Name: complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions
Uploaded: 2019-06-22T13:00:00
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この研究は、南アフリカ国立研究財団(助成番号:UID 87903)と自由国家大学からの助成金によって支援されました。また、顕微鏡検査研究中にピーター・ヴァン・ワイクとハンリー・グロブラーが提供するサービスと支援にも感謝しています。

クリプトコッカスネオフォーマンといくつかのアカントアメーバカステラニ株は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)病原体とみなされます。したがって、研究者は、これらの生物を扱う際に適切な予防措置を取る必要があります。例えば、ラボの担当者は、ラボコート、手袋、目の保護などの特定のトレーニングおよび個人用保護具(PPE)を持っている必要があります。生物学的安全...

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論文では、アメーバがクリプトコッカス細胞と相互作用する際に生じる可能性のある結果を明らかにするために、さまざまな技術がうまく用いられた。また、クリプトコッカス-アメーバ相互作用の結果に対する3-ヒドロキシ脂肪酸の影響を示すことに興味を持った。
最初に使用された技術は、静止画をレンダリングした共焦点顕微鏡検査でした。ここでのこの手?...

微生物は、土壌と水の開いた物理的境界などの異なる生態学的ニッチを占有し、繁栄するために時間をかけて進化してきました。これらのニッチでは、微生物はしばしば限られた資源のための直接競争に従事します。重要なことは、彼らが拡大する人口2、3を収容するために必要な成長または空間をサポートするために使用する栄養素のために。特定の例では、アメーバのようないくつかのホロゾニック生物は、バイオマス4、5から栄養素を抽出する方法としてクリプトコッカス細胞に先行することさえある。その結果、このような生物は、獲物の個体数を制御することにより、領土の支配を確立することができます。この捕食圧のために、一部の獲物は、圧力の負の影響を和らめるために、クリプトコッカスカプセル6などの微生物因子を生成するために選択されてもよい。しかし、この圧力の意図しない結果として、一部の微生物は、種の障壁を越え、栄養素が豊富で理想を持つ人体の限られた空間のように、7を植民地化するための新しいニッチを探し出すことを可能にする因子を獲得する。条件。後者は、クリプトコッカスのような地上微生物がどのように説明するか(C.)ネオフォーマンは病原性に変容する可能性があります。
そのためには、クリプトコッカス細胞がアメーバと共に持つ可能性のある初期接触と、これが病原性になるためにそれらを選択する方法を研究することが重要です。より具体的には、これは、感染中にマクロファージによって作用したクリプトコッカス細胞がどのように動作するかの手がかりを与える可能性があります。アメーバは、研究室8でアメーバの培養を比較的安価で維持しやすいため、マクロファージのモデルとして選ばれたのはこのためです。興味深いのは、クリプトコッカス二次代謝産物viz.3−ヒドロキシ脂肪酸9、10がアメーバとクリプトコッカス細胞との相互作用にどのように影響するかを調べることであった。
アメーバとその獲物と肉眼との相互作用を知覚する簡単な方法は、寒天プレートとスポットアメーバの表面に獲物を使用して芝生を作成することです。寒天プレート上のプラークまたはクリアゾーンの視覚化は、アメーバが獲物に餌を与えた可能性のある領域を示しています。しかし、このマクロレベルでは、プロセスの結果のみが指摘され、咽頭細胞症が機械化される過程は観察できない。したがって、細胞間ベースでプロセスを評価するために、11、12を使用することができるいくつかの顕微鏡的方法がある。例えば、インキュベーションチャンバを有する反転顕微鏡は、咽頭細胞とその標的13との間の事象のタイムラプスを記録するために使用することができる。残念ながら、タイムラプス機能を備えた顕微鏡のコストのために、実験室は、特にリソースの貧弱な設定で、このような顕微鏡を購入することが常に可能であるとは限りません。
上記の制限を回避するために、本研究は、C.ネオフォルマンスviz C.ネオフォルマンスUOFS Y-1378とC.ネオフォルマンスLMPE 046とアカンタモエバ・カステラニとの相互作用を評価する順次探索的設計を提示する。.まず、定量的方法に先行する定性的な方法が用いられる。静止画は、反転蛍光顕微鏡と透過電子顕微鏡を使用して撮影され、アメーバ-クリプトコッカス相互作用を描写します。続いて、プレートリーダーを用いて蛍光を定量し、クリプトコッカス細胞を内部化するアメーバの効率を推定した。データ解釈段階でこれらの方法から得られた結果を調整する場合、これは、咽頭細胞症のタイムラプスビデオを熟読するのと同じくらい重要な情報を明らかにする可能性があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="782">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D27802</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-mL plastic tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">69715</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">7252018</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1132017</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">8-Well chamber slide</td>
			<td style="width:176px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1109650</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Acetone</td>
			<td style="width:176px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SAAR1022040LC</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Amoeba strain</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">30234TM</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">ATCC medium 712</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">712TM</td>
			<td style="width:172px;">Amoeba medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">152089</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Hermle</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Chloroform</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2432</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:176px;">Nikon</td>
			<td>Nikon TE 2000</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Epoxy resin:</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[1] NSA</td>
			<td style="width:176px;">[1] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[1] R1054</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[2] DER 736</td>
			<td style="width:176px;">[2] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[2] R1073</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[3] ERL Y221 resin</td>
			<td style="width:176px;">[3] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[3] R1047R</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)</td>
			<td style="width:176px;">[4] ALS&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[4] R1067</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F4274</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">489441</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroskan Ascent FL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">374-91038C</td>
			<td style="width:172px;">Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glucose</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1009</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:176px;">Boeco</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1209</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Chromatography Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Methanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">R 34,860</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Osmium tetroxide</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1015</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">pHrodo Green Zymosan A BioParticles</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">P35365</td>
			<td style="width:172px;">This is the pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Physiological buffer solution</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P4417-50TAB</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:176px;">Labcon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Sodium phosphate buffer:</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate&#160;</td>
			<td style="width:176px;">[1] Merck</td>
			<td style="width:123px;">[1] 106580</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate</td>
			<td style="width:176px;">[2] Merck&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[2] 106345</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:176px;">Philips</td>
			<td>Philips EM 100&#160;</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Trypan blue&#160;</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8154</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:176px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">EM UC7</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1260A</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vacuum dessicator</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vial</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">29651-U</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YNB</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">239210</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YPD agar</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Y-1500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions

クリプトコッカス感染をシミュレートするために、環境中のクリプトコッカス細胞の自然捕食者であるアメーバをマクロファージのモデルとして使用することができます。この捕食生物は、マクロファージと同様に、内在細胞を殺すために食細胞細胞症を採用している。共焦点レーザー走査顕微鏡の助けを借りて、クリプトコッカス細胞とアメーバの間のインタラクティブな瞬間を描いた画像がキャプチャされます。電子顕微鏡の分解能はまた、アメーバ食品の真空中に閉じ込められたときにクリプトコッカス細胞の超構造的な詳細を明らかにするのに役立ちます。咽頭症は連続的なプロセスであるため、定量的なデータを分析に統合して、画像がキャプチャされた時点で何が起こるかを説明します。具体的には、クリプトコッカス細胞の内部化におけるアメーバの効率を定量するために相対蛍光単位が読み取られる。この目的のために、クリプトコッカス細胞は、食品真空の酸性環境の中に一度閉じ込められた蛍石を作る色素で染色されます。このような技術を通じて収集された情報は、アメーバによって内部化された場合、および場合によっては他の食細胞によって細胞の挙動と運命に関する結論を導き出すのに役立つ重要な情報を提供することができます。

微生物は肉眼では知覚できない微生物です。しかし、その影響は、皮膚感染症などの観察可能な臨床的に明らかな病気をもたらす可能性があります。微生物の形態、副産物、相互作用に至るまで、微生物の特定の側面を研究する際に、絵画やビデオの証拠を提供できることが最も重要です。
まず、クリプトコッカス細胞?...

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Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

本論文では、静止画、蛍光画像、高解像度透過電子顕微鏡画像を用いて研究されたクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を調製するためのプロトコルについて詳しく述べたい。次に示すように、定量的データがこのような定性的情報を補完する方法について説明します。

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

この手順の全体的な目的は、その環境捕食者アメーバによって病原性真菌種クリプトコッカスネオフォルマンの貪食を研究するためのツールとして顕微鏡を使用することです。このビデオでは、共焦点レーザー走査顕微鏡と透過電子顕微鏡を用いて研究するクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を準備するためのプロトコルについて詳しく説明します。これらの技術を使用して得られた情報は、感染中に内在化したクリプトコッカス細胞の挙動に関する洞察を流す可能性がある。YPD寒天プレート上のテスト真菌株を抜き出す。プレートを摂氏30度で48時間インキュベートします。48時間齢のプレートからループ状の細胞を削り取り、4%グルコースを補充した100ミリリットルのYNBスープを含む250ミリリットルの円錐形フラスコに接種します。回転式シェーカーでフラスコを摂氏30度で24時間インキュベートします。24時間のインキュベーション期間の後、ヘモサイトメーターを使用して真菌細胞を数え、生理学的緩衝液を用いて細胞数を1ミリリットル当たり100万個の細胞に調整する。ペプトン酵母エキスグルコーススープでアメーバ細胞を摂氏30度で1週間培養します。ヘモサイトメーターを使用してアメーバ細胞を数え、新鮮な無菌ATCC培地712で1ミリリットル当たり1000万個の細胞に細胞数を調整します。これに続いて、トリパンブルーの染色を用いて生存アッセイを行う。少なくとも 80% 生存率を示す細胞を操作することをお勧めします。標準化されたアメーバ細胞の200マイクロリットルの懸濁液を付着スライドのチャンバーに分配する。セルが30°Cで表面に付着するまで2時間かかります。アメーバ細胞が落ち着いている間、フルオレセインイソチオシアネートで標準化されたクリプトコッカス細胞を染色します。真菌細胞を室温と暗闇の中で2時間静かに攪拌します。すでにアメーバ細胞を含む適切なチャンバーに洗浄した後、染色されたクリプトコッカス細胞の200マイクロリットルの懸濁液を分配する。さらに2時間の間、摂氏30度で準備した共文化をインキュベートします。コインキュベーション期間の終わりに、PBSでチャンバーを2回洗浄して、非内在性クリプトコッカル細胞を含む非結合アメーバ細胞を除去します。細胞を固定するために使用したグルタルアルデヒドを吸引し、チャンバーをPBSで2回洗浄した。チャンバースライドを解体します。共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて共培養細胞を見る。上記アッセイを補完するために、クリプトコッカス細胞をpHrodo色素で染色し、食品液胞内に閉じ込められた細胞の読み取りを選択的に可能にする。これらの染色された細胞を、既に播種されたアメーバ細胞を含む黒い付着マイクロティタープレートのウェルに分配します。対数信号を相対的な蛍光単位に変換できるマイクロプレートリーダーで蛍光を測定します。標準化されたアメーバ細胞の5ミリリットルを既に含んでいる同じ遠心管に標準化されたクリプトコッカル細胞の5ミリリットルを追加します。チューブを摂氏30度で2時間放置します。遠心後に上清を吸引する。pH 7で3%グルタルアルデヒドを3%緩衝したリン酸ナトリウムの1モルで共培養細胞を表すペレットを3時間固定する。共培養細胞をリン酸ナトリウムバッファーで一度洗います。同様に緩衝した1%オスミウム四酸化された後に洗浄を行い、1時間半再び固定します。30%50%70%95%と100%の等級アセトン系列で共培養細胞としても知られているTEM材料を脱水し、それぞれ15分間。ここで、2つの変更で最後の脱水ステップを繰り返す。正常な一貫性のエポキシを計量してエポキシ樹脂を調製します。エポキシ樹脂に材料を埋め込みます。70°Cで8時間、TEM材料を重合します。ウルトラトームに取り付けられたガラスナイフで16ナノメートルの切片をカットします。ウラニル酢酸で10分間のセクションを汚し、続いて10分間クエン酸鉛を、暗闇の中で。透過型電子顕微鏡で切片を見る。例証的な目的のために、ビデオでは、3-ヒドロキシ脂肪酸を産生する2つの分離株と、3-ヒドロキシ脂肪酸を産生しない2つの分離株を調べる。クリプトコッカスとアメーバの間のインタラクティブな瞬間を示すスナップショットを次に示します。要するに、内在化の前後のクリプトコッカス細胞が観察される。食細胞化を研究する際には、ライブイメージングを利用するのが理想的です。しかし、研究者が食細胞化のプロセスを継続的に進めるために、このような顕微鏡にアクセスできるわけではありません。この制限を補うための可能な解決策は、相対的な蛍光単位の読み取りを通じて定量的なデータを持つ画像を補い得る。棒グラフは、画像を補完するために使用したデータの例です。重要なのは、画像の形式の定性的データと定量的データの両方が、時間の経過とともに異なる時点で取得できることです。すべての情報を突き出すことによって、貪食の過程で何が起こるかのより大きなイメージを構築し始めることができます。定量的データから、3-ヒドロキシ脂肪酸を有する細胞は、内在する細胞が少ないため3-ヒドロキシ脂肪酸を産生しない細胞と比較してアメーバ作用の影響を受けにくいことが明らかである。TEMは、高解像度のパワーのために食品の空腔に鳥瞰図を与えることができるので、特に強力なツールであり、これはライブイメージングだけでなく、静止画を調べるときにしばしば見逃される詳細の一種です。この特定のTEM顕微鏡写真では、クリプトコッカル細胞の表面上の突起がはっきりと見える。これまで、これらの細胞表面構造は、3−ヒドロキシ脂肪酸が周囲の環境に放出されるチャネルであると理論化した。要するに、これらのチャネルは、アメーバの食品液胞内に3−ヒドロキシ脂肪酸を送達して内部条件を変化させるのに役立ち、したがって細胞生存の促進をもたらす。pHrodoまたはFITCのようなは、食品の液胞内のように、低pHでのみ蛍光を発するので、はるかに良い染色かもしれません。具体的には、pHrodoは、研究者が内部化された細胞に関するデータを得ることを可能にするだけです。この末、細胞は染色前にリン酸緩衝液中に懸濁され、アメーバ培地は中性pHである事が重要です。透過型電子顕微鏡のオペレータは、結果が歪み、電子爆撃によって微量撮影が損傷する可能性が高いため、適切に断面化するように十分な訓練を受ける必要があります。研究者は、提示されたプロトコルから十分な情報を取り出し、独自の研究でそれらを最適化することができると想定されています。さらに、研究者は、標的代謝産物に対する抗体を開発し、TEM検査中の免疫金標識を含む免疫蛍光顕微鏡検査研究中に適用することもできます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

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It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

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放線菌突然変異体のビジュアルと顕微鏡的評価

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Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

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