Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Vi takker våre kolleger og samarbeidspartnere for deres bidrag til vårt arbeid. Denne studien ble støttet av NIH gi GM 29832.

1. substratet
Merk: RNA underlag kortere enn ~ 65 nukleotider kan syntetiseres kjemisk biotin (B) og foto-cleavable (pc) linker (sammen omtales som Foto-cleavable biotin eller pcB) covalently festet til RNA 5' (cis konfigurasjon). RNA underlag som inneholder betydelig lengre bindende områder må være generert i vitro med T7 (eller SP6) transkripsjon og senere herdet til en kort komplementære adapter oligonucleotide som inneholder pcB moiety på 5' slutten (trans kon...

<ol>
	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

Metoden beskrevet her er enkel og dessuten omfatter et foto-cleavable linker og UV-elueringsrør trinnet avvike ikke fra de vanligste bruke metodene som utnytter den ekstremt sterke vekselvirkningen mellom biotin og streptavidin. UV-elueringsrør trinnet er veldig effektivt, vanligvis ut mer enn 75% av de immobilisert og tilhørende proteiner fra streptavidin perler, etterlot seg en høy bakgrunn av proteiner som nonspecifically binder til perler. Ved å eliminere denne bakgrunnen, gir UV-elueringsrør trinnet bemerkelse...

I eukaryoter gjennomgå RNA polymerase II-generert mRNA prekursorer (pre-mRNAs) flere modning hendelser i kjernen før de blir fullt funksjonell mRNA maler for proteinsyntese i cytoplasma. En av disse hendelsene er 3 slutten behandling. For de aller fleste av pre-mRNAs innebærer 3 slutten behandling cleavage koblet til polyadenylation. Denne totrinns reaksjon er katalysert av et relativt rikelig kompleks som består av mer enn 15 proteiner1. Dyr replikering-avhengige histone pre-mRNAs behandles på 3 slutten av en annen mekanisme der den sentrale rollen spilles av U7 snRNP, en lav overflod består av U7 snRNA ~ 60 nukleotider og flere proteiner2,3 . U7 snRNA base parene med en bestemt sekvens i histone pre-mRNA og en av underenheter av U7-snRNP gir cleavage reaksjonen, genererer eldre histone mRNA uten en poly(A) hale. 3 slutten behandling av histone pre-mRNA krever også stilk-Loop bindende Protein (SLBP), som binder en bevart stilk-loop ligger over webområdet cleavage og forbedrer rekruttering av U7-snRNP til underlaget2,3. Studier identifisere individuelle komponenter av U7-snRNP har vært utfordrende på grunn av lav konsentrasjon av U7-snRNP i dyreceller og tendensen til komplisert å distansere eller gjennomgå delvis proteolyse under renselsen ved å bruke milde vaskemidler4,5,6, høy salt vasker og/eller flere brukt kromatografiske trinn7,8,9.
Nylig for å bestemme sammensetningen av U7-avhengige produksjonsutstyr, et kort fragment av histone pre-mRNA inneholder biotin 3 eller 5' ble inkubert med en kjernefysisk ekstrakt og sammensatte komplekser ble tatt på streptavidin-belagt agarose perler5,6,10. Eksepsjonelt sterke samhandling mellom biotin og streptavidin, var proteiner immobilisert på streptavidin perler elut under denaturing forhold ved koking i SDS og analyseres av sølv flekker og massespektrometri. Mens denne enkle tilnærming identifisert en rekke komponenter av U7-snRNP, ga det relativt grov prøver, ofte forurenset med et stort antall bakgrunn proteiner nonspecifically bundet til streptavidin perler, potensielt maskering noen av komponentene produksjonsutstyr og hindre gjenkjenningen på sølv farget gels5,6,10. Viktigere, utelukket denne tilnærmingen også alle funksjonelle studier med isolert materialet og rensing sin videre til homogenitet av flere metoder.
En rekke endringer ble foreslått over tid å ta nesten uhelbredelig natur biotin/streptavidin samhandling, med de fleste av dem blir utformet å enten svekke samspillet eller gi en kjemisk cleavable spacer arm i den biotin inneholder reagenser11,12. Ulempen med alle disse endringene var at reduserer effektiviteten av metoden eller ofte krever ikke-fysiologiske forhold under elueringsrør trinnet, jeopardizing enten integritet eller aktivitet av renset proteiner.
Her beskriver vi en annen tilnærming for å løse iboende problemet av biotin/streptavidin strategi ved hjelp av RNA underlag som biotin er covalently knyttet til 5' ende via en foto-cleavable 1-(2-nitrophenyl) ethyl moiety som er følsom for lenge bølge UV13,14. Vi testet denne tilnærmingen for rensing av begrensende U7-avhengige behandling maskiner fra Drosophila og pattedyr kjernefysiske ekstrakter15. Etter en kort inkubering av histone pre-mRNA inneholder biotin og foto-cleavable linker med en kjernefysisk ekstrakt, samlet behandling komplekser er immobilisert på streptavidin perler, grundig vasket og forsiktig ut til løsningen i opprinnelig form av 360 nm UV lyseksponering. UV-elueringsrør metoden er svært effektiv, rask og enkel, gir tilstrekkelig mengder U7-snRNP å visualisere komponentene av sliver flekker fra så lite som 100 µL av ekstrakt15. UV-elut materialet er gratis bakgrunn proteiner og egnet for direkte massespektrometri analyse, flere rensing trinnene og enzymatiske analyser. Samme metode kan vedtas for rensing av andre RNA/protein komplekser som krever relativt kort RNA bindende områder. Biotin og foto-cleavable linker kan også covalently knyttes til single - og double-strandet DNA, kan utvide UV-elueringsrør metoden for rensing av ulike DNA/protein komplekser.
Syntese av RNA underlag som inneholder covalently vedlagt biotin og foto-cleavable linker er praktisk bare med sekvensene som ikke overstiger ~ 65 nukleotider, bli dyrt og ineffektivt for betydelig lengre sekvenser. For å løse dette problemet, utviklet vi også en alternativ tilnærming som passer for mye lengre RNA forpliktende mål. I denne tilnærmingen, RNA av alle lengden og nukleotid er generert i vitro med T7 eller SP6 transkripsjon og herdet til en kort utfyllende oligonucleotide som inneholder biotin og foto-cleavable linker nederst 5' (trans konfigurasjon). Resulterende duplex blir brukt å rense personlige bindende proteiner eller macromolecular komplekser på streptavidin perler følger samme protokollen på RNA substrater som inneholder bilde-cleavable biotin knyttet covalently (cis konfigurasjon). Med denne endringen, kan Foto-cleavable biotin brukes sammen med i vitro generert utskrifter som inneholder hundrevis av nukleotider, utvide UV-elueringsrør metoden for rensing av et bredt utvalg av RNA/protein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

I mange år, blitt det eksepsjonelt sterke og raskt dannet samspillet mellom biotin og streptavidin ble benyttet for delvis rensing av biologisk viktig RNA/protein komplekser. Men denne strategien lider en stor ulempe som begrenser dens bredere utnyttelse: biotin/streptavidin samspillet kan brytes under denaturing som også forstyrre integriteten til eluted komplekser, dermed utelukker deres påfølgende funksjonell analyse og/eller ytterligere rensing med andre metoder. I tillegg er eluted prøvene ofte forurenset med bakgrunn proteiner som nonspecifically knytter streptavidin perler, kompliserer analyse av renset komplekser av sølv flekker og massespektrometri. For å overvinne disse begrensningene, vi utviklet en variant av biotin/streptavidin strategi som biotin er knyttet til en RNA substrat via et foto-cleavable linker og komplekser immobilisert på streptavidin perler er selektivt elut til løsningen i en opprinnelige form av langbølget UV, forlater bakgrunn proteiner på perlene. Kortere RNA bindende underlag kan syntetiseres kjemisk biotin og foto-cleavable linker covalently festet til 5 av de mens lengre RNA underlag kan leveres med de to gruppene av et utfyllende oligonucleotide. Disse to varianter av metoden UV-elueringsrør testet for rensing av U7 snRNP avhengig av behandling komplekser som cleave histone pre-mRNAs på 3 slutten og begge viste sammenligne gunstig til andre tidligere utviklet metoder for rensing. UV-elut prøvene inneholdt lett synlig mengder U7-snRNP som var uten større protein forurensninger og egnet for direkte analyse av massespektrometri og funksjonelle analyser. Metoden beskrevet kan lett tilpasses for rensing av andre RNA bindende komplekser og brukes sammen med single - og double-strandet DNA bindende for å rense DNA-spesifikke proteiner og macromolecular komplekser.

UV-elueringsrør metoden ble testet med to kjemisk syntetisert RNA underlag covalently festet på 5' slutten til pcB moiety (cis konfigurasjon): pcB-SL (figur 1) og pcB-dH3/5 m RNAs (figur 2). Den 31-nukleotid pcB-SL RNA inneholder en stilk-loop struktur etterfulgt av en 5-nukleotid enkelt strandet hale og sekvensen er identisk med 3 slutten av modne histone mRNA (dvs., etter i spalting av histone pre-mRNA av U7...

Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

RNA/protein komplekser renset med botin-streptavidin strategi er elut til løsningen under denaturing forhold i et skjema som er uegnet for ytterligere rensing og funksjonell analyse. Her beskriver vi en endring av denne strategien som benytter et foto-cleavable linker i RNA og en mild UV-elueringsrør trinn, gir native og funksjonell RNA/protein komplekser.

Enkeltsteg rensing av Macromolecular komplekser ved hjelp av RNA knyttet til Biotin og et foto-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Denne metoden bør være av interesse for forskere som prøver å isolere RNA proteinkomplekser og identifisere deres sammensetning ved massespektrometri. Vi tror vår protokoll vil være spesielt nyttig for å rense komplekser som finnes i celler i begrensede mengder og har en tendens til å ta avstand under lange flertrinns renseprosedyrer. Den største fordelen med denne metoden er at det innebærer bare en enkelt rensing trinn og kan brukes med RNA binding nettsteder av hvilken som helst lengde og sekvens.Demonstrere noen av trinnene vil være Xiao-cui Yang, som er en senior forskningstekniker i vår gruppe. For bindende steder betydelig lengre enn 65 nukleotider, få T7 generert RNA og en adapter PCB oligonucleotide som beskrevet i tekstprotokollen. Bland 20 picomoles av RNA med 100 picomoles av adapteren oligonucleotide i et 1,5 milliliter rør som inneholder 100 mikroliter bindingsbuffer.Legg røret i kokende vann og la det inkubere i 5 minutter. La deretter vannet avkjøles til romtemperatur. Første supplement 1 milliliter mus kjernefysisk ekstrakt med 80 millimolar EDTA ved pH 8 til en endelig konsentrasjon på 10 millimolar.Deretter legger du til mellom 5 og 10 picomoles av RNA-substratet som er merket med PCB-moiety. Inkuber på is i 5 minutter, og sørg for å blande prøven av og til. Deretter bruker du en forhåndskjølt mikrocentrifuge ved 4 grader Celsius for å sentrifugere blandingen ved 10 000 ganger g i 10 minutter for å fjerne eventuelle utfellinger.Samle forsiktig supernatanten inn i et nytt rør på is, samtidig som du er forsiktig med å unngå å overføre pelleten. Overfør ca 100 mikroliter streptavidin agarose perle suspensjon til en 1,5 milliliter tube. Tilsett ca 1 milliliter bindingsbuffer for å begynne å vaske perlene.Sentrifuger røret ved 25 ganger g i 2 til 3 minutter og aspirer overnatanten. Gjenta denne vaske- og sentrifugeringsprosessen 2 til 3 ganger for å likevekte perlene med bindingsbufferen. Last det tidligere innsamlede supernatant, som inneholder det monterte komplekset over de likeliberte perlene.Ved hjelp av en rørrotator roterer du røret i 1 time ved 4 grader Celsius for å immobilisere RNA og bundne komplekser på perlene. Neste spinn røret på 25 ganger g i 2 til 3 minutter for å samle perlene nederst på røret. Aspirer det overnaturante.Og skyll perlene to ganger med bindingsbuffer, ved hjelp av den tidligere beskrevne vaskeprosessen. Etter å ha fjernet overnatanten til den andre vasken, legg til 1 milliliter bindingsbuffer og roter prøven i 1 time ved 4 grader Celsius. Spinn ned prøven på 25 ganger g i 2 til 3 minutter.Deretter legger du til 1 milliliter bindingsbuffer og overfører suspensjonen til et nytt rør. Roter prøven ved 4 grader Celsius i opptil 1 time. Sentrifuger de immobiliserte kompleksene ved 25 ganger g i 2 til 3 minutter.Deretter aspirerer overnaturant, og tilsett 200 mikroliter bindingsbuffer. Overfør perlene til et 500 mikroliterrør. Slå på en HØY intensitet UV-lampe som avgir UV-lys på 365 nanometer og la den nå full glans.Fyll opp bunnen av en petriskål med tettpakket is som stabler den over fatets lokk. Virvle kort røret som inneholder de immobiliserte kompleksene. Legg den deretter horisontalt på isen og dekk den med den forvarmede lampen, og pass på at prøven er 2 til 3 centimeter fra pærens overflate.Bestråle prøven i totalt 30 minutter mens du ofte inverterer og virvler røret for å sikre jevn eksponering og for å forhindre overoppheting. Etter dette spinner du ned perlene ved 25 ganger g i 2 til 3 minutter og samler supernatanten. Sentrifuge denne supernatanten igjen ved hjelp av de samme forholdene.Samle den resulterende overnaturlige sørg for å forlate en liten mengde på bunnen av røret for å unngå å overføre eventuelle gjenværende perler. Ved hjelp av SDS-PAGE elektroforese, skille en brøkdel av UV eluted supernatant og tilsvarende brøkdel fra materialet igjen på perlene etter UV elution. Bruk deretter et kommersielt tilgjengelig fargesett i sølv for å beise gelen.Evaluer effektiviteten av UV-elution ved å sammenligne intensitetene av proteinene som finnes i UV-eluted supernatant og de som er igjen på perlene etter UV-bestråling. Avgift proteinbåndene av interesse og bestemme deres identiteter ved massespektrometri. Etter dette analyserer du direkte en brøkdel av UV-eluted supernatant av massespektrometri for å bestemme hele proteomet av det rensede materialet på en objektiv måte.I denne studien inkueres stem loop RNA med foto-cleavable biotin med 1 milliliter av et cytoplasmatisk S100 ekstrakt hentet fra mus myelomceller. Og effekten og effektiviteten av UV-elution analyseres av sølvfarging. En rekke proteiner oppdages på streptavidin perlene før UV-elution.Bestråling med langbølge UV frigjør bare noen av disse proteinene i supernatanten og etterlater en ikke-spesifikk bakgrunn på perlene. Dette understreker viktigheten av UV-elution trinnet. Massespektrometri identifiserer de store UV-eluted proteinene som 3'hExo og SLBP med SLBP representert av både proteinet i full lengde og en rekke kortere nedbrytningsprodukter.Mindre mengder andre proteiner identifisert som ulike RNA bindende proteiner også selektivt utgitt i oppløsning ved UV bestråling. UV-utlating av immobilisert Drosophila histone pre-mRNA tagget med foto-cleavable biotin inkubert med et kjernefysisk ekstrakt resulterte i en selektiv frigjøring av bare et lite antall proteiner i supernatant med en intens bakgrunn av ikke-spesifikke proteiner som gjenstår på perlene. Massespektrometri identifiserer disse proteinene for å være komponenter i U7 snRNP.De oppdages ikke i nærvær av behandling av konkurrenter som blokkerer binding av U7 snRNP til histone pre-mRNA. Det er viktig å bruke HØY intensitet UV-lampe og plassere den en nær avstand til bestrålt prøven samtidig som du sørger for at den ikke overopphetes. UV-elutionmetoden gir innfødte RNA-proteinkomplekser som mangler store forurensninger og er direkte egnet for ytterligere rensetrinn og funksjonelle analyser.Unngå øye- og hudeksponering under UV-bestråling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolering av beslektede RNA-proteinkomplekser fra celler under anvendelse av oligonukleotid-rettet Eluering

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Deteksjon og visualisering av DNA-skadeinducerte proteinkomplekser i suspensjoncellekulturer ved bruk av næringslysanalysen

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese for forbedret deteksjon av protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse av oversettelse innvielsen komplekse formasjon på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

En Oligonucleotide-baserte Tandem RNA isolasjon prosedyre å gjenopprette eukaryote mRNA Protein komplekser

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...