Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
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Agradecemos a nossos colegas e colaboradores para a sua contribuição ao nosso trabalho. Este estudo foi suportado pelo NIH conceder GM 29832.

1. os preparadores
Nota: Substratos de RNA menores que 65 ~ nucleotídeos podem ser sintetizados quimicamente com biotina (B) e o vinculador foto-cleavable (pc) (juntas conhecidas como foto-cleavable biotina ou pcB) covalentemente ligado à extremidade 5' do RNA (configuraçãocis ). Substratos de RNA contendo significativamente mais sítios de ligação precisam ser gerado em vitro pela transcrição T7 (ou SP6) e posteriormente recozido para do oligonucleotide curto adaptador...

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	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

O método descrito aqui é simples e, além disso incorporando um foto-cleavable vinculador e o passo de UV-eluição não difere os métodos comumente usados que tiram proveito da extremamente forte interação entre biotina e estreptavidina. A etapa de eluição de UV é muito eficiente, normalmente, liberando mais de 75% do RNA imobilizado e associados a proteínas de estreptavidina missanga, deixando para trás um fundo elevado de proteínas que se ligam não específica para as contas. Eliminando este pano de fundo,...

Em eucariontes, precursores do RNA polimerase II-gerado mRNA (pre-mRNAs) submeter-se a vários eventos de maturação no núcleo antes de se tornar totalmente funcional modelos de mRNA para síntese de proteínas no citoplasma. Um desses eventos é o processamento de final 3'. Para a grande maioria dos pre-mRNAs, processamento de final 3' envolve a clivagem acoplada a poliadenilação. Esta reação em duas fases é catalisada por um complexo relativamente abundante constituído por mais de 15 proteínas1. Animais de replicação dependente de histona pre-mRNAs são processados na extremidade 3' por um mecanismo diferente em que o papel principal é interpretado por U7 snRNP, uma baixa abundância complexa consistindo de snRNA U7 de ~ 60 nucleotídeos e várias proteínas2,3 . Os pares de bases de snRNA U7 com uma sequência específica na histona pre-mRNA e uma das subunidades da snRNP U7 catalisa a reação de clivagem, gerando histona madura mRNA sem um poli da cauda. 3' processamento de final de histona pre-mRNA também requer hairpin Loop ligação proteína (SLBP), que vincula um conservado Hairpin loop localizado a montante do local clivagem e melhora o recrutamento da snRNP U7 ao substrato2,3. Estudos que visam identificar os componentes individuais da snRNP U7 tem sido desafiadoras devido a baixa concentração do U7 snRNP em células animais e a tendência do complexo para dissociar ou sofrer proteólise parcial durante a purificação devido à utilização de detergentes suaves4,5,6, lavagens de sal elevadas e/ou múltiplas etapas cromatográficas7,8,9.
Recentemente, para determinar a composição das máquinas processamento U7-dependente, um pequeno fragmento de biotina contendo de histona pre-mRNA em 3' ou 5' foi incubado com um extrato nuclear e os complexos montados foram capturados na streptavidin-revestido agarose grânulos5,6,10. Devido a excepcionalmente forte interação entre biotina e estreptavidina, proteínas imobilizadas em grânulos streptavidin foram eluídas sob condições de desnaturação por ebulição em SDS e analisadas por coloração de prata e espectrometria de massa. Enquanto essa abordagem simples identificou uma série de componentes da snRNP U7, isso rendeu amostras relativamente brutas, muitas vezes contaminadas com um grande número de proteínas de fundo nonspecifically acoplado a grânulos de estreptavidina, potencialmente, mascarando alguns componentes do as máquinas de processamento e impedindo a sua detecção a prata manchada géis5,6,10. Importante, esta abordagem também impedida qualquer estudos funcionais com o material isolado e sua depuração adicional a homogeneidade por métodos adicionais.
Foram propostas várias modificações ao longo do tempo para abordar a natureza praticamente irreversível da biotina/estreptavidina interação, com a maioria deles sendo projetado ou enfraquecer a interação ou para fornecer um braço quimicamente cleavable espaçador na Biotina-contendo reagentes11,12. O lado negativo de todas essas modificações foi que eles reduzem significativamente a eficiência do método e/ou condições não-fisiológicas, muitas vezes exigidas durante a etapa de eluição, pondo em risco a integridade ou a atividade das proteínas purificadas.
Aqui, descrevemos uma abordagem diferente para resolver o problema inerente da biotina/estreptavidina estratégia usando o RNA de substratos em que biotina está covalentemente ligada à 5' acabam através de uma foto-cleavable 1-(2-nitrofenil) moiety etílico que é sensível a onda longa UV13,14. Nós testamos esta abordagem para a purificação do mecanismo de processamento do limitante U7-dependente da drosófila e mamíferos nuclear extrai15. Após uma incubação curta de biotina contendo de histona pre-mRNA e o vinculador foto-cleavable com um extrato nuclear, os complexos de processamento montados são imobilizados em grânulos streptavidin, cuidadosamente lavados e lançados suavemente a solução em um nativo formulário pela exposição à luz de ~ 360 nm UV. O método de eluição de UV é muito eficiente, rápido e simples, produzindo quantidades suficientes da snRNP U7 Visualizar seus componentes por tira mancha de tão pouco como 100 µ l de extracto de15. O material UV-eluída é livre de proteínas de fundo e adequados para análise de espectrometria de massa direta, as etapas de purificação adicional e ensaios enzimáticos. O mesmo método pode ser adoptado para a purificação de outros complexos de RNA/proteína que exigem relativamente curtos locais obrigatórios de RNA. Biotina e o foto-cleavable vinculador também podem ser ligado covalentemente ligados para single - e ADN double-stranded, potencialmente estendendo-se o método de eluição de UV para a purificação de vários complexos de DNA/proteínas.
Síntese química de substratos de RNA contendo covalentemente ligados a biotina e o vinculador foto-cleavable é prático apenas com as sequências que não excedam ~ 65 nucleotídeos, tornando-se caro e ineficiente para sequências significativamente mais tempo. Para resolver este problema, desenvolvemos também uma abordagem alternativa que é adequada para alvos de ligação de RNA muito mais tempo. Nesta abordagem, RNA de qualquer sequência de comprimento e o nucleotídeo é gerado em vitro pela transcrição T7 ou SP6 e recozido para um curtas do oligonucleotide complementar que contém biotina e o foto-cleavable vinculador na extremidade 5' (trans configuração). O duplex resultante é posteriormente usado para purificar proteínas individuais ou complexos macromoleculares em grânulos streptavidin seguindo o mesmo protocolo descrito para os substratos de RNA contendo biotina foto-cleavable ligada covalentemente (cis configuração). Com essa modificação, a foto-cleavable biotina pode ser usada em conjunto com transcrições em vitro gerado contendo centenas de nucleotídeos, estendendo-se o método de eluição de UV para a purificação de uma ampla gama de RNA/proteína.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

Por muitos anos, a interação excepcionalmente forte e rapidamente formada entre biotina e streptavidin tem sido utilizada com sucesso para a purificação parcial de complexos de RNA/proteínas biologicamente importantes. No entanto, esta estratégia sofre uma grande desvantagem que limita a sua utilização mais ampla: a interação de biotina/estreptavidina pode ser quebrada apenas sob desnaturação condições que também interrompem a integridade dos complexos eluted, portanto, impedindo sua subsequente análise funcional e/ou purificação mais por outros métodos. Além disso, as amostras eluted são frequentemente contaminadas com as proteínas de fundo que associam nonspecifically com grânulos de estreptavidina, complicando a análise dos complexos purificadas pela coloração prata e espectrometria de massa. Para superar essas limitações, nós desenvolvemos uma variante da biotina/estreptavidina estratégia em que biotina é ligada a um substrato de RNA através de um foto-cleavable vinculador e os complexos imobilizados em grânulos streptavidin são seletivamente eluídos a solução em um forma nativa por ondas longas UV, deixando as proteínas de fundo sobre os grânulos. Substratos de ligação de RNA mais curtos podem ser sintetizados quimicamente com biotina e o foto-cleavable vinculador covalentemente ligado à extremidade 5' do RNA, Considerando que mais substratos de RNA podem ser fornecidos com os dois grupos por do oligonucleotide complementar. Estas duas variantes do método UV-eluição foram testados para a purificação dos complexos processamento de U7 snRNP-dependente que cleave histona pre-mRNAs na extremidade 3' e ambos provaram comparar favoravelmente com outros anteriormente desenvolvido métodos de purificação. As amostras de UV-eluída continham quantidades prontamente detectáveis da snRNP U7 que era livre de contaminantes de proteína maior e adequado para análise direta por espectrometria de massa e ensaios funcionais. O método descrito pode ser facilmente adaptado para a purificação de outros complexos de ligação de RNA e usado em conjunto com sites de single e double-stranded DNA ligando para purificar DNA específicas proteínas e complexos macromoleculares.

O método UV-eluição foi testado com dois substratos de RNA sintetizados quimicamente ligados covalentemente na extremidade 5' para o agrupamento de pcB (configuraçãocis ): pcB-SL (Figura 1) e RNAs pcB-dH3/5 m (Figura 2). O pcB 31-nucleotide-SL RNA contém uma estrutura de Hairpin loop, seguida de uma 5-nucleotídeo única encalhada cauda e sua sequência é idêntica à extremidade 3' de histona madura mRNA (i. ...

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Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Complexos de RNA/proteínas purificados usando estratégia botin-streptavidin são eluídos a solução sob condições de desnaturação de forma inadequada para mais de purificação e análise funcional. Aqui, descrevemos uma modificação desta estratégia que utiliza um foto-cleavable vinculador em RNA e um passo de UV-eluição suave, produzindo complexos de RNA/proteína nativos e totalmente funcionais.

Purificação de etapa única de complexos macromoleculares usando RNA ligado à biotina e um foto-cleavable vinculador

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Esse método deve ser de interesse para pesquisadores que estão tentando isolar complexos proteicos de RNA e identificar sua composição por espectrometria de massa. Acreditamos que nosso protocolo será especialmente útil para purificar complexos que existem em células em quantidades limitadas e tendem a dissociar durante longos procedimentos de purificação em várias etapas. A principal vantagem deste método é que ele envolve apenas uma única etapa de purificação e poderia ser usado com locais de ligação de RNA de qualquer comprimento e sequência.Demonstrando alguns dos passos será Xiao-cui Yang, que é um técnico sênior de pesquisa em nosso grupo. Para sites de vinculação significativamente maiores que 65 nucleotídeos, obtenha RNA gerado por T7 e um oligonucleotídeo pcb adaptador conforme descrito no protocolo de texto. Misture 20 picomoles do RNA com 100 picomoles do oligonucleotídeo adaptador em um tubo de 1,5 mililitro contendo 100 microliters de tampão de ligação.Coloque o tubo em água fervente e deixe incubar por 5 minutos. Em seguida, deixe a água esfriar até a temperatura ambiente. Primeiro suplemento 1 mililitro de extrato nuclear de rato com 80 mililitros EDTA no pH 8 para uma concentração final de 10 mililitros.Em seguida, adicione entre 5 e 10 picomoles do substrato RNA que foi marcado com o pcb moiety. Incubar no gelo por 5 minutos, certificando-se de misturar ocasionalmente a amostra. Em seguida, use um microcentrifuge pré-resfriado a 4 graus Celsius para centrifugar a mistura a 10.000 vezes g por 10 minutos para remover eventuais precipitados.Colete cuidadosamente o supernatante em um novo tubo no gelo, enquanto tome cuidado para evitar a transferência da pelota. Transfira aproximadamente 100 microliters de streptavidin agarose bead suspensão para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione aproximadamente 1 mililitro de tampão de ligação para começar a lavar as contas.Centrifugar o tubo a 25 vezes g por 2 a 3 minutos e aspirar o supernasal. Repita este processo de lavagem e centrifugação de 2 a 3 vezes para equilibrar as contas com o buffer de ligação. Carregue o supernante coletado anteriormente, que contém o complexo montado sobre as contas equilibradas.Usando um rotador de tubo, gire o tubo por 1 hora a 4 graus Celsius para imobilizar o RNA e enloucotado nas contas. Em seguida, gire o tubo a 25 vezes g por 2 a 3 minutos para coletar as contas na parte inferior do tubo. Aspire o supernatante.E enxágüe as contas duas vezes com tampão de ligação, usando o processo de lavagem descrito anteriormente. Depois de remover o supernascimento da segunda lavagem, adicione 1 mililitro de tampão de ligação e gire a amostra por 1 hora a 4 graus Celsius. Gire a amostra a 25 vezes g por 2 a 3 minutos.Em seguida, adicione 1 mililitro de tampão de ligação e transfira a suspensão para um novo tubo. Gire a amostra a 4 graus Celsius por até 1 hora. Centrifugar os complexos imobilizados a 25 vezes g por 2 a 3 minutos.Em seguida, aspirar supernascer e adicionar 200 microliters de tampão de ligação. Transfira as contas para um tubo de 500 microliter. Ligue uma lâmpada UV de alta intensidade que emite luz UV a 365 nanômetros e permita que ela atinja o brilho total.Encha o fundo de uma placa de Petri com gelo bem embalado empilhando-o sobre a tampa do prato. Brevemente vórtice do tubo contendo os complexos imobilizados. Em seguida, coloque-o horizontalmente sobre o gelo e cubra-o com a lâmpada pré-aquecida, certificando-se de que a amostra está a 2 a 3 centímetros da superfície da lâmpada.Irradie a amostra por um total de 30 minutos, invertendo e vórtice com frequência o tubo para garantir a exposição uniforme e evitar o superaquecimento. Depois disso, gire as contas a 25 vezes g por 2 a 3 minutos e colete o supernatante. Centrifugar este supernatante mais uma vez usando as mesmas condições.Colete o supernante resultante certificando-se de deixar uma pequena quantidade na parte inferior do tubo para evitar a transferência de quaisquer contas residuais. Usando eletroforese SDS-PAGE, separe uma fração do supernanato elucido UV e a fração correspondente do material deixado nas contas após a eluição uv. Em seguida, use um kit de coloração de prata comercialmente disponível para manchar o gel.Avalie a eficiência da elução UV comparando as intensidades das proteínas presentes no supernanato elucido UV e as deixadas nas contas após a irradiação UV. Extirpe as faixas de proteína de interesse e determine suas identidades por espectrometria de massa. Depois disso, analise diretamente uma fração do supernante UV elucido por espectrometria de massa para determinar todo o proteome do material purificado de forma imparcial.Neste estudo, o RNA de alça-tronco marcado com biotina foto-cleavável é incubado com 1 mililitro de um extrato citoplasmado S100 obtido a partir de células de mieloma de camundongos. E o efeito e eficiência da elução UV é analisado pela coloração de prata. Uma série de proteínas são detectadas nas contas de streptavidina antes da eluição UV.A irradiação com UV de ondas longas libera apenas algumas dessas proteínas no supernante deixando um fundo não específico sobre as contas. Isso enfatiza a importância da etapa de eluição UV. A espectrometria de massa identifica as principais proteínas elucidadas UV como 3'hExo e SLBP com SLBP sendo representado tanto pela proteína de comprimento completo quanto por uma série de produtos de degradação mais curtos.Quantidades menores de outras proteínas identificadas como várias proteínas de ligação de RNA também foram seletivamente liberadas em solução pela irradiação UV. A elução UV de histona de drosophila imobilizada pre-mRNA marcada com biotina foto-cleavável incubada com um extrato nuclear resultou em uma liberação seletiva de apenas um pequeno número de proteínas no sobrenante com um intenso fundo de proteínas não específicas remanescentes nas contas. A espectrometria de massa identifica essas proteínas como componentes do U7 snRNP.Eles não são detectados na presença de concorrentes de processamento que bloqueiam a vinculação do U7 snRNP ao histone pré-mRNA. É importante usar lâmpada UV de alta intensidade e colocá-la a uma distância próxima à amostra irradiada, ao mesmo tempo em que certifica-se de que ela não superaquece. O método de elução UV produz complexos proteicos RNA nativos que não possuem contaminantes importantes e são diretamente adequados para etapas adicionais de purificação e ensaios funcionais.Evite a exposição aos olhos e à pele durante a irradiação UV.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Bioquímica

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

Um procedimento de isolamento de RNA em Tandem do Oligonucleotide-baseado para recuperar complexos mRNA-proteínas eucariotas

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...