Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
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Agradecemos a nuestros colegas y colaboradores por su contribución a nuestro trabajo. Este estudio fue apoyado por los NIH otorgan GM 29832.

1. preparación del sustrato
Nota: Sustratos de RNA menos de ~ 65 nucleótidos pueden ser sintetizados químicamente con biotina (B) y el vinculador foto escindibles (pc) (conjuntamente denominado foto escindibles biotina o pcB) covalentemente unida al RNA 5' final (configuracióncis ). Sustratos de RNA que contiene significativamente más sitios de Unión deben ser generados en vitro por transcripción T7 (o SP6) y posteriormente recocido a un oligonucleótido corto adaptador ...

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	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

El método descrito aquí es sencillo y además incorporando a un enlazador foto escindibles y el paso de rayos UV-elución no difiere de los métodos utilizados que se aprovechan de la fuerte interacción entre biotina y estreptavidina. El paso de rayos UV-elución es muy eficiente, liberando por lo general más del 75% de lo ARN inmovilizado y proteínas de granos de estreptavidina, dejando atrás un alto fondo de proteínas que se unen no específicamente a las cuentas asociadas. Mediante la eliminación de este fondo...

En eucariotas, precursores de ARN polimerasa II genera ARNm (pre-mRNAs) se someten a varios eventos de maduración en el núcleo antes de ser completamente funcional plantillas de mRNA para la síntesis de proteínas en el citoplasma. Uno de estos eventos es el 3' final de procesamiento. Para la mayoría de los pre-mRNAs, 3' extremo proceso de elaboración es escote juntada a poliadenilación. Esta reacción de dos etapas es catalizada por un complejo relativamente abundante que consta de más de 15 proteínas1. Histona dependiente de replicación animal pre-mRNAs se procesan en el extremo 3' por un mecanismo diferente en la que el papel es interpretado por U7 RNPnp, una abundancia baja compleja de U7 snRNA de ~ 60 nucleótidos y múltiples proteínas2,3 . El snRNA U7 de pares de bases con una secuencia específica de pre-mRNA de la histona y una de las subunidades de la U7 RNPnp cataliza la reacción de hendidura, generación madura histona mRNA sin un poly(A) cola. 3' procesamiento del pre-mRNA de la histona también requiere lazo del vástago vinculante proteínas (SLBP), que se une un conservado-lazo del vástago situado aguas arriba del sitio de clivaje y aumenta la contratación de la RNPnp U7 al substrato2,3. Estudios destinados a identificar los componentes individuales de la U7 RNPnp han sido difíciles debido a la baja concentración de la RNPnp U7 en las células animales y la tendencia del complejo disociar o experimentan proteólisis parcial durante la purificación como resultado del uso detergentes suaves4,5,6, lavados de sal alta o múltiples pasos cromatográficos7,8,9.
Recientemente, para determinar la composición de la maquinaria de procesamiento de U7-dependiente, un fragmento corto de la biotina que contiene de pre-mRNA de histona 3' o 5' fue incubado con un extracto nuclear y los complejos armados fueron capturados en recubiertas de estreptavidina perlas de agarosa5,6,10. Debido a la interacción excepcionalmente fuerte entre biotina y estreptavidina, proteínas inmovilizadas en perlas de estreptavidina fueron eluidas bajo desnaturalizar condiciones hirviendo en SDS y analizadas por plata y espectrometría de masas. Mientras que este enfoque simple identifica un número de componentes de la U7 RNPnp, rindió muestras relativamente crudas, a menudo contaminadas con un gran número de proteínas de fondo un limitado a cuentas de estreptavidina, potencialmente enmascarar algunos de los componentes de la maquinaria de procesamiento y evitar su detección en la plata mancharon geles5,6,10. Lo importante, este enfoque también imposibilitó cualquier estudios funcionales con el material aislado y su posterior purificación a homogeneidad por otros métodos.
Se propusieron una serie de modificaciones con el tiempo para abordar la naturaleza prácticamente irreversible de la interacción de la biotina/estreptavidina, con la mayoría de ellos están diseñados para debilitar tanto la interacción o para proporcionar un brazo espaciador químicamente escindibles en la biotina-contener reactivos11,12. La desventaja de estas modificaciones fue que reducen significativamente la eficiencia del método o condiciones no fisiológicas a menudo requeridas durante la etapa de elución, poniendo en peligro la integridad o la actividad de las proteínas purificadas.
Aquí, describimos un enfoque diferente para resolver el problema inherente de la estrategia de biotina/estreptavidina utilizando RNA sustratos que biotina se une covalentemente a los 5' extremo a través de una foto escindibles 1-(2 nitrofenil) molécula de etilo que es sensible a la onda larga UV13,14. Hemos probado este enfoque para la purificación de la maquinaria de procesamiento de U7-dependiente limitante de Drosophila y mamíferos nuclear extractos de15. Tras una breve incubación de biotina que contiene de pre-ARNm de histonas y el vinculador foto divisible con un extracto nuclear, los complejos de procesamiento montado son inmovilizados en perlas de estreptavidina, bien lavados y lanzó suavemente a la solución en un nativo se forman por la exposición a la luz de ~ 360 nm UV. El método de elución de la UV es muy eficiente, rápido y sencillo, produciendo una cantidad suficiente de la RNPnp U7 para visualizar sus componentes por astilla, manchas de tan poco como 100 μl del extracto de15. El material eluyó UV está libre de proteínas del fondo y adecuado para el análisis de espectrometría de masas en directo, pasos de purificación adicionales y ensayos enzimáticos. Se puede adoptar el mismo método para la purificación de otros complejos de RNA/proteína que requieren relativamente pocos sitios de unión de la RNA. Biotina y el vinculador foto escindibles pueden también covalente sujetarse a solo - y doble cadena ADN, potencialmente extender el método de elución de UV para la purificación de diversos complejos DNA/proteína.
Síntesis química de sustratos de RNA que contienen covalentemente había unido a biotina y el vinculador foto escindibles es práctico solamente con las secuencias que no superan los nucleótidos ~ 65, ser costoso e ineficiente para secuencias mucho más largas. Para solucionar este problema, también hemos desarrollado un enfoque alternativo que es conveniente para más objetivos vinculantes de RNA. En este enfoque, ARN de cualquier secuencia de la longitud y el nucleótido es generada en vitro por transcripción T7 o SP6 y recocido a un corto oligonucleótido complementario que contiene biotina y el vinculador foto escindibles en el extremo 5' (trans configuración). Dúplex resultante posteriormente es utilizado para purificar proteínas individuales o complejos macromoleculares en granos de estreptavidina siguiendo el mismo protocolo descrito para los sustratos de RNA que contienen biotina foto escindibles unida covalentemente (cis configuración). Con esta modificación, la biotina foto escindibles puede utilizarse en conjunción con en vitro generadas las transcripciones que contienen cientos de nucleótidos, que se extiende el método de elución de UV para la purificación de una amplia gama de RNA/proteína.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

Durante muchos años, la interacción excepcionalmente fuerte y rápidamente formada entre biotina y estreptavidina se ha utilizado con éxito para la purificación parcial de complejos RNA/proteína biológicamente importantes. Sin embargo, esta estrategia sufre una importante desventaja que limita su utilización más amplia: la interacción de la biotina/estreptavidina se puede romper solamente bajo desnaturalizar condiciones que también alteran la integridad de los complejos eluídas, de ahí que su Análisis funcional posterior y posterior purificación por otros métodos. Además, las muestras eluídas con frecuencia están contaminadas con las proteínas de fondo que un asocian con estreptavidina granos, que complica el análisis de los complejos purificados por plata y espectrometría de masas. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una variante de la estrategia de biotina/estreptavidina biotina se une a un sustrato de RNA mediante un enlazador foto escindibles y los complejos inmovilizados en cuentas de estreptavidina se eluyen selectivamente a la solución en un forma nativa por onda larga UV, dejando las proteínas de fondo en las cuentas. Cortos sustratos de enlace de RNA pueden ser sintetizados químicamente con biotina y el vinculador foto escindibles covalentemente atado extremo 5' del ARN, mientras que los dos grupos pueden proporcionar sustratos de RNA más largo por un oligonucleótido complementario. Estas dos variantes del método UV-elución fueron probadas para la purificación de los complejos de procesamiento de RNPnp dependiente U7 que cleave pre-mRNAs de las histonas en el extremo 3' y ambos probaron a comparar favorablemente con otros previamente desarrollado métodos de purificación. Eluyen de UV de las muestras contuvieron cantidades fácilmente detectables de la RNPnp U7 que era libre de contaminantes de la proteína importante y conveniente para el análisis directo por espectrometría y análisis funcionales. El método descrito puede ser fácilmente adaptado para la purificación de otros complejos de unión de la RNA y utilizado conjuntamente con sitios de unión de ADN de hebra simple y doble para purificar DNA específico proteínas y complejos macromoleculares.

El método de elución de la UV fue probado con dos substratos de RNA síntesis química covalente Unidos en el extremo 5' a la molécula de pcB (configuracióncis ): pcB-SL (figura 1) y RNAs de pcB-dH3/5 m (figura 2). El nucleótido 31 pcB-SL RNA contiene una estructura de lazo del vástago seguida por una cola trenzada solo 5 nucleótidos y su secuencia es idéntica al extremo 3' de la histona maduro ARNm (es decir...

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Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Complejos de ARN/proteína purificados mediante estrategia de botín-estreptavidina se eluyen a solución bajo condiciones de desnaturalización en una forma inadecuada para la posterior purificación y análisis funcional. Aquí, describimos una modificación de esta estrategia que utiliza a un enlazador foto escindibles en RNA y un suave paso UV-elución, produciendo complejos de RNA/proteína nativas y completamente funcionales.

Solo paso purificación de complejos macromoleculares utilizando RNA unido a biotina y un enlazador foto escindibles

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Este método debe ser de interés para los investigadores que están tratando de aislar los complejos de proteínas de ARN e identificar su composición por espectrometría de masas. Creemos que nuestro protocolo será especialmente útil para purificar complejos que existen en células en cantidades limitadas y tienden a disociarse durante largos procedimientos de purificación de varios pasos. La principal ventaja de este método es que implica sólo un solo paso de purificación y podría ser utilizado con sitios de unión de ARN de cualquier longitud y secuencia.Demostrar algunos de los pasos será Xiao-cui Yang, que es un técnico de investigación senior en nuestro grupo. Para sitios de unión significativamente más largos que 65 nucleótidos, obtenga ARN generado por T7 y un adaptador de oligonucleótido PCB como se describe en el protocolo de texto. Mezclar 20 picomoles del ARN con 100 picomoles del adaptador oligonucleótidos en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 100 microlitros de tampón de unión.Coloque el tubo en agua hirviendo y déjelo incubar durante 5 minutos. A continuación, deje que el agua se enfríe a temperatura ambiente. Primer suplemento 1 mililitro de extracto nuclear de ratón con EDTA de 80 milimolares a pH 8 a una concentración final de 10 milimolar.A continuación, añada entre 5 y 10 picomoles del sustrato de ARN que ha sido etiquetado con la mitad de la placa CI. Incubar sobre hielo durante 5 minutos, asegurándose de mezclar ocasionalmente la muestra. A continuación, utilice una microcentrífuga preenfriada a 4 grados Celsius para centrifugar la mezcla a 10.000 veces g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitado potencial.Recoger cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo en el hielo, mientras que tenga cuidado de evitar la transferencia del pellet. Transfiera aproximadamente 100 microlitros de suspensión de perlas de estreptavidina a un tubo de 1,5 mililitros. Agregue aproximadamente 1 mililitro de tampón de unión para comenzar a lavar las perlas.Centrifugar el tubo a 25 veces g durante 2 a 3 minutos y aspirar el sobrenadante. Repita este proceso de lavado y centrifugación de 2 a 3 veces para equilibrar las perlas con el tampón de unión. Cargue el sobrenadante previamente recogido, que contiene el complejo ensamblado sobre las perlas equilibradas.Con un rotador de tubo, gire el tubo durante 1 hora a 4 grados Celsius para inmovilizar el ARN y los complejos unidos en las perlas. A continuación, gire el tubo a 25 veces g durante 2 a 3 minutos para recoger las cuentas en la parte inferior del tubo. Aspirar al sobrenadante.Y enjuague las perlas dos veces con tampón de unión, utilizando el proceso de lavado descrito anteriormente. Después de retirar el sobrenadante del segundo lavado, agregue 1 mililitro de tampón de unión y gire la muestra durante 1 hora a 4 grados centígrados. Gire hacia abajo la muestra a 25 veces g durante 2 a 3 minutos.A continuación, agregue 1 mililitro de tampón de unión y transfiera la suspensión a un tubo nuevo. Gire la muestra a 4 grados centígrados durante un máximo de 1 hora. Centrifugar los complejos inmovilizados a 25 veces g durante 2 a 3 minutos.A continuación, aspirar sobrenadante, y añadir 200 microlitros de búfer de unión. Transfiera las perlas a un tubo de 500 microlitros. Encienda una lámpara UV de alta intensidad que emita luz UV a 365 nanómetros y le permita alcanzar el brillo completo.Llene la parte inferior de un plato de Petri con hielo apretado apilándolo sobre la tapa del plato. Vórtice brevemente el tubo que contiene los complejos inmovilizados. A continuación, colóquelo horizontalmente sobre el hielo y cúbralo con la lámpara precaleada, asegurándose de que la muestra esté de 2 a 3 centímetros de la superficie de la bombilla.Irúnte la muestra durante un total de 30 minutos mientras se invierte y vórtice con frecuencia el tubo para garantizar una exposición uniforme y evitar el sobrecalentamiento. Después de esto, gire hacia abajo las cuentas a 25 veces g durante 2 a 3 minutos y recoger el sobrenadante. Centrifugar este sobrenadante una vez más utilizando las mismas condiciones.Recoger el sobrenadante resultante asegurándose de dejar una pequeña cantidad en la parte inferior del tubo para evitar transferir cualquier perla residual. Usando la electroforesis SDS-PAGE, separe una fracción del sobrenadante uv eluado y la fracción correspondiente del material dejado en las perlas después de la elución UV. A continuación, utilice un kit de tinción de plata disponible comercialmente para manchar el gel.Evaluar la eficiencia de la elución UV comparando las intensidades de las proteínas presentes en el sobrenadante eluido UV y las que quedan en las cuentas después de la irradiación UV. Exprime las bandas proteicas de interés y determina sus identidades por espectrometría de masas. Después de esto, analizar directamente una fracción del sobrenadante UV por espectrometría de masas para determinar todo el proteomo del material purificado de una manera imparcial.En este estudio, el ARN del lazo del tallo etiquetado con biotina fotoescable se incuba con 1 mililitro de un extracto citoplasmático S100 obtenido a partir de células del mieloma ratones. Y el efecto y la eficiencia de la elución UV se analiza mediante la tinción de plata. Se detectan varias proteínas en las perlas de estreptavidina antes de la elución UV.La irradiación con onda larga UV libera sólo algunas de estas proteínas en el sobrenadante dejando un fondo no específico en las cuentas. Esto enfatiza la importancia del paso de elución UV. La espectrometría de masas identifica las principales proteínas eluidas UV como 3'hExo y SLBP, con SLBP representada por la proteína de longitud completa y una serie de productos de degradación más cortos.Pequeñas cantidades de otras proteínas identificadas como diversas proteínas de unión al ARN también liberadas selectivamente en solución por la irradiación UV. La elución UV de la histona inmovilizada de Drosophila pre-mRNA etiquetada con biotina fotoescable incubada con un extracto nuclear dio lugar a una liberación selectiva de sólo un pequeño número de proteínas en el sobrenadante con un fondo intenso de proteínas no específicas restantes en las cuentas. La espectrometría de masas identifica que estas proteínas son componentes del snRNP de U7.No se detectan en presencia de competidores de procesamiento que bloquean la unión de U7 snRNP a histona pre-mRNA. Es importante utilizar la lámpara UV de alta intensidad y colocarla a una distancia cercana a la muestra irradiada, a la vez que se asegura de que no se sobrecaliente. El método de elución UV produce complejos nativos de proteínas de ARN que carecen de contaminantes importantes y son directamente adecuados para pasos de purificación adicionales y ensayos funcionales.Evite la exposición a los ojos y a la piel durante la irradiación UV.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Investigación

Bioquímica

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termoestabilización, Expresión, purificación y cristalización del transportador de serotonina humano enlazado a<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Electroforesis en gel horizontal para la detección mejorada de los complejos proteína-ARN

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

Un procedimiento de aislamiento de RNA tándem basada en oligonucleótidos recuperar complejos eucariotas ARNm-proteína

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...