2 つのグループに相補的なオリゴヌクレオチドが長い RNA 基板を提供することができますは、短い RNA 結合基板をビオチンと、RNA の 5' 末端に接続した写真分解リンカー化学的に合成できます。UV 溶出法のこれらの 2 つのバリエーション 3' 端にヒストン Mrna を劈開 U7 snRNP に依存した処理の複合体の浄化のためテストされ、彼らは両方証明以前他に好意的に比較する精製方法を開発しました。UV 溶出サンプルには、主要な蛋白質の汚染物の無料され、質量分析法と機能アッセイによる直接分析に適した U7 snRNP の容易に検出可能な量が含まれています。この方法は、容易に他の RNA 結合の複合体の浄化のために適応し、DNA に固有の蛋白質と高分子複合体を浄化するために単一および二重鎖 DNA 結合部位と組み合わせて使用できます。

UV 溶出メソッドが共有 pcB 構造 (cis構成) に 5' 端に接続されている化学的に合成された RNA 基板を二枚テストされた: pcB SL (図 1) と pcB-dH3/5 m Rna (図 2)。5 ヌクレオチド単一の孤立した尾に続いて茎ループ構造を含み、そのシーケンスは、成熟したヒストンの 3' 末端と同じ 31-ヌクレオチドの pcB SL RNA mRNA (すなわち?...

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Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Botin ストレプトアビジン戦略を使用して精製した RNA ・ タンパク質複合体は、更なる精製および機能解析の不適切なフォームで変性条件下に溶出されます。ここでは、ネイティブと完全に機能 RNA ・ タンパク質複合体をもたらす RNA と穏やかな UV-溶出のステップの写真分解リンカーを利用してこの戦略の変更について述べる。

ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングル ステップ浄化

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

この方法は、RNAタンパク質複合体を単離し、質量分析によってその組成を同定しようとしている研究者に興味深いはずです。私たちのプロトコルは、限られた量の細胞に存在し、長い多段階の精製手順の間に解約する傾向がある複合体を浄化するのに特に有用であると考えています。この方法の主な利点は、単一の精製ステップのみを含み、任意の長さおよび配列のRNA結合部位で使用できることです。いくつかのステップを実証するのは、私たちのグループの上級研究技術者であるXiao-cui Yangです。65ヌクレオチドよりかなり長い結合部位については、テキストプロトコルに概説されているように、T7生成されたRNAおよびアダプタPCBオリゴヌクレオチドを得る。結合バッファーの100マイクロリットルを含む1.5ミリリットルチューブにアダプターオリゴヌクレオチドの100ピコモールとRNAの20ピコモールを混合します。沸騰したお湯にチューブを入れ、5分間インキュベートさせます。その後、水を室温まで冷却します。最初のサプリメント 1 ミリリットルのマウス核エキス 80 ミリモル EDTA で pH 8 で最終濃度 10 ミリモル.次に、PCB部分でタグ付けされたRNA基質の5〜10個のピコモールを加えます。氷の上で5分間インキュベートし、サンプルを時折混ぜるようにします。次に、摂氏4度で予冷したマイクロ遠心分離機を使用して、混合物を10,000倍のgで10分間遠心し、潜在的な沈殿物を除去します。慎重にペレットを転送しないように注意しながら、氷上の新しいチューブに上清を収集します。約100マイクロリットルのストレプトアビジンアガロースビーズ懸濁液を1.5ミリリットルチューブに移します。約1ミリリットルの結合バッファーを加えると、ビーズの洗浄を開始します。チューブを2〜3分間25回gで遠心分離し、上清を吸引する。この洗浄および遠心分離プロセスを2〜3回繰り返し、ビーズを結合バッファーと平衡化した。平衡ビーズ上に組み立てられた複合体を含む、以前に収集された上清をロードします。チューブ回転器を使用して、チューブを摂氏4度で1時間回転させ、RNAと結合複合体をビーズに固定します。次に、チューブを2〜3分間25回gで回転し、チューブの底部にあるビーズを収集します。上清を吸引する。ビーズを結合バッファーで2回リンスし、先に説明した洗浄プロセスを用いた。2回目の洗浄の上清を取り除いた後、1ミリリットルの結合バッファーを加え、サンプルを摂氏4度で1時間回転させます。2〜3分間、25回gでサンプルをスピンダウンします。次に、1ミリリットルの結合バッファーを追加し、懸濁液を新しいチューブに移します。サンプルを摂氏4度で1時間回転させます。固定化された複合体を25回gで2〜3分間遠心する。次いで吸気上清、200マイクロリットルの結合緩衝液を加えた。ビーズを500マイクロリットルチューブに移します。365ナノメートルでUV光を発する高輝度のUVランプをオンにし、それが完全な輝きに達することを可能にします。ペトリ皿の底を、皿のふたの上にしっかりと詰めた氷で満たします。固定化された複合体を含む管を簡単に渦する。その後、氷の上に水平に置き、あらかじめ温めたランプで覆い、サンプルが電球の表面から2〜3センチメートルであることを確認します。均一な露出を確保し、過熱を防ぐために、チューブを頻繁に反転させ、ボルテックスしながら、サンプルを合計30分間照射します。この後、25回gで2〜3分間ビーズを回転させ、上清を集めます。遠心分離この上清は、同じ条件を使用してもう一度。得られた上清を収集し、残存ビーズの転写を避けるために、チューブの底部に少量を残すことを確認してください。SDS-PAGE電気泳動を使用して、UV溶出した上清の一部と、UV溶出後のビーズに残された材料から対応する分数を分離します。次に市販の銀染色キットを用いてゲルを染色する。UV溶出した上澄み物に存在するタンパク質と、UV照射後のビーズに残っているタンパク質の強度を比較して、UV溶出の効率を評価します。目的のタンパク質バンドを物品化し、質量分析法によってそのアイデンティティを決定します。この後、質量分析法によりUV溶出した上澄みの分画を直接分析し、精製物のプロテオーム全体を公平に決定する。本研究では、フォトクレアブルビオチンでタグ付けされた幹細胞ループRNAを、マウス骨髄腫細胞から得られた細胞質S100抽出物の1ミリリットルでインキュベートした。そして、UV溶出の効果と効率を、銀染色により解析する。UV溶出前にレンサビジンビーズで多くのタンパク質が検出されます。長波UVによる照射は、これらのタンパク質の一部のみを上清に放出し、ビーズに非特異的な背景を残します。これは UV 溶出ステップの重要性を強調する。質量分析は、主要なUV溶出タンパク質を3'hExoおよびSLBPと同定し、SLBPは全長タンパク質と多数の短い分解産物の両方で表される。様々なRNA結合タンパク質として同定された他のタンパク質の少量も、UV照射によって選択的に溶液中に放出される。核抽出物でインキュベートされたフォトクレアブルビオチンでタグ付けされた固定化ショウジョウバエヒストンプレmRNAのUV溶出は、ビーズに残っている非特異的タンパク質の強烈な背景を有する少数のタンパク質のみを上清に選択的に放出した。質量分析は、U7 snRNPの成分であるこれらのタンパク質を同定する。それらはヒストンプレmRNAへのU7 snRNPの結合をブロックする処理競争相手の存在下で検出されない。高輝度のUVランプを使用し、照射されたサンプルに近い距離に置き、過熱しないようにすることも重要です。UV溶出法は、主要な汚染物質を欠く天然RNAタンパク質複合体を生成し、追加の精製工程および機能アッセイに直接適しています。紫外線照射時の眼や皮膚への露出は避けてください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化<em&gt; S</em&gt; - シタロプラム

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングル ステップ浄化

ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングルステップ浄化