Name: complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions
Uploaded: 2019-06-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions at JoVE.com

وحظي العمل بدعم من منحة مقدمة من المؤسسة الوطنية للبحوث في جنوب أفريقيا (رقم المنحة: UID 87903) وجامعة الدولة الحرة. كما أننا ممتنون للخدمات والمساعدة التي يقدمها بيتر فان ويك وهانلي غروبلر خلال دراساتنا المجهرية.

ويعتبر النيوفورمانات Cryptococcus وبعض سلالات Acanthamoeba castellanii كمسببات الأمراض من المستوى 2 للسلامة الأحيائية (BSL-2)؛ وبالتالي، يجب على الباحثين اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند العمل مع هذه الكائنات الحية. على سبيل المثال، يجب أن يكون لدى موظفي المختبرات تدريب محدد ومعدات حماية شخصية (PPE) مث...

<ol>
	<li>Barton, L. L., Northup, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial Ecology. , (2011).</li><li>Hunter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entente+cordiale:+multiple+symbiosis+illustrates+the+intricate+interconnectivity+of+nature.">Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature.</a> EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).</li><li>Comolli, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+inter-species+interactions+in+microbial+communities.">Intra- and inter-species interactions in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).</li><li>Siddiqui, R., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acanthamoeba+is+an+evolutionary+ancestor+of+macrophages:+a+myth+or+reality?.">Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?.</a> Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).</li><li>Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).</li><li>Steenbergen, J. N., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+virulence+for+the+human+pathogenic+fungus+Cryptococcus+neoformans.">The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans.</a> Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).</li><li>Casadevall, A., Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryptococcus Neoformans. , (1998).</li><li>Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+long+term+storage+of+Acanthamoeba+species.">A simple method for long term storage of Acanthamoeba species.</a> Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).</li><li>Sebolai, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Hydroxy+fatty+acids+found+in+capsules+of+Cryptococcus+neoformans.">3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans.</a> Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).</li><li>Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+acetylsalicylic+acid+on+oxylipin+migration+in+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+UOFS+Y-1378.">The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378.</a> Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).</li><li>Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+and+believing:+recent+advances+in+imaging+cell-cell+interactions.">Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions.</a> F1000 Research. , e6435.1 (2015).</li><li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing+-+multiscale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology.">Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).</li><li>Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+video+microscopy+of+fungal+pathogen+phagocytosis.">Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).</li><li>Duane, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+implementing+a+BLS-2++biosafety+program+in+a+research+laboratory.">A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory.</a> Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).</li><li>Madu, U. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcal+3-hydroxy+fatty+acids+protect+cells+against+amoebal+phagocytosis.">Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis.</a> Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).</li><li>Smith, D., Onions, A. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).</li><li>Schuster, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+pathogenic+and+opportunistic+free-living+amebas.">Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).</li><li>Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high+sensitivity+dectection+of+incorporated+bromodeoxyuridine.">An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li><li>Clancy, B., Cauller, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+sections+following+immersion+in+sodium+borohydride.">Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride.</a> Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).</li><li>Simons, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytosis+and+of+phagosomal+environment+in+polymorphonuclear+phagocytes+by+flow+cytometry.">Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+pH+Probes.">Ratiometric Imaging of pH Probes.</a> MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).</li><li>van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascospores+ultrastructure+and+development+in+Ophiostoma+cucullatum.">Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum.</a> Mycologia. 83, 698-707 (1991).</li><li>Spur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+viscosity+epoxy+resin+embedding+medium+for+electron+microscopy.">A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy.</a> Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).</li><li>Department of Minerals and Energy. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Cell Biology. 17, 208-212 (1963).</li><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications.">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li><li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages.">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcusneoformans+phagocytosis+by+macrophages.">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).</li><li>Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+role+of+3-hydroxy+fatty+acids+in+Cryptococcus-amoeba+interactions.">Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions.</a> Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).</li><li>Hayes, B. K., Heit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).</li><li>Meindl, C., &#214;hlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+methods+to+determine+nanoparticle+uptake+by+phagocytes+and+non-phagocytic+cells+in+vitro.">Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro.</a> Toxicology. 378, 25-36 (2017).</li></ol>

في الورقة، تم استخدام تقنيات مختلفة بنجاح للكشف عن النتيجة المحتملة التي قد تنشأ عندما تتفاعل الأميبا مع خلايا cryptococcal. أيضا، كنا مهتمين لإظهار آثار الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي على نتيجة تفاعلات Cryptococcus-الأميبا. 
وكانت التقنية الأولى المستخدمة هي الفحص المجهري البؤري، ا?...

وقد تطورت الميكروبات مع مرور الوقت لتحتل وتزدهر في منافذ إيكولوجية مختلفة مثل الحدود المادية المفتوحة للتربة والمياه، من بين أمور أخرى1. وفي هذه المنافذ، كثيرا ما تشارك الميكروبات في المنافسة المباشرة على الموارد المحدودة؛ الأهم من ذلك، للمغذيات التي يستخدمونها لدعم نموها أو الفضاء،والتي يحتاجونها لاستيعاب السكان الآخذة في التوسع 2،3. في بعض الحالات، قد بعض الكائنات الثلاثية الأبعاد مثل الأميبا حتى predate على خلايا cryptococcal كوسيلة لاستخراج المواد الغذائية من الكتلة الحيوية الخاصة بهم4،5. وهذا بدوره يسمح لهذه الكائنات بترسيخ الهيمنة الإقليمية عن طريق السيطرة على أعداد سكان فريستها. وبسبب هذا الضغط المفترس ، يمكن اختيار بعض الفرائس لإنتاج عوامل ميكروبية ، مثل كبسولة cryptococcal6، للتوفيق بين الآثار السلبية للضغط. ومع ذلك، كنتيجة غير مقصودة لهذا الضغط، بعض الميكروبات اكتساب العوامل التي تسمحلهم بعبور حاجز الأنواع والبحث عن منافذ جديدة لاستعمار 7، مثل المساحات المحصورة في جسم الإنسان التي هي غنية بالمواد الغذائية ولها مثالية الظروف. هذا الأخير قد يفسر كيف ميكروبالأرض مثل Cryptococcus (C.) يمكن أن تتحول neoformans لتصبح المسببة للأمراض.
لهذه الغاية، من المهم دراسة الاتصال الأولي أن خلايا cryptococcal قد يكون مع الأميبا وكيف يمكن أن تختار لهم لتصبح المسببة للأمراض. وبشكل أكثر تحديداً، قد يعطي هذا أدلة على كيفية تصرف خلايا الكريبتوككل عندما يتصرف عليها الضامة أثناء العدوى. ولهذا السبب تم اختيار الأميبا كنموذج للماكروفيج هنا ، حيث أنها رخيصة نسبيا وسهلة للحفاظ على ثقافة الأميبا في مختبر8. وكان من المهم أيضا أن تدرس كيف cryptococcal الأيض الثانوي أي 3-هيدروكسي الأحماض الدهنية9،10 تؤثر على التفاعل بين الأميبا وخلايا cryptococcal.
وهناك طريقة بسيطة لإدراك التفاعل بين الأميبا وفريستها بالعين المجردة هو إنشاء حديقة باستخدام فريستها على سطح لوحة أجار وبقعة الأميبا. يصور تصور اللوحات أو المناطق الواضحة على لوحة أجار المناطق التي قد تكون قد أطعمت فيها الأميبا فريستها. ومع ذلك، على هذا المستوى الكلي، يتم ملاحظة فقط نتيجة العملية، وعملية البلغم هو ميكانيكية لا يمكن ملاحظتها. لذلك، لتقدير العملية على أساس خلية إلى خلية، وهناك العديد من الطرق المجهرية التي يمكن استخدامها11،12. على سبيل المثال، يمكن استخدام المجهر المقلوب مع غرفة الحضانة لتسجيل الفيديو الفاصل الزمني للأحداث بين خلية phagocytic وهدفها13. لسوء الحظ، بسبب تكلفة المجهر مع وظيفة الفاصل الزمني، فإنه ليس من الممكن دائما للمختبرات لشراء مثل هذا المجهر، وخاصة في الموارد البيئات الفقيرة.
للتحايل على القيد المذكور أعلاه، تقدم هذه الدراسة تصميمًا استكشافيًا متسلسلًا يقيّم تفاعل C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 وC. neoformans LMPE 046 مع Acanthamoeba castellani . أولاً، يتم استخدام طريقة نوعية تسبق طريقة كمية. يتم التقاط الصور الثابتة باستخدام مجهر الفلورة المقلوب، فضلا عن المجهر الإلكتروني انتقال لتصوير التفاعلات الأميبا-Cryptococcus. وأعقب ذلك قياس الفلورة باستخدام قارئ لوحة لتقدير كفاءة الأميبا لاستيعاب خلايا الكريبتوكال. عند التوفيق بين النتائج من هذه الأساليب خلال مرحلة تفسير البيانات، وهذا قد يكشف بنفس القدر من المعلومات الحرجة مثل الاطلاع على شريط فيديو الفاصل الزمني phagocytosis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="782">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D27802</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-mL plastic tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">69715</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">7252018</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1132017</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">8-Well chamber slide</td>
			<td style="width:176px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1109650</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Acetone</td>
			<td style="width:176px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SAAR1022040LC</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Amoeba strain</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">30234TM</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">ATCC medium 712</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">712TM</td>
			<td style="width:172px;">Amoeba medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">152089</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Hermle</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Chloroform</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2432</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:176px;">Nikon</td>
			<td>Nikon TE 2000</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Epoxy resin:</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[1] NSA</td>
			<td style="width:176px;">[1] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[1] R1054</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[2] DER 736</td>
			<td style="width:176px;">[2] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[2] R1073</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[3] ERL Y221 resin</td>
			<td style="width:176px;">[3] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[3] R1047R</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)</td>
			<td style="width:176px;">[4] ALS&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[4] R1067</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F4274</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">489441</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroskan Ascent FL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">374-91038C</td>
			<td style="width:172px;">Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glucose</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1009</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:176px;">Boeco</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1209</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Chromatography Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Methanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">R 34,860</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Osmium tetroxide</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1015</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">pHrodo Green Zymosan A BioParticles</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">P35365</td>
			<td style="width:172px;">This is the pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Physiological buffer solution</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P4417-50TAB</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:176px;">Labcon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Sodium phosphate buffer:</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate&#160;</td>
			<td style="width:176px;">[1] Merck</td>
			<td style="width:123px;">[1] 106580</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate</td>
			<td style="width:176px;">[2] Merck&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[2] 106345</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:176px;">Philips</td>
			<td>Philips EM 100&#160;</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Trypan blue&#160;</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8154</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:176px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">EM UC7</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1260A</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vacuum dessicator</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vial</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">29651-U</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YNB</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">239210</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YPD agar</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Y-1500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions

لمحاكاة عدوى Cryptococcus، يمكن استخدام الأميبا، وهو المفترس الطبيعي لخلايا cryptococcal في البيئة، كنموذج للماكروفيج. هذا الكائن الحي المفترس، على غرار الضامة، يستخدم phagocytosis لقتل الخلايا الداخلية. مع مساعدة من مجهر الليزر المسح الضوئي، يتم التقاط الصور التي تصور لحظات تفاعلية بين خلايا cryptococcal والأميبا. قوة القرار من المجهر الإلكتروني يساعد أيضا على الكشف عن التفاصيل الهيكلية جدا من خلايا cryptococcal عندما المحاصرين داخل الفراغ الغذاء الأميبا. وبما أن الفياغوسية عملية مستمرة، ثم يتم دمج البيانات الكمية في التحليل لشرح ما يحدث في الوقت المناسب عندما يتم التقاط صورة. وعلى وجه التحديد، تُقرأ وحدات الفلورة النسبية من أجل تحديد كفاءة الأميبا في استيعاب خلايا الكريبتوك. لهذا الغرض، وملطخة خلايا cryptococcal مع صبغة التي تجعلها الفلورة مرة واحدة محاصرين داخل البيئة الحمضية من vacuole الغذاء. عند استخدامها معا، يمكن أن توفر المعلومات التي يتم جمعها من خلال هذه التقنيات معلومات حاسمة للمساعدة في استخلاص استنتاجات حول سلوك ومصير الخلايا عند استيعابها من قبل الأميبا، وربما، من قبل الخلايا الفيوسية الأخرى.

الميكروبات هي كائنات مجهرية لا يمكن تصورها بالعين المجردة. ومع ذلك، قد يؤدي تأثيرها إلى أمراض واضحة سريرياً يمكن ملاحظتها، مثل الالتهابات الجلدية. عند دراسة جوانب معينة من الميكروبات، تتراوح بين مورفولوجيا، والمنتجات الثانوية، والتفاعلات، والقدرة على تقديم الأدلة الت...

Watch this Scientific Journal Video about Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions at JoVE.com

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

الاستخدام التكميلي للتقنيات المجهرية والقراءة الفلورية في دراسة تفاعلات Cryptococcus-Amoeba

هذه الورقة تفاصيل بروتوكول لإعداد ثقافة مشتركة من خلايا cryptococcal والأميبا التي يتم دراستها باستخدام الصور الفلورية لا يزال، والصور عالية الدقة نقل المجهر الإلكتروني. ويتضح هنا كيف يمكن للبيانات الكمية أن تكمل هذه المعلومات النوعية.

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

الغرض العام من هذا الإجراء هو استخدام المجهر كأداة لدراسة البلعميات من الأنواع الفطرية المسببة للأمراض Cryptococcus neoformans بواسطة أميبا المفترس البيئي. هذا الفيديو تفاصيل بروتوكول لإعداد ثقافة المشتركة للخلايا cryptococcal وmoebae التي سوف دراسة باستخدام المجهر ليزر المسح confocal ونقل المجهر الإلكترون. يمكن للمعلومات التي يتم الحصول عليها من استخدام هذه التقنيات أن تلقي برؤى حول سلوك الخلايا المكوّنة على التشفير عند تدخيلها أثناء الإصابة.خط خارج سلالات الفطرية اختبار على لوحات YPD أجار. احتضان لوحة لمدة 48 ساعة في 30 درجة مئوية. كشط قبالة loopful من الخلايا من لوحة 48 ساعة من العمر وتطعيم لهم في قارورة مخروطية 250 ملليلتر تحتوي على 100 ملليلتر من مرق YNB التي تستكمل مع 4٪ الجلوكوز.احتضان القارورة في 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على شاكر دوار. بعد فترة حضانة لمدة 24 ساعة، عد الخلايا الفطرية باستخدام قياس الهيموسيت وضبط رقم الخلية إلى مليون خلية لكل ملليلتر مع محلول عازلة الفسيولوجية. زراعة خلايا الأميبا في الخميرة الببتون استخراج مرق الجلوكوز لمدة أسبوع في 30 درجة مئوية.عد خلايا الأميبا باستخدام مقياس الهيموسيتات وضبط رقم الخلية إلى 10 ملايين خلية لكل ملليلتر مع ATCC معقم جديد متوسط 712. بعد ذلك، إجراء مقايسة قابلة للحياة باستخدام وصمة عار زرقاء trypan. فمن المستحسن للعمل مع الخلايا التي تظهر على الأقل 80٪ القدرة على البقاء.الاستغناء عن تعليق 200 ميكرولتر من خلايا الأميبا الموحدة في غرف من الشريحة المتمسك. السماح لمدة ساعتين لتمرير الخلايا للتمسك السطح في 30 درجة مئوية. في حين أن خلايا الأميبا تستقر ، وصمة عار الخلايا المشفرة الموحدة مع isoescein isothiocyanate.يهيج الخلايا الفطرية بلطف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. الاستغناء عن تعليق 200 ميكرولتر من خلايا المكورات المشفرة الملطخة بعد غسلها إلى الغرف المناسبة التي تحتوي بالفعل على خلايا الأميبا. احتضان الثقافة المشتركة المعدة في 30 درجة مئوية لفترة إضافية من ساعتين.في نهاية فترة الاحتراق، وغسل الغرف مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي خلايا الأميبا غير منضم بما في ذلك خلايا cryptococcal غير داخلي. البيربيرات الجلوتارالديهيد الذي كان يستخدم لإصلاح الخلايا، وغسل الغرفة مرتين مع برنامج تلفزيوني. تفكيك الشريحة الغرفة.عرض الخلايا المشتركة في الثقافة باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر confocal. لاستكمال الفحص أعلاه ، وصمة عار الخلايا المشفرة مع صبغة pHrodo التي تسمح بشكل انتقائي لقراءة الخلايا المحاصرين داخل فاكولي الغذاء. الاستغناء عن هذه الخلايا الملطخة في آبار لوحة microtiter الأسود الملتزم الذي يحتوي بالفعل على خلايا الأميبا المصنفة.قياس الفلوريسنس على قارئ الصهريج الصغير الذي يمكنه تحويل الإشارات اللوغاريتمية إلى وحدات الفلورانسية النسبية. إضافة خمسة ملليلترات من خلايا cryptococcal موحدة إلى نفس أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي بالفعل على خمسة ملليلترات من خلايا الأميبا الموحدة. السماح للأنبوب على الوقوف لمدة ساعتين في 30 درجة مئوية.استلهم الطارد بعد الطرد المركزي. إصلاح بيليه الذي يمثل الخلايا المشتركة في الثقافة مع الضرس واحد من فوسفات الصوديوم المخزنة 3٪ glutaraldehyde في الرقم الH 7 لمدة ثلاث ساعات. غسل الخلايا المشتركة في الثقافة مرة واحدة مع العازلة فوسفات الصوديوم.إصلاح مرة أخرى لمدة 1 1/2 ساعة في المخزنة بالمثل 1٪ أوزميوم تتروكسيد تليها الغسيل. يجفف المواد TEM المعروف أيضا باسم الخلايا المشتركة في الثقافة في سلسلة الأسيتون متدرج من 30٪50٪70٪95٪و 100٪ لمدة 15 دقيقة لكل من. هنا، كرر خطوة الجفاف النهائية في تغييرين.إعداد راتنج الايبوكسي عن طريق وزنها قبالة الايبوكسي من الاتساق العادي. تضمين المواد في راتنج الايبوكسي. البلمرة المواد TEM لمدة ثماني ساعات في 70 درجة مئوية.قطع 16 نانومتر المقاطع مع السكاكين الزجاجية التي شنت على ultratome. وصمة عار المقاطع مع خلات أورانيل لمدة 10 دقائق في الظلام تليها سيترات الرصاص لمدة 10 دقائق، وأيضا في الظلام. عرض المقاطع مع المجهر الإلكتروني انتقال.لأغراض توضيحية، في الفيديو، يتم فحص اثنين من العزل، واحد التي تنتج الأحماض الدهنية 3 هيدروكسي والآخر أن لا. 3-الأحماض الدهنية هيدروكسي هي المستقلبات الثانوية التي لا تلعب دورا في نمو الخلايا المكورة المشفرة. وهنا لقطات التي تظهر لحظات تفاعلية بين Cryptococcus وmoebae.إلى هذه النقطة، يمكن ملاحظة خلية المكوّنة على التشفير قبل وبعد استيعاب. عند دراسة البلعوم، فمن المثالي الاستفادة من التصوير الحي. ومع ذلك ، فإنه ليس من الممكن دائما للباحثين الحصول على مثل هذا المجهر من أجل متابعة عملية البلعمة بشكل مستمر.وقد يكون الحل الممكن للتعويض عن هذا القيد هو تكملة الصور ببيانات كمية من خلال قراءة وحدات الفلورية النسبية. الرسم البياني الشريطي مثال على البيانات التي استخدمتها لتكملة الصور. والأهم من ذلك، يمكن أخذ كل من البيانات النوعية في شكل صور والبيانات الكمية في نقاط زمنية مختلفة على مدى الزمن.عن طريق تجميع جميع المعلومات، يمكن للمرء أن يبدأ في بناء صورة أكبر لما يحدث خلال عملية البلعوم. من البيانات الكمية، فمن الواضح أن نرى أن الخلايا مع 3-hydroxy الأحماض الدهنية هي أقل عرضة للعمل الأميبا بالمقارنة مع الخلايا التي لا تنتج 3-هيدروكسي الأحماض الدهنية كما يتم استيعاب عدد أقل من الخلايا. وTEM هو أداة قوية بشكل خاص لأنها يمكن أن تعطي نظرة الطيور العين في تجويف الطعام بسبب قوتها عالية الدقة، وهذا هو نوع من التفاصيل التي غالبا ما غاب عند فحص التصوير الحي، فضلا عن الصور الثابتة.في هذا ميكروجراف TEM محددة، protuberances على سطح الخلايا cryptococcal يمكن أن ينظر بوضوح. سابقا، كان من المُتنظير أن هذه الهياكل السطحية للخلايا هي قنوات يتم من خلالها إطلاق الأحماض الدهنية ثلاثية الهيدروكسي في البيئة المحيطة. إلى هذه النقطة، قد تساعد هذه القنوات على تقديم 3-هيدروكسي الأحماض الدهنية في تجويف الطعام من الأمويباي لتغيير الظروف الداخلية، وبالتالي تعزيز بقاء الخلية.pHrodo أو مثل فيتك قد يكون وصمة عار أفضل بكثير لاستخدامها لأنها الفلوريس فقط في انخفاض نسبة الHH، مثل داخل فاكولي الغذاء. أن تكون محددة، pHrodo يسمح فقط الباحث للحصول على البيانات المتعلقة بالخلايا الداخلية. وتحقيقا لهذه الغاية، من المهم أن يتم تعليق الخلايا في محلول الفوسفات العازل قبل تلطيخ وأن وسائل الإعلام الأميبا هو من علامة PH محايدة.يجب تدريب مشغلي المجهر الإلكتروني للإرسال بشكل جيد على القسم بشكل صحيح لأن هذا هو في كثير من الأحيان النقطة التي يمكن أن تكون فيها النتائج مشوهة وميكروجراف معطوب من القصف الإلكتروني. ومن المتوخى أن يتمكن الباحثون من أخذ ما يكفي من المعلومات من البروتوكول المقدم والاستفادة المثلى منها في دراساتهم الخاصة. وعلاوة على ذلك، قد يطور الباحثون أيضًا أجسامًا مضادة ضد المستقلب المستهدف ويطبقونها أثناء دراستهم المجهرية في الفلورسنت المناعي بما في ذلك وضع العلامات المناعية أثناء فحص TEM.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

استخدام نموذج لوصف EpiAirway طويل الأجل المضيف الممرض التفاعلات

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

تقييم التغيرات الأيضية الكبدي خلال الاستعمار التدريجي الماوس مجانا من جرثومة 1 H NMR الطيفي

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

رواية<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية متسلسلة

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

الإنزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن لدراسة التفاعلات الوظيفية بين المستقبلات والأنزيمات

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

تحليل تقييد SAMHD1 عن طريق قياس التدفق الخلوي في خلايا U937 النخاعية البشرية

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...