Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
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우리가 우리의 일을 우리의 동료와 공동 작업자 들 감사합니다. 이 연구는 NIH에 의해 지원 되었다 GM 29832 부여.

1. 기판 준비
참고: ~ 65 뉴클레오티드 보다 짧은 RNA 기판 biotin (B)와 사진 쪼갤 (pc) 링커 (통칭 사진 쪼갤 biotin 또는 pcB) covalently RNA 5' 끝 (cis 구성)에 연결 된 화학적으로 합성 될 수 있다. 상당히 긴 바인딩 사이트를 포함 하는 RNA 기판 생성 된 생체 외에서 T7 (SP6) 전사에 의해 있어야 하 고 이후 5' 끝 (트랜스 에 pcB moiety를 포함 하는 짧은 보완 어댑터 oligonucleotide...

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	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. 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F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

여기 설명 하는 방법을 간단 하 고 통합 사진 쪼갤 링커 외 이며 UV 차입 단계 biotin와 streptavidin 사이 매우 강한 상호 작용을 활용 하는 일반적으로 사용 되는 방법에서 다 하지 않습니다. UV 차입 단계 일반적으로 고정된 하는 RNA의 75% 이상 방출 매우 효율적 이며 streptavidin 구슬, 구슬에 비 특히 묶는 단백질의 높은 배경 뒤에 떠나는에서 단백질 관련. 제거 함으로써이 배경, UV 차입 단계 실버 얼룩, ?...

진핵생물, RNA 중 합 효소 II 생성 mRNA 선구자 (pre-mRNAs) 세포질에서 단백질 합성에 대 한 완전 한 기능 mRNA 템플릿이 되기 전에 핵에서 여러 성숙 이벤트를 받 다. 이러한 이벤트 중 하나는 3' 끝 처리입니다. 사전 mRNAs의 대부분, 3' 끝 처리 polyadenylation 결합 절단을 포함 한다. 상대적으로 풍부한 복잡 하 여이 2 단계 반응 촉매는 15 개 이상의 단백질1의 구성 된. 동물 복제 종속 히스톤 사전 mRNAs 3' 끝에 핵심 역할 U7 snRNP, ~ 60 뉴클레오티드 및 여러 단백질2,3 의 U7 snRNA 구성 된 복잡 한 낮은 풍부에 의해 재생 됩니다. 다른 메커니즘에 의해 처리 됩니다. . 히스톤 사전-mRNA와 U7 snRNP의 소 단위 중에 특정 순서로 U7 snRNA 기본적인 쌍 catalyzes 분열 반응, 성숙한 히스톤 생성 mRNA는 많은 없이 꼬리. 히스톤 사전-mRNA의 3' 끝 처리도 필요 줄기 루프 바인딩 단백질 (SLBP), 보존된 줄기 루프 위치를 바인딩하는 분열 사이트의 업스트림 기판2,3U7 snRNP의 채용을 향상 시킵니다. U7 snRNP의 개별 구성 요소를 식별 하기 위한 연구에 동물 세포에서 U7 snRNP의 낮은 농도와 해리 또는 부분 베이스를 사용 하 여 결과로 정화 동안 받아야 복잡 한 경향이 도전 되었습니다. 온화한 세제4,,56, 높은 소금 세척 및/또는 여러 컬럼에 단계7,,89.
최근, U7 종속 처리 기계의 구성 결정, 3' 또는 5'에서 히스톤 사전 mRNA 포함 biotin의 짧은 조각 핵 추출으로 incubated 했다 및 조립된 단지 streptavidin 입히는에 체포 되었다 agarose 구슬5,,610. Biotin과 streptavidin 사이 매우 강한 상호 작용으로 인해 단백질 streptavidin 구슬에 움직일 SDS에 끓는 조건을 변성 시키기에서 eluted 되었고 실버 얼룩 및 질량 분석에 의해 분석. 이 간단한 접근 U7 snRNP의 구성 요소 번호를 식별 하는 동안 그것은 상대적으로 원유 샘플, 종종 nonspecifically streptavidin 구슬, 잠재적으로 마스크의 일부 구성 요소에 바인딩된 배경 단백질의 많은 오염 나왔고 처리 기계 및 실버에 그들의 탐지를 방지 젤5,,610스테인드. 중요 한 것은,이 방법은 또한 추가 방법으로 격리 된 물자와 동질성을 더 정화의 어떤 기능 연구를 배제.
수정 수 중 상호 작용을 약하게 하거나에 화학적으로 쪼갤 스페이서 팔 제공 하 여 설계 되 고 그들의 대부분과 함께 비타민 b 복합체/streptavidin 상호 작용의 거의 돌이킬 수 없는 자연을 해결 하기 위해 시간이 지남에 제안 합니다 biotin 포함 시 약11,12. 이러한 모든 수정의 단점은 그들은 크게 무결성 또는 순화 된 단백질의 활동을 위태롭게 차입 단계 방법을 자주 필요한 비 생리 적 조건의 효율성 감소 했다.
여기, 우리 고유의 문제를 해결 하려면 다른 방법을 설명 RNA를 사용 하 여 비타민 b 복합체/streptavidin 전략의 기판에 biotin covalently에 연결 5' 를 통해 끝내는 사진 쪼갤 1도-(2-nitrophenyl)은 에틸 moiety 장파 UV13,14에 민감한. 우리는 초파리 에서 제한 U7 종속 처리 기계의 정화에 대 한이 접근을 테스트 하 고 포유류 핵15를 추출 합니다. 히스톤 사전 mRNA 포함 biotin의 짧은 외피와 핵 추출와 사진 쪼갤 링커, 조립된 처리 단지는 streptavidin 구슬에 움직일 수 철저 하 게 세척, 부드럽게 네이티브에서 솔루션 출시 ~ 360 nm UV 빛에 노출에 의해 형태. UV-차입 방법은 매우 효율적, 신속 하 고 간단, 저조한 은색 추출15의 작은 100 µ L에서 얼룩에 의해 그것의 구성 요소를 시각화 하기 위해 U7 snRNP의 충분 한 양을. UV eluted 자료 배경 단백질의 무료 이며 직접 질량 분석 분석, 추가 정화 단계 및 효소 분석 실험에 적합. 동일한 방법은 비교적 짧은 RNA 바인딩 사이트를 필요로 하는 다른 RNA 또는 단백질 복합물의 정화에 대 한 채택 될 수 있습니다. Biotin과 사진 쪼갤 링커 수 또한 covalently 장착할에 단일 및 더블-좌초 DNA, 잠재적으로 다양 한 DNA/단백질 복합물의 정화에 대 한 UV 차입 메서드를 확장.
Covalently 포함 된 RNA 기판의 화학 합성 연결 biotin 이며 사진 쪼갤 링커만 ~ 65 뉴클레오티드를 초과 하지 않는 시퀀스와 실용적인 비싸고 시간이 오래 시퀀스 비효율적 되고있다. 이 문제를 해결 하기 위해 우리는 또한 훨씬 더 긴 RNA 바인딩 대상에 적합 한 대체 접근을 개발 했다. 이 방법에서는, 어떤 길이 뉴클레오티드 순서의 RNA 생성 된 생체 외에서 SP6 또는 T7 전사에 의해 이며 biotin과 5' 끝 (트랜스 에 사진 쪼갤 링커 포함 하 고 하는 짧은 보완 oligonucleotide를 단련 구성)입니다. 결과 이중은 이후 개별 바인딩 단백질 또는 고분자 복합물 streptavidin 구슬 같은 프로토콜 covalently 첨부 사진 쪼갤 biotin 포함 된 RNA 기판에 대 한 설명 다음에 정화 하는 데 사용 됩니다 (cis 구성). 이 수정 사진 쪼갤 biotin에서 생체 외에서 생성 된 성적 정화의 광범위 한 범위의 RNA/단백질을 위한 UV 차입 메서드를 확장 하는 뉴클레오티드의 수백을 포함와 함께에서 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

많은 년간, biotin와 streptavidin 사이의 매우 강력 하 고 급속 하 게 형성 된 상호 작용은 생물학으로 중요 한 RNA 또는 단백질 복합물의 부분 정화에 대 한 성공적으로 이용 되어. 그러나,이 전략의 광범위 한 사용을 제한 하는 하나의 주요 단점에서 고통: biotin/streptavidin 상호 작용 또한 따라서 제외 eluted 단지의 무결성을 중단 시킬 조건을 변성 시키기의 밑 에서만 깨진 수 있습니다 그들의 이후 기능 분석 및/또는 다른 방법으로 추가 정화. 또한, eluted 샘플 자주 nonspecifically streptavidin 구슬, 순화 된 단지의 분석은 얼룩 및 질량 분석에 의해 복잡 하 게 연관 배경 단백질 오염. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리는 biotin 사진 쪼갤 링커를 통해 RNA 기판에 연결 된와 streptavidin 구슬에 움직일 단지는 선택적으로 eluted 솔루션에 biotin/streptavidin 전략의 변종 개발을 장파 UV, 구슬에 배경 단백질을 떠날에 의해 기본 형태. 짧은 RNA 바인딩 기판 수 수 합성 화학적으로 biotin과 covalently는 RNA의 5' 끝에 첨부 된 사진 쪼갤 링커 반면 긴 RNA 기판 보완 oligonucleotide에 의해 두 그룹으로 제공 될 수 있다. UV-차입 방법의이 2 개의 이체 3' 끝 히스톤 사전-mRNAs를 쪼개 U7 snRNP 종속 처리 단지의 정화에 대 한 테스트 되었습니다 그리고 그들은 둘 다 이전 다른 호의 베 풀 비교 하 정화 방법을 개발 입증. UV eluted 샘플 포함 쉽게 감지 양의 U7 snRNP 주요 단백질 오염 물질의 무료 하 고 질량 분석 및 기능 분석 실험에 의해 직접 분석에 적합 했다. 설명된 메서드를 쉽게 다른 RNA 바인딩 복합물의 정화에 대 한 적응 하 고 DNA 특정 단백질 및 고분자 복합물 정화 단일 및 이중 가닥 DNA 바인딩 사이트와 함께 사용 될 수 있습니다.

UV-차입 메서드 covalently pcB moiety (cis 구성)에 5' 끝에 연결 된 두 개의 화학적 합성된 RNA 기판 테스트 했다: pcB-SL (그림 1) 및 pcB-dH3/5 m RNAs (그림 2). 31-뉴클레오티드 pcB-SL RNA 포함 5 뉴클레오티드 단 하나 좌초 된 꼬리 뒤 줄기 루프 구조와 그 시퀀스는 성숙한 히스톤의 3' 끝 mRNA (즉., 히스톤 사전-U7 snRNP에 의해 mRNA의 분?...

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Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Botin streptavidin 전략을 사용 하 여 정화 RNA 또는 단백질 복합물은 eluted 더 정화와 기능 분석에 대 한 부적 절 한 형태로 변성 조건에서 솔루션. 여기, 우리가 네이티브 및 완전 한 기능 RNA 또는 단백질 복합물 저조한 RNA와 부드러운 UV 차입 단계 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여이 전략의 설명.

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

이 방법은 RNA 단백질 복합체를 분리하고 질량 분석법에 의하여 그들의 조성물을 확인하는 것을 시도하는 연구원에게 주의해야 합니다. 우리는 우리의 프로토콜이 제한된 양으로 세포에 존재하고 긴 다단계 정화 절차 동안 해리하는 경향이 있는 복합체를 정화하는 데 특히 유용할 것이라고 믿습니다. 이 방법의 주요 장점은 단일 정화 단계만 을 포함하고 모든 길이및 서열의 RNA 결합 부위와 함께 사용될 수 있다는 것입니다.일부 단계를 시연하는 것은 우리 그룹의 선임 연구 기술자인 샤오쿠이 양이 될 것입니다. 65개의 뉴클레오티드보다 훨씬 긴 결합 부위의 경우, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 T7 생성 된 RNA 및 어댑터 PCB 올리고뉴클레오티드를 얻습니다. 결합 완충제의 100 마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 어댑터 올리고뉴클레오티드의 100 피코몰과 RNA의 20 피코몰을 혼합.튜브를 끓는 물에 넣고 5 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 물이 실온으로 식힙니다. pH 8에서 80 밀리머 EDTA를 함유한 마우스 핵 추출물의 1 밀리리터를 10 밀리머의 최종 농도로 보충합니다.그런 다음 PCB 모이티로 태그된 RNA 기판의 5 그리고 10 피코몰을 추가합니다. 5분 동안 얼음에 배양하여 샘플을 섞는 경우가 있습니다. 다음으로 전냉각된 미세원심분리기를 섭씨 4도에서 원심분리하여 10분 동안 10, 000배 g에서 혼합물을 원심분리하여 잠재적침전을 제거합니다.펠릿 이송을 피하기 위해 주의하면서 얼음에 새로운 튜브로 상체를 조심스럽게 수집합니다. 약 100 마이크로리터의 스트렙타비딘 아가로즈 비드 서스펜션을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기다. 구슬 세척을 시작하기 위해 약 1 밀리리터의 바인딩 버퍼를 추가합니다.2-3분 동안 25배 g의 원심분리하고 수퍼나티를 흡인시합니다. 이 세척 및 원심 분리 과정을 2~3회 반복하여 구슬을 바인딩 버퍼로 평형화합니다. 이전에 수집된 상체를 평형 구슬 위에 조립된 복합체가 들어 있는 로드합니다.튜브 회전기를 사용하여 튜브를 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전하여 RNA를 고정하고 복합체를 구슬에 고정시하십시오. 다음으로 튜브의 바닥에 구슬을 수집하기 위해 2~ 3 분 동안 25 배 g에서 튜브를 회전시십시오. 상체를 흡인합니다.그리고 이전에 설명된 세척 공정을 사용하여 바인딩 버퍼로 구슬을 두 번 헹구는 다. 두 번째 세척의 상체를 제거한 후, 1 밀리리터의 바인딩 버퍼를 추가하고 샘플을 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전시합니다. 2-3분 동안 25배 g로 샘플을 회전시.다음으로 바인딩 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 서스펜션을 새 튜브로 전송합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 최대 1시간 동안 회전시합니다. 2~3분 동안 25배 g의 고정된 복합체원심분리기.그런 다음 슈퍼나탈을 흡인하고 200 마이크로리터의 바인딩 버퍼를 추가합니다. 구슬을 500 마이크로리터 튜브로 옮기습니다. 365 나노미터에서 UV 광을 방출하고 전체 광채에 도달 할 수있는 고강도 UV 램프를 켭니다.페트리 접시의 바닥을 꽉 포장된 얼음으로 채우면 접시 뚜껑 위에 쌓입니다. 고정 된 복합체를 포함하는 튜브를 간략하게 소용돌이. 그런 다음 얼음 위에 수평으로 놓고 미리 데워진 램프로 덮어 샘플이 전구 표면에서 2~3cm 떨어져 있는지 확인합니다.균일한 노출을 보장하고 과열을 방지하기 위해 튜브를 자주 반전하고 소용돌이치면서 총 30 분 동안 샘플을 조사하십시오. 그 후 25회 g에서 2-3분간 구슬을 스핀다운하고 상수모를 수집합니다. 원심 분리는 동일한 조건을 사용하여 다시 한 번이 상신합니다.잔류 구슬을 옮기지 않도록 튜브 바닥에 소량을 두는 결과 상체를 수집합니다. SDS-PAGE 전기포고증을 사용하여 UV 용출 후 구슬에 남아 있는 물질로부터 UV 용출 된 상신제의 일부와 해당 분획을 분리합니다. 다음으로 시판되는 실버 염색 키트를 사용하여 젤을 염색합니다.UV 에로테인초상체에 존재하는 단백질의 강도와 UV 조사 후 구슬에 남은 단백질의 강도를 비교하여 UV 용출의 효율을 평가한다. 관심있는 단백질 밴드를 소비하고 질량 분석법에 의해 자신의 정체성을 결정합니다. 그 후, 질량 분광법에 의해 UV 용출 된 상체의 일부를 직접 분석하여 정제 된 물질의 전체 프로테오메를 편견없는 방식으로 결정합니다.이 연구에서는, 광클레이블 비오틴으로 태그된 줄기 루프 RNA는 마우스 골수종 세포로부터 얻어진 세포질 S100 추출물의 1밀리리터로 배양된다. 그리고 자외선 용출의 효과와 효율은 은 염색에 의해 분석됩니다. 많은 단백질이 자외선 용출 전에 스트렙타비딘 구슬에서 검출됩니다.긴 파도 UV를 가진 조사는 구슬에 비특정 배경을 남기는 상체로 이 단백질의 단지 몇몇을 풀어 놓습니다. 이것은 UV 용출 단계의 중요성을 강조합니다. 질량 분석법은 주요 UV 용출 단백질을 3'hExo 및 SLBP로 식별하며 SLBP는 전체 길이 단백질과 다수의 짧은 분해 제품으로 표현되고 있습니다.다양한 RNA 결합 단백질로 확인된 소량의 다른 단백질도 UV 조사에 의해 용액으로 선택적으로 방출된다. 핵 추출물로 배양된 광클형 비오틴으로 태그된 고정된 Drosophila histone 의 UV 용출은 구슬에 남아 있는 비특이적 단백질의 강렬한 배경을 가진 소수의 단백질만 초상체에 선택적 방출을 초래하였다. 질량 분석법은 이러한 단백질을 U7 snRNP의 성분으로 식별합니다.그들은 히스톤 프리 mRNA에 U7 snRNP의 결합을 차단하는 처리 경쟁자의 존재에서 검출되지 않습니다. 고강도 UV 램프를 사용하고 조사된 샘플과 가까운 거리를 배치하는 동시에 과열되지 않도록 하는 것이 중요합니다. UV 용출 방법은 주요 오염 물질이 부족하고 추가 정화 단계 및 기능적 작용에 직접적으로 적합한 네이티브 RNA 단백질 복합체를 산출합니다.자외선 조사 중에 눈과 피부 노출을 피하십시오.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

연구

생화학

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...