Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Vi tackar våra kolleger och medarbetare för deras bidrag till vårt arbete. Denna studie stöddes av NIH bevilja GM 29832.

1. substrat förberedelse
Obs: RNA substrat kortare än ~ 65 nukleotider kan syntetiseras kemiskt med biotin (B) och foto-cleavable (pc) länkaren (grupp kallad foto-cleavable biotin eller pcB) kovalent fäst vid RNA 5' slutet (cis -konfiguration). RNA-substrat som innehåller betydligt längre bindande platser måste vara genererade i vitro genom T7 (eller SP6) transkription och därefter glödgas till en kort kompletterande adapter oligonukleotiden innehållande pcB biexponen...

<ol>
	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

Den metod som beskrivs här är okomplicerat och förutom införliva en foto-cleavable länkare och UV-eluering steget skiljer sig inte från de vanliga metoder att utnyttjar den extremt starka växelverkan mellan biotin och streptividin. Det UV-eluering steget är mycket effektiv, vanligtvis släppa mer än 75% av immobiliserade RNA och associerade proteiner från streptividin pärlor, lämnar bakom en hög bakgrund av proteiner som icke-specifikt binder till pärlorna. Genom att eliminera denna bakgrund, ger steget UV-...

I Eukaryoter genomgå RNA-polymeras II-genererade mRNA prekursorer (pre-mRNA) flera mognad händelser i kärnan innan det blir fullt fungerande mRNA mallar för proteinsyntesen i cytoplasman. En av dessa händelser är 3' slutet bearbetning. För den stora majoriteten av pre-mRNA innefattar 3' avsluta behandlingen klyvning kopplad till polyadenylation. Denna två-stegs reaktion katalyseras av en relativt riklig komplex bestående av mer än 15 proteiner1. Djur replikering-beroende Histon pre-mRNA behandlas i 3' slutet av en annan mekanism där rollen spelas av U7 snRNP, en låg överflöd komplex bestående av U7 snRNA ~ 60 nukleotider och flera proteiner2,3 . U7 snRNA basparen med en specifik sekvens i Histon pre-mRNA och en av subunitsna av den U7 snRNP katalyserar reaktionen klyvning, genererar mogen Histon mRNA utan en poly(A) svans. 3' slutet bearbetning av Histon pre-mRNA kräver också Stem-Loop bindande Protein (SLBP), som binder en bevarade stem-loop som ligger uppströms webbplatsen klyvning och förbättrar rekrytering av den U7 snRNP till substrat2,3. Studier som syftar till att identifiera enskilda komponenter i den U7 snRNP har varit utmanande på grund av den låga koncentrationen av den U7 snRNP i djurceller och tendensen av anläggningen att dissociera eller genomgå partiell proteolys under reningen till följd av att milda tvättmedel4,5,6, hög salt tvättar eller flera kromatografiska steg7,8,9.
Nyligen, för att bestämma sammansättningen av U7-beroende bearbetningsmaskiner, en korta fragment av Histon pre-mRNA som innehåller biotin på antingen 3 eller 5' var inkuberas med en nukleär extrakt och monterade komplexen fångades på streptividin-belagd agaros pärlor5,6,10. På grund av exceptionellt stark växelverkan mellan biotin och streptividin, var proteiner orörlig på streptividin pärlor elueras under denatureringen villkor genom kokning i SDS och analyseras av silverfärgning och masspektrometri. Medan denna enkla metod identifierat ett antal komponenter i den U7 snRNP, gav det ganska grov prover, ofta förorenade med ett stort antal bakgrund proteiner nonspecifically bunden till streptividin pärlor, potentiellt maskera vissa komponenter i maskinen och förhindra deras upptäckt på silver färgade geler5,6,10. Allt utesluten detta tillvägagångssätt också någon funktionella studier med isolerade materialet och dess ytterligare rening till homogenitet med ytterligare metoder.
Ett antal ändringar föreslogs över tid att ta itu med den nästan oåterkalleliga karaktär av biotin/streptividin samverkan, med de flesta av dem utformas antingen försvaga interaktionen eller tillhandahålla en kemiskt cleavable spacer arm i den som innehåller biotin reagenser11,12. Nackdelen med alla dessa ändringar var att de avsevärt minska effektiviteten av metod eller ofta krävs icke-fysiologiska förhållanden under eluering steg, äventyra integriteten eller aktivitet av de renade proteinerna.
Här beskriver vi en annan strategi för att lösa det inneboende problemet i strategin biotin/streptividin med hjälp av RNA substrat som biotin är kovalent bifogas den 5' slut via en foto-cleavable 1-(2-nitrofenyl) etyl-delen som är känsliga för långt vinka UV13,14. Vi testade detta tillvägagångssätt för rening av den begränsande U7-beroende bearbetning maskinen från Drosophila och däggdjurs nukleära extrakt15. Efter en kort inkubation av Histon pre-mRNA som innehåller biotin och foto-cleavable länkaren med en nukleär extrakt, de monterade bearbetning komplex orörlig på streptividin pärlor, noggrant tvättas och försiktigt ut till lösning i en infödd form av exponering för ~ 360 nm UV ljus. UV-eluering metoden är mycket effektiv, snabb och okomplicerad, ger tillräckliga mängder av de U7 snRNP att visualisera dess komponenter av sliver färgning från så lite som 100 µL av extraktet15. UV-elueras materialet är fri från bakgrunden proteiner och lämplig för direkt masspektrometri analys, ytterligare reningssteg och enzymatisk analyser. Samma metod kan antas för rening av andra RNA och protein komplex som kräver relativt korta RNA bindningsställen. Biotin och foto-cleavable länkaren kan även kovalent kopplas till singel - och dubbelsträngat DNA, potentiellt utvidga UV-eluering metoden för rening av olika DNA och protein komplex.
Kemisk syntes av RNA substrat som innehåller kovalent fäst biotin och foto-cleavable länkaren är praktiskt endast med de sekvenser som inte överstiger ~ 65 nukleotider, blir dyrt och ineffektivt för betydligt längre sekvenser. För att lösa detta problem, har vi också utvecklat en alternativ metod som är lämplig för mycket längre RNA bindande mål. I denna strategi, RNA av valfri längd och nukleotid sekvens är genererade i vitro genom T7 eller SP6 transkription och glödgas till en kort kompletterande oligonukleotiden som innehåller biotin och foto-cleavable länkaren i slutet 5' (trans konfiguration). Den resulterande duplex används därefter att rena individuella bindande proteiner eller makromolekylära komplex på streptividin pärlor efter samma protokoll som beskrivs för de RNA substrat som innehåller foto-cleavable biotin fäst kovalent (cis konfiguration). Med denna ändring, kan den foto-cleavable biotin användas tillsammans med in vitro- genererade avskrifter som innehåller hundratals nukleotider, utvidga den UV-eluering metoden för rening av ett brett utbud av RNA och protein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

Under många år har exceptionellt starkt och snabbt bildade samspelet mellan biotin och streptividin använts framgångsrikt för delvis rening av biologiskt viktiga RNA och protein komplex. Men denna strategi lider en stor nackdel som begränsar dess bredare utnyttjande: biotin/streptividin interaktionen kan brytas under denatureringen villkor som också stör integriteten för de eluerade komplex, därmed utgör hinder för deras efterföljande funktionell analys och/eller ytterligare rening av andra metoder. Dessutom är de eluerade proverna ofta förorenat med bakgrunden proteinerna som nonspecifically förknippar med streptividin pärlor, komplicerar analysen av renat komplexen av silverfärgning och masspektrometri. För att övervinna dessa begränsningar, vi utvecklat en variant av biotin/streptividin strategin som biotin är kopplad till en RNA-substrat via en foto-cleavable länkare och komplexen orörlig på streptividin pärlor elueras selektivt till lösning i en Native form av långvåg UV, lämnar proteinerna som bakgrund på pärlor. Kortare RNA bindande substrat kan syntetiseras kemiskt med biotin och foto-cleavable länkaren kovalent bifogas 5' slutet av RNA, medan längre RNA substrat kan förses med två grupper av en kompletterande oligonukleotiden. Dessa två varianter av UV-eluering metoden testades för rening av U7 snRNP-beroende bearbetning komplex som klyver Histon pre-mRNA i slutet 3' och de båda visat att jämföra gynnsamt till andra tidigare utvecklat reningsmetoder. UV-elueras proverna innehöll lätt påvisbara mängder av U7 snRNP som var fritt från föroreningar i stora protein och lämplig för direkt analys av masspektrometri och funktionella analyser. Den beskrivna metoden kan lätt anpassas för rening av andra RNA-bindande komplex och används tillsammans med singel - och dubbelsträngat DNA bindande platser för att rena DNA-specifika proteiner och makromolekylärt komplex.

UV-eluering metoden testades med två kemiskt syntetiserade RNA substrat kovalent bifogas i slutet 5' den pcB biexponentiellt (cis -konfiguration): pcB-SL (figur 1) och pcB-dH3/5 m RNAs (figur 2). 31-nukleotid pcB-SL RNA innehåller en stam-loop struktur följt av en 5-nukleotid enda stranded svans och dess sekvens är identisk med 3' ände mogen Histon mRNA (dvs., efter klyvning av Histon pre-mRNA av U7 snRNP)....

Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

RNA och protein komplex renas med hjälp av botin-streptividin strategi elueras lösning under denatureringen förhållanden i en form som är olämpliga för ytterligare rening och funktionell analys. Här beskriver vi en ändring av denna strategi som utnyttjar en foto-cleavable linker i RNA och en mild UV-eluering steg, framställning av infödda och fullt fungerande RNA och protein komplex.

Singel-steg rening av makromolekylära komplex använder RNA som bifogas Biotin och en foto-cleavable länkare

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Denna metod bör vara av intresse för forskare som försöker isolera RNA-proteinkomplex och identifiera deras sammansättning genom masspektrometri. Vi tror att vårt protokoll kommer att vara särskilt användbart för att rena komplex som finns i celler i begränsade mängder och tenderar att dissociate under långa flera steg reningsprocedurer. Den största fördelen med denna metod är att det bara innebär ett enda reningssteg och skulle kunna användas med RNA-bindningsställen av vilken längd och sekvens som helst.Demonstrera några av stegen kommer att Vara Xiao-cui Yang, som är en senior forskningstekniker i vår grupp. För bindningsställen betydligt längre än 65 nukleotider, erhålla T7 genererade RNA och en adaptor PCB oligonukleotid som beskrivs i textprotokollet. Blanda 20 picomoles av RNA med 100 picomoles av adaptoroligonukleotiden i en 1,5 milliliter tub som innehåller 100 mikroliter av bindande buffert.Placera röret i kokande vatten och låt det inkubera i 5 minuter. Låt sedan vattnet svalna till rumstemperatur. Första tillägget 1 milliliter av musen kärn- extrakt med 80 millimolar EDTA på pH 8 till en finalkoncentration av 10 millimolar.Lägg sedan till mellan 5 och 10 picomoles av RNA-substratet som har märkts med PCB moiety. Inkubera på is i 5 minuter, se till att ibland blanda provet. Nästa användning en färdigkyld mikrocentrifug vid 4 grader Celsius för att centrifug blandningen vid 10, 000 gånger g i 10 minuter för att avlägsna eventuella fällningar.Samla försiktigt supernatanten till ett nytt rör på is, samtidigt som du är noga med att undvika att överföra pelleten. Överför cirka 100 mikroliter streptavidin agarose pärla suspension till en 1,5 milliliter rör. Tillsätt ungefär 1 milliliter bindningsbuffert för att börja tvätta pärlorna.Centrifugera röret vid 25 gånger g i 2 till 3 minuter och aspirera supernatanten. Upprepa denna tvätt- och centrifugeringsprocess 2 till 3 gånger för att jämviktsbindorna med bindningsbufferten ska kunna ekvilka. Ladda den tidigare uppsamlade supernatanten, som innehåller det hopmonterade komplexet över de ekvilovilliga pärlorna.Med hjälp av en rörrotator roterar du röret i 1 timme vid 4 grader Celsius för att immobilisera RNA och bundna komplex på pärlorna. Nästa snurra röret på 25 gånger g i 2 till 3 minuter för att samla pärlorna i botten av röret. Aspirera supernatanten.Och skölj pärlorna två gånger med bindningsbuffert, med hjälp av den tidigare beskrivna tvättprocessen. När du har tagit bort supernatanten för den andra tvätten, tillsätt 1 milliliter bindningsbuffert och rotera provet i 1 timme vid 4 grader Celsius. Snurra ner provet med 25 gånger g i 2 till 3 minuter.Nästa tillsätt 1 milliliter bindningsbuffert och överför suspensionen till ett nytt rör. Rotera provet vid 4 grader Celsius i upp till 1 timme. Centrifugera de immobiliserade komplexen vid 25 gånger g i 2 till 3 minuter.Sedan aspirera supernatant, och tillsätt 200 mikroliter av bindande buffert. Överför pärlorna till ett 500 mikroliterrör. Slå på en hög intensitet UV-lampa som avger UV-ljus vid 365 nanometer och låt den nå full briljans.Fyll upp botten av en petriskål med tätt packad is stapling den över skålens lock. Kort virvel röret som innehåller immobiliserade komplex. Placera den sedan horisontellt på isen och täck den med den förhettade lampan, se till att provet är 2 till 3 centimeter från glödlampans yta.Bestråla provet i totalt 30 minuter medan du ofta inverterar och vortexar röret för att säkerställa en enhetlig exponering och för att förhindra överhettning. Efter detta, snurra ner pärlorna på 25 gånger g i 2 till 3 minuter och samla supernatanten. Centrifugera denna supernatant en gång till med samma villkor.Samla den resulterande supernatant se till att lämna en liten mängd i botten av röret för att undvika att överföra eventuella kvarvarande pärlor. Med hjälp av SDS-PAGE-elektrofores, separera en bråkdel av den UV eluerade supernatanten och motsvarande fraktion från det material som finns kvar på pärlorna efter UV-eluering. Nästa använda en kommersiellt tillgänglig silver färgning kit för att färga gelen.Utvärdera effektiviteten av UV-eluering genom att jämföra intensiteterna hos de proteiner som finns i den UV eluerade supernatanten och de som lämnas på pärlorna efter UV-bestrålning. Punktskatt proteinbanden av intresse och bestämma deras identiteter genom masspektrometri. Efter detta, direkt analysera en bråkdel av den UV eluted supernatant genom masspektrometri för att bestämma hela proteomet av det renade materialet på ett förutsättningsfullt sätt.I denna studie, stem loop RNA taggade med foto-cleavable biotin inkuberas med 1 milliliter av en cytoplasmatisk S100 extrakt som erhållits från möss myelom celler. Och effekten och effektiviteten av UV-eluering analyseras av silverfärgning. Ett antal proteiner detekteras på streptavidinpärlorna före UV-eluering.Bestrålning med långvågs UV släpper bara några av dessa proteiner i supernatanten lämnar en icke-specifik bakgrund på pärlorna. Detta betonar vikten av UV-elueringssteget. Masspektrometri identifierar de större UV eluted proteinerna som 3'hExo och SLBP med SLBP som representeras av både fulllängdsproteinet och ett antal kortare nedbrytningsprodukter.Mindre mängder av andra proteiner som identifierats som olika RNA-bindande proteiner som också selektivt frigörs i lösning genom UV-bestrålningen. UV eluering av immobiliserade Drosophila histon pre-mRNA taggade med foto-cleavable biotin inkuberas med ett kärnextrakt resulterade i en selektiv frisättning av endast ett litet antal proteiner i supernatant med en intensiv bakgrund av icke-specifika proteiner kvar på pärlorna. Masspektrometri identifierar dessa proteiner som komponenter i U7 snRNP.De upptäcks inte i närvaro av bearbetning konkurrenter som blockerar bindning av U7 snRNP till histon pre-mRNA. Det är viktigt att använda högintensiv UV-lampa och placera den ett nära avstånd till bestrålade provet samtidigt också se till att det inte överhettas. UV-elueringsmetoden ger inhemska RNA-proteinkomplex som saknar större föroreningar och är direkt lämpliga för ytterligare reningssteg och funktionella analyser.Undvik ögon- och hudexponering vid UV-bestrålning.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolering av besläktade RNA-proteinkomplex från celler med användning av oligonukleotid-riktad Eluering

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinitetsrening av proteinkomplex från eukaryota celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detektion och visualisering av DNA-skada-inducerad proteinkomplex i suspensionscellkulturer med användning av Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontell gelelektrofores för förbättrad detektion av protein-RNA-komplex

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analys av översättning inledande komplexa bildande på däggdjur mRNA

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

En oligonukleotid-baserade Tandem RNA isolering förfarande att återställa eukaryota mRNA-proteinkomplex

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...