Name: complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions
Uploaded: 2019-06-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions at JoVE.com

Arbeidet ble støttet av et stipend fra National Research Foundation of South Africa (Grant nummer: UID 87903) og Universitetet i Fristaten. Vi er også takknemlige for tjenester og assistanse som tilbys av Pieter van Wyk og Hanlie Grobler under våre mikroskopi studier.

Cryptococcus neoformans og noen Acanthamoeba castellanii stammer regnes som biosafety Level-2 (BSL-2) patogener; Dermed må forskerne ta riktige forholdsregler når du arbeider med disse organismer. Laboratoriepersonell bør for eksempel ha spesifikk opplæring og personlig verneutstyr (PPE), for eksempel laboratorie frakker, hansker og øyebeskyttelse. Et biologisk sikkerhetskabinett (nivå 2) bør brukes til prosedyrer som kan forårsake infeksjon14.
1...

<ol>
	<li>Barton, L. L., Northup, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial Ecology. , (2011).</li><li>Hunter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entente+cordiale:+multiple+symbiosis+illustrates+the+intricate+interconnectivity+of+nature.">Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature.</a> EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).</li><li>Comolli, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+inter-species+interactions+in+microbial+communities.">Intra- and inter-species interactions in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).</li><li>Siddiqui, R., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acanthamoeba+is+an+evolutionary+ancestor+of+macrophages:+a+myth+or+reality?.">Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?.</a> Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).</li><li>Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).</li><li>Steenbergen, J. N., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+virulence+for+the+human+pathogenic+fungus+Cryptococcus+neoformans.">The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans.</a> Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).</li><li>Casadevall, A., Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryptococcus Neoformans. , (1998).</li><li>Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+long+term+storage+of+Acanthamoeba+species.">A simple method for long term storage of Acanthamoeba species.</a> Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).</li><li>Sebolai, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Hydroxy+fatty+acids+found+in+capsules+of+Cryptococcus+neoformans.">3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans.</a> Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).</li><li>Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+acetylsalicylic+acid+on+oxylipin+migration+in+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+UOFS+Y-1378.">The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378.</a> Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).</li><li>Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+and+believing:+recent+advances+in+imaging+cell-cell+interactions.">Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions.</a> F1000 Research. , e6435.1 (2015).</li><li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing+-+multiscale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology.">Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).</li><li>Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+video+microscopy+of+fungal+pathogen+phagocytosis.">Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).</li><li>Duane, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+implementing+a+BLS-2++biosafety+program+in+a+research+laboratory.">A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory.</a> Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).</li><li>Madu, U. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcal+3-hydroxy+fatty+acids+protect+cells+against+amoebal+phagocytosis.">Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis.</a> Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).</li><li>Smith, D., Onions, A. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).</li><li>Schuster, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+pathogenic+and+opportunistic+free-living+amebas.">Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).</li><li>Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high+sensitivity+dectection+of+incorporated+bromodeoxyuridine.">An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li><li>Clancy, B., Cauller, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+sections+following+immersion+in+sodium+borohydride.">Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride.</a> Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).</li><li>Simons, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytosis+and+of+phagosomal+environment+in+polymorphonuclear+phagocytes+by+flow+cytometry.">Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+pH+Probes.">Ratiometric Imaging of pH Probes.</a> MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).</li><li>van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascospores+ultrastructure+and+development+in+Ophiostoma+cucullatum.">Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum.</a> Mycologia. 83, 698-707 (1991).</li><li>Spur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+viscosity+epoxy+resin+embedding+medium+for+electron+microscopy.">A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy.</a> Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).</li><li>Department of Minerals and Energy. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Cell Biology. 17, 208-212 (1963).</li><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications.">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li><li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages.">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcusneoformans+phagocytosis+by+macrophages.">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).</li><li>Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+role+of+3-hydroxy+fatty+acids+in+Cryptococcus-amoeba+interactions.">Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions.</a> Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).</li><li>Hayes, B. K., Heit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).</li><li>Meindl, C., &#214;hlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+methods+to+determine+nanoparticle+uptake+by+phagocytes+and+non-phagocytic+cells+in+vitro.">Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro.</a> Toxicology. 378, 25-36 (2017).</li></ol>

I avisen, ulike teknikker ble brukt til å avdekke mulige utfall som kan oppstå når Amoeba samhandle med kryptokokkmeningitt celler. Også var vi interessert i å vise effekten av 3-AHA fettsyrer på utfallet av Cryptococcus-Amoeba interaksjoner.
Den første teknikken som brukes var konfokalmikroskopi mikroskopi, som gjengis stillbilder. Den største ulempen med denne teknikken her var at det bare ga oss informasjon som er begrenset til en bestemt timepoint. Enhver konklusjon som ka...

Mikrober har utviklet seg over tid til å okkupere og trives i ulike økologiske nisjer som de åpne fysiske grensene for jord og vann, blant annet1. I disse nisjene, mikrober ofte engasjere seg i direkte konkurranse for begrensede ressurser; viktigere, for næringsstoffer som de bruker for å støtte deres vekst eller plass, som de trenger for å imøtekomme den ekspanderende befolkningen2,3. I visse tilfeller, noen holozoic organismer som Amoeba kan selv predate på kryptokokkmeningitt celler som en måte å utvinne næringsstoffer fra deres biomasse4,5. I sin tur, dette gjør at slike organismer å etablere territorielle dominans via kontrollere befolkningen antall byttet sitt. På grunn av dette ROV presset, kan noen byttedyr velges for å produsere mikrobielle faktorer, slik som kryptokokkmeningitt kapsel6, for å forsone de negative virkningene av trykket. Men som en utilsiktet konsekvens av dette presset, noen mikrober tilegne seg faktorer som tillater dem å krysse arten barriere og oppsøke nye nisjer til kolonisere7, som trange områder av menneskekroppen som er rike på næringsstoffer og har ideelle Forhold. Sistnevnte kan forklare hvordan en bakkenett mikrobe som Cryptococcus (C.) neoformans kan forvandle å bli patogene.
For dette formål er det viktig å studere den første kontakten som kryptokokkmeningitt celler kan ha med Amoeba og hvordan dette kan velge dem til å bli patogene. Mer spesifikt, kan dette gi ledetråder om hvordan kryptokokkmeningitt celler oppfører seg når handlet på av makrofager under infeksjon. Det er av denne grunn at Amoeba ble valgt som modell for makrofager her, som det er relativt billig og lett å opprettholde en kultur for Amoeba i et laboratorium8. Av interesse var å også undersøke hvordan kryptokokkmeningitt sekundære metabolitter viz. 3-AHA fettsyrer9,10 påvirke samspillet mellom amøber og kryptokokkmeningitt celler.
En enkel måte å oppfatte samspillet mellom Amoeba og dens byttedyr med det blotte øye er å skape en plen ved hjelp av sitt byttedyr på overflaten av en agar plate og spot Amoeba. Visualisering av plakk eller klare soner på agar plate viser områder der Amoeba kan ha matet på byttet sitt. Men på dette makro nivået, er bare utfallet av prosessen notert, og prosessen med fagocytose er mekanisert kan ikke observeres. Derfor, for å sette pris på prosessen på en celle-til-celle basis, er det flere mikroskopiske metoder som kan brukes11,12. For eksempel kan en invertert mikroskop med et inkubasjons kammer brukes til video registrere en tidsforløp av hendelser mellom en phagocytic celle og dens mål13. Dessverre, på grunn av kostnaden for et mikroskop med en time-lapse funksjonalitet, er det ikke alltid mulig for laboratorier å kjøpe et slikt mikroskop, spesielt i ressurs fattige-innstillinger.
For å omgå begrensningen ovenfor, presenterer denne studien en sekvensiell undersøkende design som evaluerer samspillet mellom c. neoformans viz c. neoformans UOFS Y-1378 og C. neoformans LMPE 046 med Acanthamoeba Castellani . Først brukes en kvalitativ metode som kommer før en kvantitativ metode. Still bilder er tatt med en invertert fluorescens mikroskop, samt en overføring elektronmikroskop for å skildre Amoeba-Cryptococcus interaksjoner. Dette ble etterfulgt av kvantifisere fluorescens ved hjelp av en plate leser for å anslå effektiviteten av Amoeba å tilegne kryptokokkmeningitt celler. Ved å forsone funn fra disse metodene under data-tolkning scenen, dette kan like avsløre så mye kritisk informasjon som perusing en fagocytose time-lapse video.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="782">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D27802</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-mL plastic tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">69715</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">7252018</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1132017</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">8-Well chamber slide</td>
			<td style="width:176px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1109650</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Acetone</td>
			<td style="width:176px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SAAR1022040LC</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Amoeba strain</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">30234TM</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">ATCC medium 712</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">712TM</td>
			<td style="width:172px;">Amoeba medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">152089</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Hermle</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Chloroform</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2432</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:176px;">Nikon</td>
			<td>Nikon TE 2000</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Epoxy resin:</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[1] NSA</td>
			<td style="width:176px;">[1] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[1] R1054</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[2] DER 736</td>
			<td style="width:176px;">[2] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[2] R1073</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[3] ERL Y221 resin</td>
			<td style="width:176px;">[3] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[3] R1047R</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)</td>
			<td style="width:176px;">[4] ALS&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[4] R1067</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F4274</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">489441</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroskan Ascent FL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">374-91038C</td>
			<td style="width:172px;">Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glucose</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1009</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:176px;">Boeco</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1209</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Chromatography Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Methanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">R 34,860</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Osmium tetroxide</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1015</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">pHrodo Green Zymosan A BioParticles</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">P35365</td>
			<td style="width:172px;">This is the pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Physiological buffer solution</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P4417-50TAB</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:176px;">Labcon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Sodium phosphate buffer:</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate&#160;</td>
			<td style="width:176px;">[1] Merck</td>
			<td style="width:123px;">[1] 106580</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate</td>
			<td style="width:176px;">[2] Merck&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[2] 106345</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:176px;">Philips</td>
			<td>Philips EM 100&#160;</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Trypan blue&#160;</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8154</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:176px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">EM UC7</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1260A</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vacuum dessicator</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vial</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">29651-U</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YNB</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">239210</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YPD agar</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Y-1500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions

For å simulere Cryptococcus infeksjon, Amoeba, som er den naturlige Predator av kryptokokkmeningitt celler i miljøet, kan brukes som en modell for makrofager. Dette ROV organisme, ligner makrofager, sysselsetter fagocytose å drepe internalisert celler. Ved hjelp av et konfokalmikroskopi laser-skanning mikroskop, bilder som viser interaktive øyeblikk mellom kryptokokkmeningitt celler og Amoeba er fanget. Oppløsnings kraften til elektron mikroskopet bidrar også til å avdekke de ultrastructural detaljene i kryptokokkmeningitt celler når de er fanget inne i Amoeba mat vacuole. Siden fagocytose er en kontinuerlig prosess, blir kvantitative data deretter integrert i analysen for å forklare hva som skjer på timepoint når et bilde fanges opp. For å være konkret blir relative fluorescens enheter lest for å kvantifisere effektiviteten av Amoeba i internalizing kryptokokkmeningitt celler. For dette formålet, kryptokokkmeningitt celler er farget med et fargestoff som gjør dem fluorescerer gang fanget inne i Sure miljøet av maten vacuole. Når den brukes sammen, informasjon samlet gjennom slike teknikker kan gi viktig informasjon for å trekke konklusjoner på atferden og skjebnen til cellene når internalisert av Amoeba og, muligens, av andre phagocytic celler.

Mikrober er mikroskopiske organismer som ikke kan oppfattes med det blotte øye. Imidlertid kan deres innvirkning føre til synlig klinisk åpenbare sykdommer, slik som hud infeksjoner. Når du studerer visse aspekter av mikrober, alt fra deres morfologi, biprodukter og interaksjoner, å kunne gi malerisk og video bevis er av største betydning.
Vi først forsøkte å visualisere samspillet mellom kryptokokkmeningitt celler og A...

Watch this Scientific Journal Video about Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions at JoVE.com

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Komplementær bruk av mikroskopiske teknikker og fluorescens Reading i Studying Cryptococcus-Amoeba interaksjoner

Dette papiret detaljer en protokoll for å utarbeide en co-kultur av kryptokokkmeningitt celler og amøber som er studert ved hjelp av stillbilder og høyoppløselig overføring elektronmikroskop bilder. Illustrert her er hvordan kvantitative data kan utfylle slike kvalitative informasjon.

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Det overordnede formålet med denne prosedyren er å bruke mikroskopi som et verktøy for å studere fagocytose av de patogene soppartene Cryptococcus neoformans av sin miljørovdyr amøbe. Denne videoen beskriver en protokoll for å forberede en co-kultur av kryptokokkceller og amøbe som jeg vil studere ved hjelp av konfokal laserskanning mikroskopi og overføring elektron mikroskopi. Informasjon innhentet ved bruk av disse teknikkene kan kaste innsikt i oppførselen til kryptokokkceller når internalisert under infeksjon.Strek ut test sopp stammer på YPD agar plater. Inkuber platen i 48 timer ved 30 grader Celsius. Skrap av en løkkefull celler fra den 48-timers gamle platen og inokuler dem i en 250-milliliter konisk kolbe som inneholder 100 milliliter YNB kjøttkraft som er supplert med 4% glukose.Inkuber kolben ved 30 grader Celsius i 24 timer på en roterende shaker. Etter en 24-timers inkubasjonsperiode teller du soppcellene ved hjelp av et hemocytometer og justerer cellenummeret til en million celler per milliliter med fysiologisk bufferløsning. Dyrke amoeba celler i pepton gjær ekstrakt glukose kjøttkraft for en uke ved 30 grader Celsius.Telle amoeba cellene ved hjelp av et hemocytometer og justere cellenummeret til 10 millioner celler per milliliter med frisk steril ATCC medium 712. Etter dette, utføre en levedyktighet analyse ved hjelp av en trypan blå flekk. Det anbefales å arbeide med celler som viser minst 80% levedyktighet.Dispenser en 200-mikroliter suspensjon av standardiserte amøbeceller i kamre av en tilhengersklie. La to timer passere for celler å holde seg til overflaten ved 30 grader Celsius. Mens amoeba-celler slår seg ned, flekker de standardiserte kryptokokkcellene med fluoresceinisothiocyanat.Rør forsiktig soppcellene i to timer ved romtemperatur og i mørket. Dispenser 200 mikroliter suspensjon av fargede kryptokokkceller etter vask til passende kamre som allerede inneholder amoebaceller. Inkuber den forberedte co-kulturen ved 30 grader Celsius i en ekstra to-timers periode.På slutten av sammenfallende periode, vask kamrene to ganger med PBS for å fjerne eventuelle ubundet amøbeceller, inkludert ikke-internaliserte kryptokokkceller. Aspirer glutaraldehyd som ble brukt til å fikse cellene, og vaske kammeret to ganger med PBS. Demonter kammersklien.Vis de co-kultiverte cellene ved hjelp av et konfokal laserskanningsmikroskop. For å utfylle analysen ovenfor, beis kryptokokkcellene med pHrodo fargestoff som selektivt tillater lesing av celler fanget inne i maten vacuole. Dispenser disse beisede cellene i brønnene til en svart tilhengerplate som allerede inneholder sådde amoebaceller.Mål fluorescens på en mikroplateleser som kan konvertere logaritmiske signaler til relative fluorescensenheter. Legg til fem milliliter standardiserte kryptokokkceller i samme sentrifugerør som allerede inneholder fem milliliter standardiserte amoebaceller. La røret stå i to timer ved 30 grader Celsius.Aspirer den overnaturante etter sentrifugering. Fest pelleten som representerer de co-kultiverte cellene med en molar av natriumfosfat bufret 3% glutaraldehyd ved pH 7 i tre timer. Vask de kokulturerte cellene en gang med natriumfosfatbuffer.Fix igjen i 1 1 / 2 timer i tilsvarende bufret 1% osmium tetroxide etterfulgt av vask. Dehydrere TEM materialet også kjent som co-kultivert celler i en gradert aceton serie på 30%50%70%95%og 100%for 15 minutter hver. Her gjentar du det siste dehydreringstrinnet i to endringer.Forbered epoksyharpiksen ved å veie av epoksy av normal konsistens. Bygg inn materiale i epoksyharpiksen. Polymeriser TEM-materialet i åtte timer ved 70 grader Celsius.Klipp 16 nanometer seksjoner med glasskniver montert på ultratomen. Flekk seksjonene med uranylacetat i 10 minutter i mørket etterfulgt av blysitrat i 10 minutter, også i mørket. Vis seksjonene med et transmisjonselektronmikroskop.For illustrerende formål, i videoen, undersøkes to isolater, en som produserer 3-hydroksyfettsyrer og den andre som ikke gjør det. 3-hydroksyfettsyrer er sekundære metabolitter som ikke spiller rolle i veksten av kryptokokkceller. Her er øyeblikksbilder som viser interaktive øyeblikk mellom Cryptococcus og amoebae.Til poenget kan en kryptokokkcelle før og etter internalisering observeres. Når du studerer fagocytose, er det ideelt å gjøre bruk av levende bildebehandling. Det er imidlertid ikke alltid mulig for forskere å ha tilgang til et slikt mikroskop for å følge prosessen med fagocytose kontinuerlig.En mulig løsning for å kompensere for denne begrensningen kan være å utfylle bilder med kvantitative data gjennom lesing av relative fluorescensenheter. Stolpediagrammet er et eksempel på data som jeg brukte til å utfylle bildene. Viktigere, både de kvalitative dataene i form av bilder og kvantitative data kan tas på forskjellige tidspunkter i løpet av tiden.Ved å sette all informasjon, kan man begynne å konstruere et større bilde av hva som skjer under prosessen med fagocytose. Fra de kvantitative dataene er det klart å se at cellene med 3-hydroksyfettsyrer er mindre utsatt for amøbevirkninger sammenlignet med celler som ikke produserer 3-hydroksyfettsyrer som færre celler er internalisert. TEM er spesielt et kraftig verktøy som det kan gi et fugleperspektiv inn i lumen av maten vacuole på grunn av sin høyoppløselige kraft, og dette er den typen detaljer som ofte går glipp av når du undersøker levende bildebehandling samt stillbilder.I denne spesifikke TEM-mikrografen kan fremspring på overflaten av kryptokokkceller tydelig ses. Tidligere ble det teteoretisert at disse celleoverflatestrukturene er kanaler der 3-hydroksyfettsyrer slippes ut i omgivelsene. Til poenget kan disse kanalene bidra til å levere 3-hydroksyfettsyrer inn i lumen av maten vacuole av amøbe for å endre de indre forholdene, derav fremme av celleoverlevelse.pHrodo eller som FITC kan være en mye bedre flekk å bruke som det bare fluorisere på en lav pH, som inne i maten vacuole. For å være spesifikk, pHrodo bare tillater forskeren å innhente data om internaliserte celler. Mot dette formål er det viktig at celler er suspendert i fosfatbufferløsning før farging og at amoeba media er av en nøytral pH.Overføring elektron mikroskop operatører skal være godt trent til å seksjon riktig som dette er ofte det punktet hvor resultatene kan bli forvrengt og mikrograf skadet av elektron bombardement. Det er tenkt at forskere vil kunne ta nok informasjon fra den presenterte protokollen og optimalisere dem i sine egne studier. Videre kan forskere også utvikle antistoffer mot målrettet metabolitt og bruke dem under deres immunofluorescerende mikroskopistudie, inkludert immunogold merking under TEM-undersøkelse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Vurdere Nedsatt Metabolske endringer under Progressive Colonization of Germ-free Mouse av 1 H NMR spektroskopi

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studerer Samhandling av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrophils ved flowcytometri og Time Lapse Mikroskopi

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Ved å bruke<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Å studere autofagi-Cytoskjelettet Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere samspillet mellom humant fullblod og endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluering av effekt og toksisitet av RNA Targeting HIV-1 Produksjon for bruk i Gene eller Medikamentell behandling

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuelle og mikroskopiske evaluering av Streptomyces utviklingsmessige mutanter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-immunoprecipitation analysen for å studere funksjonell samhandling mellom reseptorer og enzymer

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Analyse av SAMHD1-restriksjon ved flowcytometri i humane myeloide U937-celler

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...