Name: complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions
Uploaded: 2019-06-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions at JoVE.com

Unterstützt wurde die Arbeit durch ein Stipendium der National Research Foundation of South Africa (Fördernummer: UID 87903) und der Universität des Freistaats. Wir sind auch dankbar für die Dienstleistungen und die Unterstützung, die Pieter van Wyk und Hanlie Grobler während unserer Mikroskopiestudien angeboten haben.

Cryptococcus neoformans und einige Acanthamoeba castellanii Stämme gelten als Biosicherheits-Level-2 (BSL-2) Krankheitserreger; Daher müssen die Forscher bei der Arbeit mit diesen Organismen angemessene Vorsichtsmaßnahmen treffen. Beispielsweise sollte das Laborpersonal über spezielle Schulungen und persönliche Schutzausrüstungen (PSA) wie Labormäntel, Handschuhe und Augenschutz verfügen. Ein biologischer Sicherheitsschrank (Stufe-2) sollte für Verfahren verwendet werden, die eine Infektion ver...

<ol>
	<li>Barton, L. L., Northup, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial Ecology. , (2011).</li><li>Hunter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entente+cordiale:+multiple+symbiosis+illustrates+the+intricate+interconnectivity+of+nature.">Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature.</a> EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).</li><li>Comolli, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+inter-species+interactions+in+microbial+communities.">Intra- and inter-species interactions in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).</li><li>Siddiqui, R., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acanthamoeba+is+an+evolutionary+ancestor+of+macrophages:+a+myth+or+reality?.">Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?.</a> Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).</li><li>Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).</li><li>Steenbergen, J. N., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+virulence+for+the+human+pathogenic+fungus+Cryptococcus+neoformans.">The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans.</a> Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).</li><li>Casadevall, A., Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryptococcus Neoformans. , (1998).</li><li>Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+long+term+storage+of+Acanthamoeba+species.">A simple method for long term storage of Acanthamoeba species.</a> Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).</li><li>Sebolai, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Hydroxy+fatty+acids+found+in+capsules+of+Cryptococcus+neoformans.">3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans.</a> Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).</li><li>Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+acetylsalicylic+acid+on+oxylipin+migration+in+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+UOFS+Y-1378.">The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378.</a> Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).</li><li>Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+and+believing:+recent+advances+in+imaging+cell-cell+interactions.">Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions.</a> F1000 Research. , e6435.1 (2015).</li><li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing+-+multiscale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology.">Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).</li><li>Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+video+microscopy+of+fungal+pathogen+phagocytosis.">Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).</li><li>Duane, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+implementing+a+BLS-2++biosafety+program+in+a+research+laboratory.">A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory.</a> Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).</li><li>Madu, U. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcal+3-hydroxy+fatty+acids+protect+cells+against+amoebal+phagocytosis.">Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis.</a> Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).</li><li>Smith, D., Onions, A. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).</li><li>Schuster, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+pathogenic+and+opportunistic+free-living+amebas.">Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).</li><li>Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high+sensitivity+dectection+of+incorporated+bromodeoxyuridine.">An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li><li>Clancy, B., Cauller, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+sections+following+immersion+in+sodium+borohydride.">Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride.</a> Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).</li><li>Simons, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytosis+and+of+phagosomal+environment+in+polymorphonuclear+phagocytes+by+flow+cytometry.">Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+pH+Probes.">Ratiometric Imaging of pH Probes.</a> MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).</li><li>van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascospores+ultrastructure+and+development+in+Ophiostoma+cucullatum.">Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum.</a> Mycologia. 83, 698-707 (1991).</li><li>Spur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+viscosity+epoxy+resin+embedding+medium+for+electron+microscopy.">A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy.</a> Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).</li><li>Department of Minerals and Energy. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Cell Biology. 17, 208-212 (1963).</li><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications.">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li><li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages.">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcusneoformans+phagocytosis+by+macrophages.">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).</li><li>Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+role+of+3-hydroxy+fatty+acids+in+Cryptococcus-amoeba+interactions.">Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions.</a> Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).</li><li>Hayes, B. K., Heit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).</li><li>Meindl, C., &#214;hlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+methods+to+determine+nanoparticle+uptake+by+phagocytes+and+non-phagocytic+cells+in+vitro.">Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro.</a> Toxicology. 378, 25-36 (2017).</li></ol>

In dem Papier wurden verschiedene Techniken erfolgreich eingesetzt, um das mögliche Ergebnis zu enthüllen, das entstehen kann, wenn Amöben mit Kryptokokkenzellen interagieren. Außerdem waren wir daran interessiert, die Auswirkungen von 3-Hydroxy-Fettsäuren auf das Ergebnis von Cryptococcus-Amöben-Wechselwirkungen zu zeigen. 
Die erste verwendete Technik war die konfokale Mikroskopie, die Standbilder wiedergab. Der hauptnachteil dieser Technik hier war, dass sie uns nur Informati...

Mikroben haben sich im Laufe der Zeit entwickelt, um in verschiedenen ökologischen Nischen wie den offenen physikalischen Grenzen des Bodens und des Wassers, unter anderem1, zu besetzen und zu gedeihen. In diesen Nischen liefern sich Mikroben häufig den direkten Wettbewerb um begrenzte Ressourcen; wichtig für Nährstoffe, die sie zur Unterstützung ihres Wachstums oder Raumes verwenden, die sie benötigen, um die wachsende Bevölkerung unterzubringen2,3. In bestimmten Fällen, einige holozoische Organismen wie Amöben können sogar auf Kryptokokken-Zellen als eine Möglichkeit, Nährstoffe aus ihrer Biomasse zu extrahieren4,5. Dies wiederum ermöglicht es solchen Organismen, eine territoriale Dominanz zu etablieren, indem sie die Populationszahlen ihrer Beute kontrollieren. Aufgrund dieses räuberischen Drucks können einige Beutetiere ausgewählt werden, um mikrobielle Faktoren zu erzeugen, wie die Kryptokokkenkapsel6, um die negativen Auswirkungen des Drucks in Einklang zu bringen. Als unbeabsichtigte Folge dieses Drucks erwerben einige Mikroben jedoch Faktoren, die es ihnen ermöglichen, die Artenbarriere zu überqueren und neue Nischen zu suchen, um7zu besiedeln, wie die engen Räume des menschlichen Körpers, die reich an Nährstoffen sind und ideale Bedingungen. Letzteres könnte erklären, wie eine terrestrische Mikrobe wie Cryptococcus (C.) Neoformane können sich transformieren, um pathogen zu werden.
Zu diesem Zweck ist es wichtig, den anfänglichen Kontakt zu untersuchen, den Kryptokokkenzellen mit Amöben haben können und wie diese sie auswählen können, um pathogen zu werden. Genauer gesagt, Dies kann Hinweise darauf geben, wie kryptokokken Zellen verhalten, wenn durch Makrophagen während der Infektion gehandelt. Aus diesem Grund wurde Amöbe hier als Modell für Makrophagen gewählt, da es relativ billig und einfach ist, eine Amöbenkultur in einem Labor zu pflegen8. Von Interesse war auch zu untersuchen, wie kryptokokkalsekundäre Metaboliten viz. 3-Hydroxy-Fettsäuren9,10 beeinflussen die Interaktion zwischen Amöben und Kryptokokkenzellen.
Eine einfache Möglichkeit, die Wechselwirkung zwischen Amöben und seiner Beute mit bloßem Auge zu erkennen, besteht darin, einen Rasen mit seiner Beute auf der Oberfläche einer Agarplatte zu schaffen und Amöben zu erkennen. Die Visualisierung von Plaques oder klaren Zonen auf der Agarplatte zeigt Bereiche, in denen Amöben sich von ihrer Beute ernährt haben könnten. Auf dieser Makroebene wird jedoch nur das Ergebnis des Prozesses festgestellt, und der Prozess der Phagozytose ist mechanisiert, kann nicht beobachtet werden. Daher, um den Prozess auf zell-zu-Zell-Basis zu schätzen, gibt es mehrere mikroskopische Methoden, die verwendet werden können11,12. Beispielsweise kann ein invertiertes Mikroskop mit einer Inkubationskammer verwendet werden, um einen Zeitraffer von Ereignissen zwischen einer phagozytischen Zelle und ihrem Ziel13aufzuzeichnen. Leider ist es aufgrund der Kosten für ein Mikroskop mit Einer Zeitrafferfunktionalität nicht immer möglich, dass Laboratorien ein solches Mikroskop kaufen, insbesondere bei Ressourcenmangel.
Um die obige Einschränkung zu umgehen, präsentiert diese Studie ein sequenzielles Explorativdesign, das die Wechselwirkung von C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 und C. neoformans LMPE 046 mit Acanthamoeba castellani bewertet. . Zunächst wird eine qualitative Methode verwendet, die einer quantitativen Methode vorausgeht. Standbilder werden mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop sowie einem Transmissionselektronenmikroskop aufgenommen, um Amöben-Kryptokokken-Wechselwirkungen darzustellen. Es folgte die Quantifizierung der Fluoreszenz mit Hilfe eines Plattenlesers, um die Effizienz von Amöben zur Internalisierung von Kryptokokkenzellen zu schätzen. Wenn man die Ergebnisse dieser Methoden während der Dateninterpretationsphase abgleicht, kann dies ebenso viele kritische Informationen offenbaren wie das Durchlesen eines Phagozytose-Zeitraffervideos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="782">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D27802</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-mL plastic tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">69715</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">7252018</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1132017</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">8-Well chamber slide</td>
			<td style="width:176px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1109650</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Acetone</td>
			<td style="width:176px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SAAR1022040LC</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Amoeba strain</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">30234TM</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">ATCC medium 712</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">712TM</td>
			<td style="width:172px;">Amoeba medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">152089</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Hermle</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Chloroform</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2432</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:176px;">Nikon</td>
			<td>Nikon TE 2000</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Epoxy resin:</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[1] NSA</td>
			<td style="width:176px;">[1] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[1] R1054</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[2] DER 736</td>
			<td style="width:176px;">[2] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[2] R1073</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[3] ERL Y221 resin</td>
			<td style="width:176px;">[3] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[3] R1047R</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)</td>
			<td style="width:176px;">[4] ALS&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[4] R1067</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F4274</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">489441</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroskan Ascent FL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">374-91038C</td>
			<td style="width:172px;">Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glucose</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1009</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:176px;">Boeco</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1209</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Chromatography Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Methanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">R 34,860</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Osmium tetroxide</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1015</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">pHrodo Green Zymosan A BioParticles</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">P35365</td>
			<td style="width:172px;">This is the pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Physiological buffer solution</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P4417-50TAB</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:176px;">Labcon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Sodium phosphate buffer:</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate&#160;</td>
			<td style="width:176px;">[1] Merck</td>
			<td style="width:123px;">[1] 106580</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate</td>
			<td style="width:176px;">[2] Merck&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[2] 106345</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:176px;">Philips</td>
			<td>Philips EM 100&#160;</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Trypan blue&#160;</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8154</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:176px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">EM UC7</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1260A</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vacuum dessicator</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vial</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">29651-U</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YNB</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">239210</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YPD agar</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Y-1500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions

Um eine Cryptococcus-Infektion zu simulieren, kann Amöbe, das natürliche Raubtier von Kryptokokkenzellen in der Umgebung, als Modell für Makrophagen verwendet werden. Dieser räuberische Organismus, ähnlich wie Makrophagen, verwendet Phagozytose, um verinnerlichte Zellen abzutöten. Mit Hilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops werden Bilder erfasst, die interaktive Momente zwischen Kryptokokkenzellen und Amöben darstellen. Die Auflösungskraft des Elektronenmikroskops hilft auch, die ultrastrukturellen Details von Kryptokokkenzellen zu enthüllen, wenn sie im Amöben-Lebensmittelvakuum gefangen sind. Da Phagozytose ein kontinuierlicher Prozess ist, werden quantitative Daten in die Analyse integriert, um zu erklären, was zum Zeitpunkt der Erfassung eines Bildes geschieht. Um genau zu sein, werden relative Fluoreszenzeinheiten gelesen, um die Effizienz von Amöben bei der Internalisierung von Kryptokokkenzellen zu quantifizieren. Zu diesem Zweck werden Kryptokokkenzellen mit einem Farbstoff gefärbt, der sie fluoreszieren lässt, sobald sie in der sauren Umgebung des Nahrungsvakuums gefangen sind. Wenn sie zusammen verwendet werden, können Informationen, die durch solche Techniken gesammelt werden, wichtige Informationen liefern, um Schlussfolgerungen über das Verhalten und das Schicksal von Zellen zu ziehen, wenn sie durch Amöben und möglicherweise durch andere phagozytische Zellen verinnerlicht werden.

Mikroben sind mikroskopische Organismen, die nicht mit bloßem Auge wahrgenommen werden können. Ihre Auswirkungen können jedoch zu beobachtbaren klinisch offensichtlichen Krankheiten wie Hautinfektionen führen. Bei der Untersuchung bestimmter Aspekte von Mikroben, die von ihrer Morphologie, Nebenprodukten und Wechselwirkungen reichen, ist es von größter Bedeutung, Bild- und Videobeweise liefern zu können.
Wir versuchten zu...

Watch this Scientific Journal Video about Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions at JoVE.com

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Komplementärer Einsatz von mikroskopischen Techniken und Fluoreszenzlesen beim Studium von Cryptococcus-Amoeba-Interaktionen

Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Vorbereitung einer Kokultur von Kryptokokkenzellen und Amöben, die mit Standbildern, fluoreszierenden Bildern und hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskopbildern untersucht wird. Hier wird veranschaulicht, wie quantitative Daten solche qualitativen Informationen ergänzen können.

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Der allgemeine Zweck dieses Verfahrens ist es, Mikroskopie als Werkzeug zu verwenden, um die Phagozytose der pathogenen Pilzart Cryptococcus neoformans durch seine Umwelt Raubtier Amöbe zu studieren. Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Vorbereitung einer Kokultur von Kryptokokkenzellen und Amöben, die ich mit konfokaler Laserscanmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie untersuchen werde. Informationen, die durch die Verwendung dieser Techniken gewonnen werden, könnten Einblicke in das Verhalten von Kryptokokkenzellen geben, wenn sie während der Infektion internalisiert werden.Streichen Sie die Testpilzstämme auf YPD AgarPlatten. Inkubieren Sie die Platte für 48 Stunden bei 30 Grad Celsius. Schrotten Sie eine Schleife von Zellen aus der 48 Stunden alten Platte und impfen Sie sie in einen 250-Milliliter konischen Kolben mit 100 Milliliter NYNB Brühe, die mit 4% Glukose ergänzt wird.Den Kolben bei 30 Grad Celsius 24 Stunden lang auf einem Drehschüttler bebrüten. Zählen Sie nach einer 24-stündigen Inkubationszeit die Pilzzellen mit einem Hämozytometer und passen Sie die Zellzahl mit physiologischer Pufferlösung auf eine Million Zellen pro Milliliter an. Kultivieren Sie Amöbenzellen in Peptonhefe Extrakt Glukosebrühe für eine Woche bei 30 Grad Celsius.Zählen Sie die Amöbenzellen mit einem Hämozytometer und passen Sie die Zellzahl auf 10 Millionen Zellen pro Milliliter mit frischem sterilem ATCC-Medium 712 an. Führen Sie anschließend einen Lebensfähigkeitstest mit einem Trypanenblaufleck durch. Es ist ratsam, mit Zellen zu arbeiten, die mindestens 80% Lebensfähigkeit aufweisen.Geben Sie eine 200-Mikroliter-Suspension standardisierter Amöbenzellen in Die Kammern eines haftenden Schlittens. Lassen Sie zwei Stunden vergehen, damit Zellen bei 30 Grad Celsius an der Oberfläche haften. Während sich Amöbenzellen absetzen, färben die standardisierten Kryptokokkenzellen mit Fluorescein-Isothiocyanat.Rühren Sie die Pilzzellen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und im Dunkeln sanft auf. 200-Mikroliter-Suspension von gefärbten Kryptokokkenzellen nach dem Waschen in geeignete Kammern geben, die bereits Amöbenzellen enthalten. Die vorbereitete Kokultur bei 30 Grad Celsius für einen zusätzlichen Zeitraum von zwei Stunden inkubieren.Am Ende der Coinkubationszeit, waschen Sie die Kammern zweimal mit PBS, um alle ungebundenen Amöbenzellen einschließlich nicht-internalisierter Kryptokokkenzellen zu entfernen. Aspirieren Sie das Glutaraldehyd, das verwendet wurde, um die Zellen zu fixieren, und waschen Sie die Kammer zweimal mit PBS. Zerlegen Sie die Kammerrutsche.Sehen Sie sich die ko-kultivierten Zellen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop an. Um den obigen Test zu ergänzen, färben Sie die Kryptokokkenzellen mit pHrodo-Farbstoff, der selektiv das Lesen von Zellen ermöglicht, die im Nahrungsvakuum gefangen sind. Geben Sie diese gebeizten Zellen in die Brunnen einer schwarzen, anhaftenden Mikrotiterplatte, die bereits gesäte Amöbenzellen enthält.Messen Sie die Fluoreszenz an einem Mikroplattenleser, der logarithmische Signale in relative Fluoreszenzeinheiten umwandeln kann. Fügen Sie fünf Milliliter standardisierter Kryptokokkenzellen in das gleiche Zentrifugenrohr ein, das bereits fünf Milliliter standardisierte Amöbenzellen enthält. Lassen Sie die Röhre für zwei Stunden bei 30 Grad Celsius stehen.Aspirieren Sie den Überstand nach der Zentrifugation. Fixieren Sie das Pellet, das die ko-kultivierten Zellen darstellt, mit einem Molaren Natriumphosphat gepuffert 3%glutaraldehyd bei pH 7 für drei Stunden. Waschen Sie die ko-kultivierten Zellen einmal mit Natriumphosphatpuffer.Fix wieder für 1 1/2 Stunden in ähnlich gepuffert 1%Osmiumtetroxid gefolgt von Waschen. Dehydrieren Sie das TEM-Material, auch bekannt als die ko-kultivierten Zellen in einer abgestuften Aceton-Serie von 30%50%70%95%und 100% für jeweils 15 Minuten. Wiederholen Sie hier den letzten Austrocknungsschritt in zwei Änderungen.Bereiten Sie das Epoxidharz vor, indem Sie Epoxid der normalen Konsistenz abwägen. Material in das Epoxidharz einbetten. Polymerisieren Sie das TEM-Material acht Stunden lang bei 70 Grad Celsius.Schneiden Sie 16-Nanometer-Abschnitte mit Glasmessern auf dem Ultratome montiert. Die Abschnitte mit Uranylacetat 10 Minuten im Dunkeln färben, gefolgt von Bleicitrat für 10 Minuten, auch im Dunkeln. Sehen Sie sich die Abschnitte mit einem Transmissionselektronenmikroskop an.Zur Veranschaulichung werden im Video zwei Isolate untersucht, eines, das 3-Hydroxy-Fettsäure produziert, und das andere nicht. 3-Hydroxy-Fettsäuren sind sekundäre Metaboliten, die keine Rolle beim Wachstum von Kryptokokkenzellen spielen. Hier sind Schnappschüsse, die interaktive Momente zwischen Cryptococcus und Amöben zeigen.Auf den Punkt gebracht, kann eine Kryptokokkenzelle vor und nach der Internalisierung beobachtet werden. Beim Studium der Phagozytose ist es ideal, live bildgebende Bilder zu verwenden. Es ist jedoch nicht immer möglich, dass Forscher Zugang zu einem solchen Mikroskop haben, um den Prozess der Phagozytose kontinuierlich zu verfolgen.Eine mögliche Lösung, um diese Einschränkung auszugleichen, könnte darin bestehen, Bilder durch das Lesen relativer Fluoreszenzeinheiten mit quantitativen Daten zu ergänzen. Das Balkendiagramm ist ein Beispiel für Daten, die ich verwendet habe, um die Bilder zu ergänzen. Wichtig ist, dass sowohl die qualitativen Daten in Form von Bildern als auch die quantitativen Daten im Laufe der Zeit zu unterschiedlichen Zeitpunkten aufgenommen werden können.Indem man alle Informationen pieciert, kann man beginnen, ein größeres Bild dessen zu konstruieren, was während des Prozesses der Phagozytose geschieht. Aus den quantitativen Daten geht hervor, dass die Zellen mit 3-Hydroxy-Fettsäuren weniger anfällig für Amöbensind sind, wenn sie mit Zellen verglichen werden, die keine 3-Hydroxy-Fettsäure produzieren, da weniger Zellen verinnerlicht werden. Das TEM ist ein besonders leistungsfähiges Werkzeug, da es aufgrund seiner hohen Auflösungskraft einen Blick aus der Vogelperspektive in das Lumen des Nahrungsvakuums geben kann, und dies ist die Art von Details, die bei der Untersuchung von Live-Bildgebung sowie Standbildern oft übersehen werden.In diesem spezifischen TEM-Mikrographen sind Protuberanzen auf der Oberfläche von Kryptokokkenzellen deutlich zu sehen. Zuvor wurde theoretisiert, dass diese Zelloberflächenstrukturen Kanäle sind, durch die 3-Hydroxy-Fettsäuren in die Umgebung freigesetzt werden. Bis zu dem Punkt, Diese Kanäle können helfen, 3-Hydroxy-Fettsäuren in das Lumen der Nahrung Vakuole von Amöben zu liefern, um die inneren Bedingungen zu ändern, daher die Förderung des Zellüberlebens.pHrodo oder wie FITC kann ein viel besserer Fleck zu verwenden, da es nur fluoreszieren bei einem niedrigen pH-Wert, wie innerhalb der Nahrung Vakuole. Um genau zu sein, pHrodo erlaubt dem Forscher nur, Daten über internalisierte Zellen zu erhalten. Zu diesem Zweck ist es wichtig, dass die Zellen vor der Färbung in der Phosphatpufferlösung suspendiert werden und dass Amöbenmedien einen neutralen pH-Wert haben.Transmissionselektronenmikroskop-Betreiber müssen gut ausgebildet sein, um richtig zu schneiden, da dies oft der Punkt ist, an dem die Ergebnisse verzerrt und die Mikrographik durch Elektronenbeschuss beschädigt werden könnte. Es ist vorgesehen, dass die Forscher in der Lage sein werden, genügend Informationen aus dem vorgelegten Protokoll zu nehmen und sie in ihren eigenen Studien zu optimieren. Darüber hinaus können Forscher auch Antikörper gegen gezielte Metaboliten entwickeln und sie während ihrer immunfluoreszierenden Mikroskopiestudie einschließlich der Immungold-Kennzeichnung während der TEM-Untersuchung anwenden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Die Beurteilung der Leber metabolischen Veränderungen während Progressive Colonization von Keimfrei Maus durch 1 H-NMR-Spektroskopie

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studieren Wechselwirkungen von<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen humanem Vollblut und Endothel

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuelle und Mikroskopische Auswertung von Streptomyces Entwicklungsstörungen Mutanten

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Analyse der SAMHD1-Restriktion durch Durchflusszytometrie in humanen myeloischen U937-Zellen

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...