Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Мы благодарим наших коллег и партнеров за их вклад в нашу работу. Это исследование было поддержано NIH Грант GM 29832.

1. Подготовка основания
Примечание: Короче, чем ~ 65 нуклеотидов РНК подложки может быть синтезирован химически с фото горные (pc) компоновщик (вместе именуемые как фото горные биотина или ПХД) ковалентно придает РНК 5' конца (СНГ конфигурация) и биотин (B). Субстраты РНК, со?...

<ol>
	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

Метод, описанный здесь является простой и помимо включения фото горные компоновщика и УФ элюции шаг не отличаются от используемых методов, которые принимают преимущество чрезвычайно сильное взаимодействие между биотина и стрептавидина. УФ элюции шаг является очень эффективным, обычн...

В эукариот РНК-полимераза II генерируемые мРНК прекурсоров (пре мРНК) проходят несколько событий созревания в ядре прежде чем стать полностью функциональной мРНК шаблоны для синтеза белка в цитоплазме. Одно из этих событий является 3' конца обработки. Для подавляющего большинства из пре мРНК 3' конца обработка включает расщепления в сочетании с сплайсингу. Эта реакция двухэтапный катализируемой относительно обильные комплекс состоящий из более чем 15 белки1. В конце 3' животных зависит от репликации гистона пре мРНК обрабатываются другим механизмом, в которой ключевую роль играет U7 snRNP, низкие изобилии комплекс, состоящий из U7 мяРНК ~ 60 нуклеотидов и несколько белки2,3 . U7 мяРНК низкопробных пар с определенной последовательности гистона пре мРНК и одним из подразделений U7 snRNP катализирует реакцию расщепления, генерации Зрелые гистона мРНК без poly(A) хвост. 3' конца обработка гистона пре мРНК также требует стволовых-петля привязки белка (SLBP), которая связывает сохранение стволовых петля расположен выше по течению от расщепления сайта и повышает вербовки U7 snRNP субстрат2,3. Исследования, направленные на выявление отдельных компонентов U7 snRNP были сложной из-за низкой концентрации U7 snRNP в животных клетках и тенденция комплекса отмежеваться или проходят частичное протеолиза во время очистки в результате использования мягкий моющих средств4,5,6, высокая соли моет и/или несколько хроматографического шаги7,8,9.
Недавно чтобы определить состав механизма обработки зависящих от U7, короткий фрагмент гистона пре мРНК содержащие биотин на 3 или 5' был инкубировали с ядерной экстракта и собрал комплексы были захвачены на стрептавидина покрытием агарозы бусины5,6,10. Благодаря исключительно сильное взаимодействие между биотина и стрептавидина белки, иммобилизованных на стрептавидина бусины были этого eluted под денатурации условий путем кипячения в ПБ и проанализированы Серебряные пятная и масс-спектрометрии. Хотя этот простой подход был выявлен ряд компонентов U7 snRNP, она дала относительно сырой образцы, часто загрязненные большое количество белков фон nonspecifically обязан стрептавидина бусы, потенциально маскировать некоторые компоненты Оборудование обработки и предотвращения их обнаружения на серебро витражные гели5,6,10. Важно отметить, что этот подход также исключается какие-либо функциональные исследования с изолированной материала и его дальнейшей очистки до однородности дополнительные методы.
Был предложен ряд изменений с течением времени для решения практически необратимый характер взаимодействия биотина/стрептавидина, с большинством из них разрабатывается либо ослабить взаимодействия или предоставлять химически горные распорку руку в биотин содержащих реагентов11,12. Недостаток всех этих изменений был, что они значительно снижают эффективность метод или часто требуется-физиологические условия во время шага элюции, ставит под угрозу целостность или активность очищенных белков.
Здесь мы описываем другой подход для решения проблемы присущие биотина/стрептавидина стратегии с помощью РНК субстратах, в которых биотина ковалентно прилагается к 5' конца через фото горные 1-(2-нитрофенил) этилового остаток, который чувствителен к длиной волны УФ13,14. Мы протестировали этот подход для очистки ограничения механизма обработки U7 зависящих от дрозофилы и млекопитающих ядерной извлекает15. После короткого инкубационного гистона пре мРНК содержащие биотин и фото горные компоновщик с ядерной экстракт собранный обработки комплексы иммобилизованных на стрептавидина бусы, тщательно промывают и аккуратно выпустила решение в родной форма под воздействием ~ 360 Нм УФ света. УФ элюции метод очень эффективный, быстрый и простой, давая достаточное количество U7 snRNP, чтобы визуализировать его компоненты ленты, окрашивания как 100 мкл экстракт15. Материал этого eluted УФ бесплатно фон белков и подходит для анализа прямых масс-спектрометрии, дополнительной очистки шагов и ферментативные анализов. Тот же метод может быть принят для очистки других РНК/белковых комплексов, которые требуют относительно короткий сайтов связывания РНК. Биотин и фото горные Компоновщик может быть ковалентно присоединен к одно - и двуцепочечной ДНК, потенциально расширения УФ элюции метод для очистки различных комплексов ДНК/белок.
Химический синтез РНК субстраты, содержащие ковалентно придает биотина и фото горные компоновщик практических только с последовательностей, не превышающие ~ 65 нуклеотидов, становится дорогим и неэффективным для значительно более последовательностей. Для решения этой проблемы, мы также разработали альтернативный подход, который подходит для гораздо больше РНК цели привязки. В этом подходе РНК любой длины и нуклеотидной последовательности является созданный в пробирке , транскрипции T7 или SP6 и отжигом для нескольких взаимодополняющих олигонуклеотида, содержащий биотина и фото горные компоновщика в конце 5' (транс Конфигурация). Результирующая дуплекс впоследствии используется для очистки отдельных связывания белков или макромолекулярных комплексов на стрептавидина бусы после тот же протокол, описанные для РНК субстраты, содержащие фото горные биотин, придает ковалентно (СНГ конфигурации). С этой модификации фото горные биотина может использоваться в сочетании с в пробирке создан стенограммы, содержащих сотни нуклеотидов, расширяя УФ элюции метод для очистки из широкого диапазона РНК/белков.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

На протяжении многих лет исключительно сильное и быстро формируется взаимодействие между биотина и стрептавидина успешно использовались для частичная очистка биологически важных РНК/белковых комплексов. Однако, эта стратегия страдает от одной основной недостаток, который ограничивает его широкого использования: биотин/стрептавидина взаимодействие может быть нарушена только при денатурации условий, которые также нарушают целостность eluted комплексов, следовательно исключающие их последующие функционального анализа и/или дальнейшей очистки другими методами. Кроме того образцы eluted часто загрязнены фон белки, связывающие nonspecifically с бисером стрептавидина, осложняет анализ комплексов очищенный Серебряный пятнать и масс-спектрометрии. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали вариант биотина/стрептавидина стратегии, в котором биотина прилагается к РНК субстрата через фото горные компоновщика и комплексы, иммобилизованных на стрептавидина бусины выборочно этого eluted решение в родной форме длинней волны УФ, оставив белки фон на бисер. Короткие РНК привязки субстратов могут быть синтезированы химически с биотина и фото горные компоновщик ковалентно прилагается к 5' концу РНК, тогда как дольше субстратов РНК могут быть предоставлены с двумя группами взаимодополняющих олигонуклеотида. Эти два варианта метода УФ элюции были протестированы для очистки U7 snRNP зависимых обработки комплексов, которые прилепится гистона пре мРНК в конце 3', и они оба оказались выгодно для других ранее развитых методов очищения. Образцы этого eluted УФ содержатся легко обнаружить количество U7 snRNP, который был свободным от крупных белковых загрязнений и подходит для прямого анализа по масс-спектрометрии и функциональных анализов. Описан метод можно легко адаптированы для очистки других комплексов связывания РНК и используется в сочетании с одно - и двуцепочечной ДНК привязки сайтов для очистки ДНК специфических белков и макромолекулярных комплексов.

УФ элюции метод был протестирован с двумя химически синтезированных РНК субстратов ковалентно придает в конце 5' группу ПХД (СНГ конфигурация): pcB-SL (рис. 1) и ПХД dH3/5 м РНК (рис. 2). PcB-SL 31-нуклеотидов РНК содержит стволовые циклической ст...

Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

РНК/белковых комплексов, очищенная с помощью Ботин стрептавидина стратегии являются этого eluted решение под денатурируя условия в форме неподобающе для дальнейшей очистки и функционального анализа. Здесь мы описываем изменения этой стратегии, которая использует фото горные компоновщика в РНК и нежный УФ элюции шаг, уступая родной и полностью функциональный РНК/белковых комплексов.

Single-step очистка макромолекулярных комплексов с помощью РНК, биотин и фото горные компоновщика

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Этот метод должен быть интересом для исследователей, которые пытаются изолировать рнк белковых комплексов и определить их состав по масс-спектрометрии. Мы считаем, что наш протокол будет особенно полезен для очистки комплексов, которые существуют в клетках в ограниченных количествах и, как правило, разобщаются во время длительных многоступенчатых процедур очистки. Основным преимуществом этого метода является то, что он включает в себя только один шаг очистки и может быть использован с РНК связывающих сайтов любой длины и последовательности.Демонстрация некоторых шагов будет Сяо-куй Ян, который является старшим научным специалистом в нашей группе. Для связывающих участков, значительно более 65 нуклеотидов, получите РНК, генерируемую T7, и адаптер oligonucleotide PCB, как указано в текстовом протоколе. Смешайте 20 пикомолов РНК со 100 пикомолами олигонуклеотида адаптера в 1,5 миллилитровой трубке, содержащей 100 микролитров связывающего буфера.Поместите трубку в кипящую воду и дайте ей инкубировать в течение 5 минут. Затем дайте воде остыть до комнатной температуры. Первая добавка 1 миллилитр ядерного экстракта мыши с 80 миллимолярной ЭДТА при рН 8 до конечной концентрации 10 миллимолей.Затем добавьте от 5 до 10 пикомолов РНК-субстрата, который был помечен с PCB moiety. Инкубировать на льду в течение 5 минут, убедившись, что иногда смешивать образец. Затем используйте предварительно охлажденный микроцентрифуг при 4 градусах Цельсия, чтобы центрифугировать смесь при 10 000 раз г в течение 10 минут, чтобы удалить любые потенциальные осадки.Тщательно соберите супернатант в новую трубку на льду, при этом будьте осторожны, чтобы избежать передачи гранул. Перенесите около 100 микролитров подвески streptavidin agarose bead в 1,5 миллилитровую трубку. Добавьте приблизительно 1 миллилитр связывающего буфера, чтобы начать мыть бисер.Центрифуга трубки в 25 раз г в течение 2 до 3 минут и аспирировать супернатант. Повторите этот процесс стирки и центрифугации 2-3 раза, чтобы уравночные бусы с связывающим буфером. Загрузите ранее собранный супернатант, который содержит собранный комплекс над уравновешенными бусинами.Используя трубчатый ротатор, поверните трубку в течение 1 часа при 4 градусах по Цельсию, чтобы обездвижить РНК и связанные комплексы на бисер. Далее спина трубки в 25 раз г в течение 2 до 3 минут, чтобы собрать бисер в нижней части трубки. Аспирировать супернатанта.И промыть бисер дважды с обязательным буфером, используя ранее описанный процесс стирки. После удаления супернатанта второй стирки добавьте 1 миллилитр связывающего буфера и поверните образец на 1 час при 4 градусах по Цельсию. Спин вниз образца в 25 раз г в течение 2 до 3 минут.Затем добавьте 1 миллилитр связывающего буфера и перенесите подвеску в новую трубку. Поверните образец при 4 градусах по Цельсию на срок до 1 часа. Центрифугировать обездвиженые комплексы 25 раз г в течение 2-3 минут.Затем аспирировать супернатант, и добавить 200 микролитров связывающего буфера. Перенесите бисер в 500 микролитровую трубку. Включите ультрафиолетовую лампу высокой интенсивности, которая излучает УФ-излучение на 365 нанометров и позволяет ему достичь полного блеска.Заполните дно чашки Петри плотно упакованным льдом, укладыв ее на крышку тарелки. Кратко вихрь трубки, содержащей обездвиженые комплексы. Затем поместите его горизонтально на лед и накройте его предварительно разогретой лампой, убедившись, что образец составляет от 2 до 3 сантиметров от поверхности лампы.Облучать образец в общей сложности 30 минут, часто инвертирование и вихревые трубки для обеспечения равномерного воздействия и предотвращения перегрева. После этого, спина вниз бусы на 25 раз г в течение 2 до 3 минут и собирать супернатант. Центрифуга этого супернатанта еще раз с использованием тех же условий.Соберите полученный супернатант убедившись, что оставить небольшое количество в нижней части трубки, чтобы избежать передачи каких-либо остаточных шариков. Используя электрофорез SDS-PAGE, отделяйте долю УФ-элетатного супернатанта и соответствующую фракцию от материала, останого на бисере после УФ-элюции. Далее используйте коммерчески доступные серебряные окрашивания комплект для окрашивания геля.Оцените эффективность УФ-элюции, сравнив интенсивности белков, присутствующих в УЛЬТРА элатенанте, и тех, которые остались на бисере после уф-облучения. Акциз белковых полос, представляющих интерес и определить их идентичность по масс-спектрометрии. После этого напрямую проанализируйте фракцию уф-надутого супернатанта с помощью масс-спектрометрии, чтобы объективно определить весь протеом очищенного материала.В этом исследовании, рнк стволовой петли помечены фото-расщепляемый биотин инкубируется с 1 миллилитр цитоплазмической S100 экстракт, полученный из клеток миеломы мышей. А эффект и эффективность УФ-элюции анализируется с помощью окрашивания серебра. Ряд белков обнаруживается на стрептавидиновых бусинках перед УФ-элюционом.Облучение длинной волной УФ высвобождает только некоторые из этих белков в супернатант, оставляя неспецифический фон на бисере. Это подчеркивает важность шага УФ-элюции. Масс-спектрометрия определяет основные ультрафиолетовые элевные белки как 3'hExo и SLBP с SLBP представлены как белка полной длины и ряд более коротких продуктов деградации.Меньшее количество других белков, идентифицированных как различные рнк связывающие белки, также выборочно высвобождается в раствор путем УФ-облучения. УФ-элевации обездвиженных Drosophila histone предварительно мРНК помечены фото-расщепляемый биотин инкубируется с ядерным экстрактом привело к селективного выпуска лишь небольшое количество белков в супернатант с интенсивным фоном неспецифических белков, оставшихся на бисере. Масс-спектрометрия определяет эти белки как компоненты SnRNP U7.Они не обнаруживаются в присутствии конкурентов по обработке, которые блокируют привязку U7 snRNP к histone pre-mRNA. Важно использовать ультрафиолетовую лампу высокой интенсивности и поместить ее на близкое расстояние до облученной образца, а также убедиться, что она не перегревается. Метод УФ-элуции дает местные белковые комплексы РНК, которые не имеют основных загрязняющих веществ и непосредственно подходят для дополнительных шагов очистки и функциональных анализов.Избегайте воздействия на глаз и кожу во время уф-облучения.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Выделение родственным РНК-белковых комплексов из клеток с использованием направленного на олигонуклеотиды элюция

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Горизонтальный гель-электрофорез для расширенного обнаружения комплексов протеин-РНК

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting анализ перевода инициации комплекс формирования на Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

Процедура изоляции на основе олигонуклеотида тандем РНК для восстановления эукариотические мРНК белковых комплексов

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...