Name: complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions
Uploaded: 2019-06-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions at JoVE.com

העבודה נתמכת על ידי מענק מקרן המחקר הלאומי של דרום אפריקה (מספר המענק: UID 87903) והאוניברסיטה של המדינה החופשית. אנו גם אסירי תודה לשירותים ולסיוע המוצעים על ידי פיטר ואן ווינק והנלי גרובלר במהלך לימודי המיקרוסקופיה שלנו.

הצפנת קריפטוקוקוס וכמה זנים קסטאנימה של הקואקאז נחשבים ברמה אבטחה טיחות 2 (bsl-2) פתוגנים; לכן, החוקרים חייבים לנקוט אמצעי זהירות נאותים כאשר עובדים עם אורגניזמים אלה. לדוגמה, על אנשי המעבדה להיות בעלי הכשרה מסוימת וציוד הגנה אישי (PPE) כגון מעילי מעבדה, כפפות והגנת עיניים. יש להשתמש ב?...

<ol>
	<li>Barton, L. L., Northup, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial Ecology. , (2011).</li><li>Hunter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entente+cordiale:+multiple+symbiosis+illustrates+the+intricate+interconnectivity+of+nature.">Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature.</a> EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).</li><li>Comolli, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+inter-species+interactions+in+microbial+communities.">Intra- and inter-species interactions in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).</li><li>Siddiqui, R., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acanthamoeba+is+an+evolutionary+ancestor+of+macrophages:+a+myth+or+reality?.">Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?.</a> Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).</li><li>Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).</li><li>Steenbergen, J. N., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+virulence+for+the+human+pathogenic+fungus+Cryptococcus+neoformans.">The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans.</a> Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).</li><li>Casadevall, A., Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryptococcus Neoformans. , (1998).</li><li>Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+long+term+storage+of+Acanthamoeba+species.">A simple method for long term storage of Acanthamoeba species.</a> Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).</li><li>Sebolai, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Hydroxy+fatty+acids+found+in+capsules+of+Cryptococcus+neoformans.">3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans.</a> Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).</li><li>Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+acetylsalicylic+acid+on+oxylipin+migration+in+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+UOFS+Y-1378.">The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378.</a> Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).</li><li>Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+and+believing:+recent+advances+in+imaging+cell-cell+interactions.">Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions.</a> F1000 Research. , e6435.1 (2015).</li><li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing+-+multiscale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology.">Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).</li><li>Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+video+microscopy+of+fungal+pathogen+phagocytosis.">Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).</li><li>Duane, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+implementing+a+BLS-2++biosafety+program+in+a+research+laboratory.">A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory.</a> Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).</li><li>Madu, U. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcal+3-hydroxy+fatty+acids+protect+cells+against+amoebal+phagocytosis.">Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis.</a> Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).</li><li>Smith, D., Onions, A. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).</li><li>Schuster, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+pathogenic+and+opportunistic+free-living+amebas.">Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).</li><li>Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high+sensitivity+dectection+of+incorporated+bromodeoxyuridine.">An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li><li>Clancy, B., Cauller, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+sections+following+immersion+in+sodium+borohydride.">Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride.</a> Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).</li><li>Simons, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytosis+and+of+phagosomal+environment+in+polymorphonuclear+phagocytes+by+flow+cytometry.">Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+pH+Probes.">Ratiometric Imaging of pH Probes.</a> MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).</li><li>van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascospores+ultrastructure+and+development+in+Ophiostoma+cucullatum.">Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum.</a> Mycologia. 83, 698-707 (1991).</li><li>Spur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+viscosity+epoxy+resin+embedding+medium+for+electron+microscopy.">A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy.</a> Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).</li><li>Department of Minerals and Energy. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Cell Biology. 17, 208-212 (1963).</li><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications.">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li><li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages.">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcusneoformans+phagocytosis+by+macrophages.">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).</li><li>Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+role+of+3-hydroxy+fatty+acids+in+Cryptococcus-amoeba+interactions.">Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions.</a> Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).</li><li>Hayes, B. K., Heit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).</li><li>Meindl, C., &#214;hlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+methods+to+determine+nanoparticle+uptake+by+phagocytes+and+non-phagocytic+cells+in+vitro.">Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro.</a> Toxicology. 378, 25-36 (2017).</li></ol>

בעיתון, טכניקות שונות המועסקים בהצלחה כדי לחשוף את התוצאה האפשרית שעלולים להתעורר כאשר אמבה אינטראקציה עם תאים cryptococcal. כמו כן, היינו מעוניינים להראות את ההשפעות של חומצות שומן 3-הידרורוקסי על התוצאה של אינטראקציות של הקריפטוקוקוס-אמבה.
הטכניקה הראשונה שהייתה בשימוש ה?...

החיידקים התפתחו לאורך זמן כדי לכבוש ולשגשג נישות אקולוגיות שונות כגון הגבולות הפיזיים פתוח של הקרקע והמים, בין היתר1. בגומחות אלה, חיידקים לעתים קרובות לעסוק בתחרות ישירה עבור משאבים מוגבלים; חשוב מכך, עבור חומרים מזינים שהם משתמשים בהם לתמיכה בצמיחה או במרחב שלהם, שהם צריכים להתאים לאוכלוסיה המתרחבת2,3. במקרים מסוימים, כמה אורגניזמים הולואיקון כמו אמבה אולי אפילו קדומים על התאים cryptococcal כדרך לחילוץ חומרים מזינים מתוך ביומסה שלהם4,5. בתורו, זה מאפשר אורגניזמים כאלה להקים שליטה טריטוריאלית באמצעות שליטה על מספר האוכלוסייה של טרפו. בגלל הלחץ הטורף הזה, אפשר לבחור טרף כדי לייצר גורמים מיקרוביאלית, כמו כמוסה הקריפטוקוקאל6, כדי ליישב את ההשפעות השליליות של הלחץ. עם זאת, כתוצאה בלתי מכוונת של לחץ זה, כמה חיידקים לרכוש גורמים המאפשרים להם לחצות את מחסום המינים ולחפש נישות חדשות ליישב7, כמו חללים סגורים של גוף האדם כי הם עשירים בחומרים מזינים יש אידיאלי תנאים. האחרון עשוי להסביר כיצד חיידק יבשתי כמו קריפטוקוקוס (C.) נאופורמנים יכולים להפוך. להיות פתוגניים
לשם כך, חשוב ללמוד את הקשר הראשוני כי תאים cryptococcal עשוי להיות עם אמבה וכיצד זה יכול לבחור אותם להיות פתוגניים. באופן ספציפי יותר, זה עשוי לתת רמזים על איך תאים cryptococcal להתנהג כאשר פעלו על ידי מקרופאגים במהלך הזיהום. זה בגלל הסיבה כי אמבה נבחרה כמודל עבור מקרופאגים כאן, כפי שהוא זול יחסית קל לשמור על תרבות של אמבה במעבדה8. העניין היה גם לבדוק כיצד הקריפטוקותא משנית משני מטבוליטים. 3-חומצות שומן הידרורוקסי9,10 להשפיע על האינטראקציה בין אמבות ותאי cryptococcal.
דרך פשוטה של תפיסת האינטראקציה בין אמבה וטרפו עם עין בלתי היא ליצור מדשאה באמצעות טרפו על פני השטח של צלחת אגר ואמבה ספוט. ויזואליזציה של לוחיות או אזורים ברורים על צלחת אגר מתאר אזורים שבהם אמבה אולי ניזון טרף שלה. עם זאת, ברמת מאקרו זו, רק את תוצאת התהליך הוא ציין, והתהליך של phagocyציטוזה הוא ממוכן לא ניתן לצפות. לכן, כדי להעריך את התהליך על בסיס תא-לתא, ישנן מספר שיטות מיקרוסקופיים שניתן להשתמש בהן11,12. לדוגמה, מיקרוסקופ הפוך עם תא דגירה יכול לשמש להקליט וידאו לשגות זמן של אירועים בין תא phagocytic היעד שלה13. למרבה הצער, בשל העלות של מיקרוסקופ עם פונקציונליות זמן לשגות, זה לא תמיד אפשרי מעבדות לרכוש כזה מיקרוסקופ, במיוחד במשאבים עניים-הגדרות.
כדי לעקוף את המגבלה שלעיל, מחקר זה מציג עיצוב סדרתי שמעריך את האינטראקציה של ה- c. neoformans מק. נאופורמנים 1378 ו- c. neoformans Lmpe 046 עם הקואקאואמבה קסטאני . ראשית, נעשה שימוש בשיטה איכותית הקודמת לשיטה כמותית. תמונות סטילס לכוד באמצעות מיקרוסקופ הפוך מעין פלואורסצנטית, כמו גם מיקרוסקופ אלקטרון שידור לתאר את האינטראקציות אמבה-קריפטוקוקוס . זה היה לאחר מכן על ידי כימות זריחה באמצעות קורא צלחת להעריך את היעילות של אמבה להפנים תאים cryptococcal. כאשר ליישב ממצאים משיטות אלה בשלב פרשנות הנתונים, זה עשוי לחשוף באופן שווה את המידע הקריטי הרבה כמו pergocyציטוזה מעידה בזמן וידאו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="782">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D27802</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-mL plastic tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">69715</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">7252018</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1132017</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">8-Well chamber slide</td>
			<td style="width:176px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1109650</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Acetone</td>
			<td style="width:176px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SAAR1022040LC</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Amoeba strain</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">30234TM</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">ATCC medium 712</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">712TM</td>
			<td style="width:172px;">Amoeba medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">152089</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Hermle</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Chloroform</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2432</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:176px;">Nikon</td>
			<td>Nikon TE 2000</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Epoxy resin:</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[1] NSA</td>
			<td style="width:176px;">[1] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[1] R1054</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[2] DER 736</td>
			<td style="width:176px;">[2] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[2] R1073</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[3] ERL Y221 resin</td>
			<td style="width:176px;">[3] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[3] R1047R</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)</td>
			<td style="width:176px;">[4] ALS&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[4] R1067</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F4274</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">489441</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroskan Ascent FL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">374-91038C</td>
			<td style="width:172px;">Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glucose</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1009</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:176px;">Boeco</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1209</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Chromatography Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Methanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">R 34,860</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Osmium tetroxide</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1015</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">pHrodo Green Zymosan A BioParticles</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">P35365</td>
			<td style="width:172px;">This is the pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Physiological buffer solution</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P4417-50TAB</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:176px;">Labcon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Sodium phosphate buffer:</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate&#160;</td>
			<td style="width:176px;">[1] Merck</td>
			<td style="width:123px;">[1] 106580</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate</td>
			<td style="width:176px;">[2] Merck&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[2] 106345</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:176px;">Philips</td>
			<td>Philips EM 100&#160;</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Trypan blue&#160;</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8154</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:176px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">EM UC7</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1260A</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vacuum dessicator</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vial</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">29651-U</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YNB</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">239210</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YPD agar</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Y-1500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions

כדי לדמות זיהום קריפטוקוקוס , אמבה, אשר הוא טורף טבעי של תאים cryptococcal בסביבה, יכול לשמש כמודל עבור מקרופאגים. זה אורגניזם טורף, דומה מקרופאגים, מעסיקה phagocyציטוזה כדי להרוג תאים הפנימו. בעזרתו של מיקרוסקופ לייזר ממוקד סריקה, תמונות המתארים רגעים אינטראקטיביים בין תאים cryptococcal ו אמבה נלכדים. הכוח החלטה של מיקרוסקופ אלקטרון גם מסייע לחשוף את הפרטים בדיקת אולטרה מבנית של תאים cryptococcal כאשר לכודים בתוך מזון אמבה ולאחר. מאז phagocyציטוזה הוא תהליך רציף, נתונים כמותיים משולבים אז בניתוח כדי להסביר מה קורה בנקודת הזמן כאשר התמונה נלכדה. כדי להיות ספציפיים, יחידות הזריחה יחסית נקראים על מנת לכמת את היעילות של אמבה הפנמה תאים cryptococcal. למטרה זו, תאים cryptococcal מוכתמים בצבע שהופך אותם זרוח פעם לכודים בתוך הסביבה החומצית של המזון ולבולית. כאשר נעשה שימוש יחד, מידע שנאסף באמצעות טכניקות כאלה יכול לספק מידע קריטי כדי לעזור להסיק מסקנות על ההתנהגות ועל גורלם של תאים כאשר הפנפו על ידי אמבה, ואולי, על ידי תאי phagocytic אחרים.

חיידקים הם אורגניזמים מיקרוסקופיים שאי אפשר להיתפס עם עין בעירום. עם זאת, ההשפעה שלהם עלולה לגרום למחלות קליניות מובנת, כגון דלקות עור. כאשר לומדים היבטים מסוימים של חיידקים, החל מורפולוגיה שלהם, תוצרי לוואי ואינטראקציות, להיות מסוגל לספק ראיות ציורית ווידאו הוא בעל חשיב...

Watch this Scientific Journal Video about Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions at JoVE.com

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במיקרוסקופיה ככלי לחקר הפגוציטוזיס של המין הפטרייתי הפתוגניים Cryptococcus neoformans על ידי אמבה הטורף הסביבתי שלה. וידאו זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ואמבה אשר אני אלמד באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקאלי מיקרוסקופיה אלקטרונים שידור. מידע המתקבל משימוש בטכניקות אלה יכול לשפוך תובנות על התנהגותם של תאים קריפטו-אקוסאליים כאשר הם מוחפנים במהלך ההדבקה.תפסו את הזנים הפטרייתיים של המבחן על צלחות אגר YPD. דגירה הצלחת במשך 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. מגרדים לולאה של תאים מהצלחת בת 48 השעות ומחסן אותם לתוך בקבוק חרוט 250 מיליליטר המכיל 100 מיליליטר של מרק YNB כי הוא בתוספת 4% גלוקוז.דגירה הבקבוק ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות על שייקר סיבובי. לאחר תקופת דגירה של 24 שעות, לספור את התאים הפטרייתיים באמצעות hemocytometer ולהתאים את מספר התא למיליון תאים למיליליטר עם פתרון חיץ פיזיולוגי. מטפחים תאי אמבה בשמרי פפטון מחלצים מרק גלוקוז במשך שבוע ב-30 מעלות צלזיוס.לספור את תאי amoeba באמצעות hemocytometer ולהתאים את מספר התא ל 10 מיליון תאים למיליליטר עם בינוני ATCC סטרילי טרי 712. לאחר מכן, בצע בדיקת כדאיות באמצעות כתם כחול טריפאן. מומלץ לעבוד עם תאים ה מראים לפחות 80%הכדאיות.לוותר על השעיה 200 מיקרוליטר של תאי אמובה מתוקננים לתאים של שקופית חסידה. אפשר שעתיים לעבור לתאים לדבוק על פני השטח ב 30 מעלות צלזיוס. בעוד תאי אמבה מתיישבים, להכתים את תאי cryptococcal מתוקן עם פלואורסין isothiocyanate.מתסיסים בעדינות את התאים הפטרייתיים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ובחושך. לוותר על 200 מיקרוליטר השעיה של תאים cryptococcal מוכתמים לאחר שטיפה לתאים המתאימים שכבר מכילים תאי אמובה. הדגירה את התרבות ההפוכה ב 30 מעלות צלזיוס לתקופה נוספת של שעתיים.בסוף תקופת המטבע, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר את כל תאי amoeba לא מאוגדים כולל תאים cryptococcal לא מופנם. שאפו את הגלוטארלדהיד ששימש לתיקון התאים, ושטפו את התא פעמיים עם PBS. לפרק את השקופית התאית.הצג את התאים התת-תרבותיים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל. כדי להשלים את ההתעקשות לעיל, להכתים את התאים cryptococcal עם צבע pHrodo אשר באופן סלקטיבי מאפשר קריאה של תאים לכודים בתוך vacuole מזון. מחלקים את התאים המוכתמים האלה לתוך בארות של צלחת מיקרוטיטר חסיד שחור שכבר מכילה תאי אמבה זרעים.למדוד פלואורסצנטיות על קורא מיקרופלסטיק שיכול להמיר אותות לוגריתמיים ליחידות פלואורסצנטיות יחסית. הוסף חמישה מיליליטר של תאים קריפטו-ccal מתוקננים לאותו צינור צנטריפוגה שכבר מכיל חמישה מיליליטר של תאי אמובה מתוקננים. אפשר לצינור לעמוד במשך שעתיים ב-30 מעלות צלזיוס.שאף את העל-טבעי לאחר הצנטריפוגה. תקן את גלולה המייצג את תאים מתורבתים במשותף עם טוחנת אחת של נתרן פוספט מאגר 3%glutaraldehyde ב pH 7 במשך שלוש שעות. לשטוף את התאים בתרבות שותף פעם אחת עם מאגר נתרן פוספט.תקן שוב במשך 1 1/2 שעות במאגר דומה 1%osmium tetroxide ואחריו כביסה. ייבש את חומר ה- TEM הידוע גם כתאים מתורבתים במשותף בסדרת אצטון מדורגת של 30%50%70%95% ו- 100% במשך 15 דקות כל אחד. כאן, חזור על שלב ההתייבשות הסופי בשני שינויים.הכן את שרף אפוקסי על ידי שקילה את אפוקסי של עקביות נורמלית. להטמיע חומר לתוך שרף אפוקסי. פולימריזציה של חומר TEM במשך שמונה שעות ב 70 מעלות צלזיוס.חותכים קטעים של 16 ננומטר עם סכיני זכוכית המותקנים על האולטרה-אטומ. להכתים את החלקים עם אצטט אורניל במשך 10 דקות בחושך ואחריו ציטראט עופרת במשך 10 דקות, גם בחושך. הצג את החלקים עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.לשם המחשה, בסרטון נבדקים שני מבודדים, האחד מייצר חומצת שומן 3-הידרוקסי והשני שאינו. להלן תמונות המוצגות רגעים אינטראקטיביים בין קריפטוקוס לאמבה.לנקודה, תא cryptococcal לפני ואחרי הפנמה ניתן לראות. כאשר לומדים phagocytosis, זה אידיאלי לעשות שימוש הדמיה חיה. עם זאת, זה לא תמיד אפשרי עבור חוקרים יש גישה למיקרוסקופ כזה על מנת לעקוב אחר תהליך של phagocytosis ברציפות.פתרון אפשרי לפיצוי על מגבלה זו עשוי להיות השלמת תמונות עם נתונים כמותיים באמצעות קריאה של יחידות פלואורסצנטיות יחסית. גרף עמודות הוא דוגמה לנתונים שבהם השתמשתי כדי להשלים את התמונות. חשוב לציין, הן את הנתונים האיכותיים בצורה של תמונות ואת הנתונים הכמותיים ניתן לקחת בנקודות זמן שונות לאורך זמן.על ידי piecing כל המידע, אפשר להתחיל לבנות תמונה גדולה יותר של מה שמתרחש במהלך תהליך של phagocytosis. מהנתונים הכמותיים, ברור לראות כי התאים עם חומצות שומן 3-הידרוקסי רגישים פחות לפעולת אמבה בהשוואה לתאים שאינם מייצרים חומצת שומן 3-הידרוקסי כמו תאים פחות מופנמים. TEM הוא כלי רב עוצמה במיוחד כפי שהוא יכול לתת מבט ממעוף הציפור לתוך הלומן של vacuole מזון בגלל כוחו ברזולוציה גבוהה, וזה סוג של פרט כי הוא החמיץ לעתים קרובות בעת בחינת הדמיה חיה, כמו גם תמונות סטילס.במיקרוגרף TEM ספציפי זה, ניתן לראות בבירור פרובינסים על פני השטח של תאים קריפטו-סקופיים. בעבר, זה היה תיאוריה כי מבנים אלה פני השטח של התא הם ערוצים שבהם 3-הידרוקסי חומצות שומן משתחררים לסביבה שמסביב. לעניין, ערוצים אלה עשויים לעזור לספק 3-הידרוקסי חומצות שומן לתוך הלומן של vacuole המזון של אמבה כדי לשנות את התנאים הפנימיים, ומכאן קידום ההישרדות של התא.pHrodo או כמו FITC עשוי להיות כתם הרבה יותר טוב להשתמש כפי שהוא רק פלואורסצנטי ב- pH נמוך, כמו בתוך vacuole מזון. כדי להיות ספציפי, pHrodo רק מאפשר לחוקר להשיג נתונים לגבי תאים הפנימו. לשם כך, חשוב כי תאים מושעים בת פתרון חיץ פוספט לפני הכתמה, כי מדיה amoeba הוא של pH ניטרלי.מפעילי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור הם להיות מאומנים היטב לקטע כראוי כמו זה לעתים קרובות הנקודה שבה התוצאות יכולות להיות מעוותות מיקרוגרף פגום על ידי הפצצת אלקטרונים. הוא חזה כי החוקרים יוכלו לקחת מספיק מידע מהפרוטוקול שהוצג ולייעל אותם במחקרים שלהם. יתר על כן, החוקרים עשויים גם לפתח נוגדנים נגד מטבוליט ממוקד ולהחיל אותם במהלך מחקר מיקרוסקופיה immunofluorescent שלהם כולל תיוג אימונוגולד במהלך בדיקת TEM.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

הערכת שינויים מטבוליים כבדית במהלך להתיישבות מתקדמת של עכבר נבט בחינם על ידי 1 H NMR ספקטרוסקופיה

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

רומן<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

ניתוח של הגבלת SAMHD1 על ידי ציטומטריה של זרימה בתאי מיאלואיד U937 אנושיים

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...