Name: complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions
Uploaded: 2019-06-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions at JoVE.com

Çalışma Güney Afrika Ulusal Araştırma Vakfı (Grant numarası: UID 87903) ve serbest Devlet Üniversitesi 'nden bir hibe tarafından destekleniyordu. Ayrıca mikroskopi çalışmalarımız sırasında Pieter Van Wyk ve Hanlie Grobler tarafından sunulan hizmetler ve yardımlar için minnettarız.

Kripokus neoformans ve bazı Acanthamoeba castellanii suşları Biyogüvenlik seviyesi-2 (BSL-2) patojenler olarak kabul edilir; Böylece, araştırmacılar bu organizmalar ile çalışırken uygun önlemler almalısınız. Örneğin, laboratuar personeli özel eğitim ve kişisel koruyucu ekipman (PPE) gibi laboratuvar ceket, eldiven ve göz koruması olmalıdır. Enfeksiyona neden olabilecek prosedürler için biyolojik güvenlik dolabı (seviye-2) kullanılmalıdır14.
<p ...

<ol>
	<li>Barton, L. L., Northup, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial Ecology. , (2011).</li><li>Hunter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entente+cordiale:+multiple+symbiosis+illustrates+the+intricate+interconnectivity+of+nature.">Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature.</a> EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).</li><li>Comolli, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+inter-species+interactions+in+microbial+communities.">Intra- and inter-species interactions in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).</li><li>Siddiqui, R., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acanthamoeba+is+an+evolutionary+ancestor+of+macrophages:+a+myth+or+reality?.">Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?.</a> Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).</li><li>Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).</li><li>Steenbergen, J. N., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+virulence+for+the+human+pathogenic+fungus+Cryptococcus+neoformans.">The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans.</a> Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).</li><li>Casadevall, A., Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryptococcus Neoformans. , (1998).</li><li>Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+long+term+storage+of+Acanthamoeba+species.">A simple method for long term storage of Acanthamoeba species.</a> Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).</li><li>Sebolai, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Hydroxy+fatty+acids+found+in+capsules+of+Cryptococcus+neoformans.">3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans.</a> Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).</li><li>Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+acetylsalicylic+acid+on+oxylipin+migration+in+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+UOFS+Y-1378.">The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378.</a> Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).</li><li>Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+and+believing:+recent+advances+in+imaging+cell-cell+interactions.">Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions.</a> F1000 Research. , e6435.1 (2015).</li><li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing+-+multiscale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology.">Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).</li><li>Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+video+microscopy+of+fungal+pathogen+phagocytosis.">Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).</li><li>Duane, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+implementing+a+BLS-2++biosafety+program+in+a+research+laboratory.">A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory.</a> Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).</li><li>Madu, U. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcal+3-hydroxy+fatty+acids+protect+cells+against+amoebal+phagocytosis.">Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis.</a> Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).</li><li>Smith, D., Onions, A. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).</li><li>Schuster, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+pathogenic+and+opportunistic+free-living+amebas.">Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).</li><li>Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high+sensitivity+dectection+of+incorporated+bromodeoxyuridine.">An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li><li>Clancy, B., Cauller, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+sections+following+immersion+in+sodium+borohydride.">Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride.</a> Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).</li><li>Simons, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytosis+and+of+phagosomal+environment+in+polymorphonuclear+phagocytes+by+flow+cytometry.">Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+pH+Probes.">Ratiometric Imaging of pH Probes.</a> MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).</li><li>van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascospores+ultrastructure+and+development+in+Ophiostoma+cucullatum.">Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum.</a> Mycologia. 83, 698-707 (1991).</li><li>Spur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+viscosity+epoxy+resin+embedding+medium+for+electron+microscopy.">A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy.</a> Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).</li><li>Department of Minerals and Energy. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Cell Biology. 17, 208-212 (1963).</li><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications.">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li><li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages.">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcusneoformans+phagocytosis+by+macrophages.">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages.</a> Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).</li><li>Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+role+of+3-hydroxy+fatty+acids+in+Cryptococcus-amoeba+interactions.">Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions.</a> Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).</li><li>Hayes, B. K., Heit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).</li><li>Meindl, C., &#214;hlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fr&#246;hlich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+methods+to+determine+nanoparticle+uptake+by+phagocytes+and+non-phagocytic+cells+in+vitro.">Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro.</a> Toxicology. 378, 25-36 (2017).</li></ol>

Gazetede, ayip kripokal hücrelerle etkileşirken ortaya çıkabilecek olası sonucu ortaya çıkarmak için farklı teknikler başarıyla kullanıldı. Ayrıca, biz kripto Occussonucu 3-hidroksi yağ asitleri etkilerini göstermek için ilgilendi-Amoeba etkileşimleri.
Kullanılan ilk tekniği, hala görüntüler işlenmiş Konfokal mikroskobu oldu. Bu tekniğin önemli dezavantajı, sadece bize belirli bir timepoint ile sınırlı bilgi veriyordu. Sonuçları dayalı çizilmiş olab...

Mikroplar, toprak ve suyun açık fiziksel sınırları gibi farklı ekolojik niceler içinde işgal ve gelişmek için zaman içinde evrimleşmiş, diğerleri arasında1. Bu niş, mikroplar genellikle sınırlı kaynaklar için doğrudan rekabet meşgul; önemlisi, onlar genişleyen nüfus2,3karşılamak için gereken onların büyüme veya boşluk, desteklemek için kullanılan besin için. Bazı durumlarda, amip gibi bazı holozotik organizmalar, biyokütle4,5' ten besin çıkarma yolu olarak kripokal hücrelerde bile öncesine olabilir. Buna göre, bu tür organizmaların avının nüfus numaralarını kontrol ederek toprak hakimiyeti kurmayı sağlar. Bu yırtıcı basınç nedeniyle, bazı av mikrobiyal faktörler üretmek için seçilebilir, örneğin kripokel kapsül6, basınç olumsuz etkilerini karşılaştırmak için. Ancak, bu basıncının istenmeyen bir sonucu olarak, bazı mikroplar türler bariyerini geçmek ve yeni niş aramak için izin faktörler elde 7, kolonize etmek içinyedi, besin zengin ve ideal olan insan vücudunun sınırlı alanlar gibi Koşul -ları. İkincisi nasıl bir karasal mikrobe gibi açıklamak olabilir Kripokus (C.) neoformanlar patojenik olmaya dönüşebilir.
Bu amaçla, kripokal hücrelerin amip ile olabilir ve bu onları patojen olmak için nasıl seçebilir ilk temas çalışması önemlidir. Daha spesifik olarak, bu kripokal hücrelerin enfeksiyon sırasında makrofajlar üzerine hareket ettiğinde nasıl davrandığını hakkında ipuçları verebilir. Bu nedenle, bir laboratuar8' de bir asit kültürünü korumak için nispeten ucuz ve kolay olduğu için, bu nedenle, burada makrofajlar için bir model olarak seçildi. Ayrıca nasıl kripokal ikincil metabolitleri incelemek için ilgi oldu. 3-hidroksi yağ asitleri9,10 amipler ve kripokal hücreler arasındaki etkileşimi etkiler.
Ayağın ve avının çıplak gözle arasındaki etkileşimi algılayanın basit bir yolu, bir agar plaka ve spot amip yüzeyinde avını kullanarak bir çim yaratmaktır. Agar plakasında plaklar veya net bölgelerin görselleştirilmesi, avında amoipin beslenmesi gereken alanları tasvir eder. Ancak, bu makro düzeyinde, yalnızca işlemin sonucu belirtilir ve fagositoz sürecinin mekanize edilmesi görülmez. Bu nedenle, hücre-hücre temelinde süreci takdir etmek için,11,12kullanılabilecek birkaç mikroskobik yöntemler vardır. Örneğin, bir inkübasyon odası ile ters bir mikroskop bir fagositik hücre ve hedef13arasındaki olayların zaman aşımı video kayıt için kullanılabilir. Ne yazık ki, bir zaman atlamalı işlevselliği ile mikroskop maliyeti nedeniyle, laboratuvarlar özellikle kaynak yoksul ayarları, böyle bir mikroskop satın almak için her zaman mümkün değildir.
Yukarıdaki sınırlamanın aşılması için, bu çalışmada c. neoformans , c. neoformans uofs Y-1378 ve c. neoformans Lmpe 046 ile Acanthamoeba Castellani ile etkileşimini değerlendiren sıralı bir araştırmacı tasarım sunulur. . İlk olarak, nicel bir yöntemin önündeki niteliksel bir yöntem kullanılır. Hala görüntüleri ters floresan mikroskop, yanı sıra bir iletim elektron mikroskop kullanarak yakalanır Amoeba-Kripoccus etkileşimleri tasvir. Bu, kripokal hücreleri içerize etmek için ayağın verimliliğini tahmin etmek için bir plaka okuyucusu kullanarak floresans ölçülerek izledi. Veri yorumlama aşamasında bu yöntemlerden gelen bulguları mutabakatın zaman, bu eşit bir fagositoz zaman atlamalı video perusing olarak çok kritik bilgi ortaya çıkabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="782">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D27802</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-mL plastic tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">69715</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">7252018</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-mL Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1132017</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">8-Well chamber slide</td>
			<td style="width:176px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1109650</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Acetone</td>
			<td style="width:176px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SAAR1022040LC</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Amoeba strain</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">30234TM</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">ATCC medium 712</td>
			<td style="width:176px;">ATCC&#210;</td>
			<td style="width:123px;">712TM</td>
			<td style="width:172px;">Amoeba medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black 96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">152089</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:176px;">Hermle</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Chloroform</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C2432</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:176px;">Nikon</td>
			<td>Nikon TE 2000</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Epoxy resin:</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[1] NSA</td>
			<td style="width:176px;">[1] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[1] R1054</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[2] DER 736</td>
			<td style="width:176px;">[2] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[2] R1073</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[3] ERL Y221 resin</td>
			<td style="width:176px;">[3] ALS</td>
			<td style="width:123px;">[3] R1047R</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)</td>
			<td style="width:176px;">[4] ALS&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[4] R1067</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F4274</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">489441</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoroskan Ascent FL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">374-91038C</td>
			<td style="width:172px;">Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glucose</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G8270</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1009</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:176px;">Boeco</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1209</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Chromatography Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Methanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">R 34,860</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Osmium tetroxide</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1015</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">pHrodo Green Zymosan A BioParticles</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">P35365</td>
			<td style="width:172px;">This is the pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Physiological buffer solution</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P4417-50TAB</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:176px;">Labcon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:783px;">Sodium phosphate buffer:</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate&#160;</td>
			<td style="width:176px;">[1] Merck</td>
			<td style="width:123px;">[1] 106580</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate</td>
			<td style="width:176px;">[2] Merck&#160;</td>
			<td style="width:123px;">[2] 106345</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:176px;">Philips</td>
			<td>Philips EM 100&#160;</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Trypan blue&#160;</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T8154</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:176px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">EM UC7</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:176px;">ALS</td>
			<td style="width:123px;">R1260A</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vacuum dessicator</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vial</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">29651-U</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YNB</td>
			<td style="width:176px;">Lasec&#160;</td>
			<td style="width:123px;">239210</td>
			<td style="width:172px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">YPD agar</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Y-1500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary use of microscopic techniques and fluorescence reading in studying cryptococcus-amoeba interactions

Kripokus enfeksiyonunu simüle etmek için, ortamdaki kripokal hücrelerin doğal yırtıcı olan Amoeba, makrofajlar için bir model olarak kullanılabilir. Bu yırtıcı organizma, makrofajlar benzer, dışkılmış hücreleri öldürmek için fagositoz istihdam. Konfeti lazer tarama mikroskobu yardımıyla, kripokal hücreler ve anipin arasındaki interaktif anları tasvir eden görüntüler yakalanır. Elektron mikroskobu çözünürlük gücü, aynı zamanda, amip gıda vakum içinde sıkışıp zaman kripokal hücrelerin ultrastran detay açığa yardımcı olur. Fagositoz sürekli bir süreçtir olduğundan, nicel veriler daha sonra bir görüntü yakalanır zaman noktasında ne olduğunu açıklamak için analiz entegre edilir. Spesifik olmak için, kripokal hücrelerde ayipliğin verimliliğini ölçmek için göreceli floresans üniteleri okunur. Bu amaçla, kriptozal hücreler onları bir kez gıda vakidinin asidik çevre içinde sıkışıp floresan kılan bir boya ile lekelenmiş. Birlikte kullanıldığında, bu tür teknikler aracılığıyla toplanan bilgiler, diğer fagositik hücreler tarafından, belki de, amip tarafından ve, muhtemelen, davranış ve hücrelerin kaderi üzerine sonuçlar çekmeye yardımcı olmak için kritik bilgiler sağlayabilir.

Mikroplar, çıplak gözle algılanamaz mikroskobik organizmalar vardır. Ancak, etkileri deri enfeksiyonları gibi gözlemlenebilir klinik olarak belirgin hastalıklar, neden olabilir. Mikropların belirli yönlerini okurken, morfoloji, yan ürünler ve etkileşimler arasında değişen, resim ve video kanıtı sağlamak mümkün olmak çok önemlidir.
İlk olarak kripokal hücreler ve Amoeba arasındaki etkileşimi görselleş...

Watch this Scientific Journal Video about Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions at JoVE.com

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

Bu yazıda hala, floresan görüntüler ve yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskop görüntüleri kullanılarak incelenmiştir kripokal hücreler ve amipler bir ortak kültürü hazırlamak için bir protokol ayrıntıları. Burada gösterildiği gibi nicel veriler bu tür niteliksel bilgileri tamamlayabilir.

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Bu işlemin genel amacı, çevresel yırtıcı amip tarafından patojenik mantar türleri Cryptococcus neoformans fagosittoz çalışması için bir araç olarak mikroskopi kullanmaktır. Bu video, confocal lazer taramalı mikroskopi ve iletim elektron mikroskobu kullanarak inceeceğim kriptokok hücreleri ve amiplerden oluşan bir ortak kültür hazırlamak için bir protokolü ayrıntılarıyla anlatıyor. Bu teknikleri kullanarak elde edilen bilgiler enfeksiyon sırasında içselleştirilmiş kriptokok hücrelerinin davranışı içine anlayışlar döken olabilir.YPD agar plakaları üzerinde test mantar suşları dışarı çizgi. Plakayı 48 saat boyunca 30 derecede kuluçkaya yatırın. 48 saatlik plakadan bir döngü dolusu hücrekazıyın ve %4 glikoz ile desteklenen 100 mililitre YNB suyu içeren 250 mililitrelik konik bir şişeye aşılayın.Şişeyi 30 derecede döner çalkalayıcıyla 24 saat kuluçkaya yatırın. 24 saatlik kuluçka döneminden sonra, hemositometre kullanarak mantar hücrelerini sayın ve fizyolojik tampon çözeltisi ile hücre sayısını mililitre başına bir milyon hücreye ayarlayın. 30 santigrat derece bir hafta boyunca peptone maya özü glikoz suyu amip hücreleri yetiştirmek.Bir hemositometre kullanarak amip hücrelerini sayın ve hücre sayısını mililitre başına 10 milyon hücreye ayarlayın taze steril ATCC orta 712 ile. Bunu takiben, bir trypan mavi leke kullanarak bir canlılık tayini gerçekleştirin. En az %80 canlılık gösteren hücrelerle çalışmak tavsiye edilir.Standart amip hücrelerinin 200 mikrolitrelik süspansiyonu yapışık bir kaydırağın odalarına dağıtın. Hücrelerin yüzeye 30 derecede yapışması için iki saat bekleyin. Amip hücreleri çökerken, standart kriptokok hücrelerini floresan isotiyosiyanat ile lekele.Mantar hücrelerini oda sıcaklığında ve karanlıkta iki saat boyunca hafifçe hareketlendirin. Zaten amip hücreleri içeren uygun odalara yıkadıktan sonra lekeli cryptokokkal hücrelerin 200 mikrolitre süspansiyon dağıtın. Hazırlanan ortak kültürü iki saatlik ek bir süre için 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Coincubation döneminin sonunda, içselleştirilmemiş kriptokok hücreleri de dahil olmak üzere herhangi bir bağlanmamış amip hücrelerini kaldırmak için iki kez PBS ile odaları yıkayın. Hücreleri onarmak için kullanılan glutaraldehit aspire, ve PBS ile iki kez oda yıkayın. Oda kaydırağını sök.Konfokal lazer taramalı mikroskop kullanarak eş kültürlü hücreleri görüntüleyin. Yukarıdaki test tamamlamak için, seçici gıda vakuol içinde sıkışıp hücrelerin okunması için izin pHrodo boya ile cryptococcal hücreleri leke. Zaten tohumlu amip hücreleri içeren siyah bir yapışık mikrotiter plaka kuyuları içine bu lekeli hücreleri dağıtın.Logaritmik sinyalleri göreceli floresan birimlerine dönüştürebilen bir mikroplaka okuyucuda floresanlığı ölçün. Zaten standart laştırılmış amip hücrelerinin beş mililitre içeren aynı santrifüj tüpüne standartlaştırılmış kriptokok hücrelerinin beş mililitre ekleyin. Tüpün 30 derecede iki saat durmasına izin verin.Santrifüjden sonra süpernatant aspire edin. PH 7'de bir azı azı lı sodyum fosfat ile eş kültürlü hücreleri temsil eden peleti üç saat boyunca pH 7'de %3 glutaraldehit tamponlu sabitle. Bir kez sodyum fosfat tampon ile ortak kültürlü hücreleri yıkayın.Benzer şekilde tamponlu 1% osmiyum tetroksit 1 1/2 saat için tekrar düzeltin yıkama izledi. Her biri 15 dakika boyunca %30%50 %70%95 ve %100'lük dereceli aseton serilerinde eş kültürlü hücreler olarak da bilinen TEM materyalini kurutun. Burada, iki değişiklik son dehidratasyon adımı tekrarlayın.Normal kıvamda epoksi tartarak epoksi reçine hazırlayın. Epoksi reçine içine malzeme gömün. TEM malzemesini 8 saat boyunca 70 santigrat derecede polimerize edin.Ultratome üzerine monte cam bıçaklar ile 16 nanometre bölümleri kesin. Karanlıkta 10 dakika boyunca uranyl asetat ile lekeler kurşun sitrat takip 10 dakika, ayrıca karanlıkta. İletim elektron mikroskobu ile bölümleri görüntüleyin.Açıklayıcı amaçlar için, videoda, iki izole incelenir, bir 3-hidroksi yağ asidi üreten ve diğer değildir. 3-hidroksi yağ asitleri kriptokok hücrelerinin büyümesinde rol oynamayan ikincil metabolitleri vardır. Burada Cryptococcus ve amip arasında interaktif anlar gösteren anlık görüntüler vardır.Noktaya, bir cryptococcal hücre önce ve içselleştirme sonra görülebilir. Fagositoz incelenirken canlı görüntülemeden yararlanmak için idealdir. Ancak, araştırmacıların fagositöz sürecini sürekli takip edebilmek için böyle bir mikroskoba erişmesi her zaman mümkün değildir.Bu sınırlamayı telafi etmek için olası bir çözüm, göreli floresan birimlerinin okunması yoluyla görüntüleri nicel verilerle tamamlamak olabilir. Çubuk grafiği, görüntüleri tamamlamak için kullandığım verilere bir örnektir. Daha da önemlisi, hem görüntü biçimindeki nitel veriler hem de nicel veriler zaman içinde farklı zaman noktalarında alınabilir.Tüm bilgileri birleştirerek, fagositoz işlemi sırasında neler inanışı daha büyük bir görüntü oluşturmaya başlayabilirsiniz. Kantitatif verilerden, 3-hidroksi yağ asitleri olan hücrelerin daha az hücre içselleştirildikçe 3-hidroksi yağ asidi üretmeyen hücrelere kıyasla amip hareketine daha az duyarlı olduğu açıktır. TEM özellikle güçlü bir araçtır, çünkü yüksek çözünürlük gücü nden dolayı gıda boşluğunun lümenine kuş bakışı bir görüntü verebilir ve bu da canlı görüntülemenin yanı sıra hareketsiz görüntüleri incelerken sıklıkla gözden kaçırılan bir detaydır.Bu özel TEM mikrografında kriptokok hücrelerinin yüzeyindeki protuberances açıkça görülebilir. Daha önce, bu hücre yüzey yapılarının 3-hidroksi yağ asitlerinin çevreye saldığı kanallar olduğu ortaya atılıyordu. Noktaya kadar, Bu kanallar iç koşulları değiştirmek için amip gıda vacuole lümen içine 3-hidroksi yağ asitleri teslim yardımcı olabilir, dolayısıyla hücre sağkalım promosyon.pHrodo veya FITC gibi sadece düşük pH floresan olarak kullanmak için çok daha iyi bir leke olabilir, gıda vakuol içinde olduğu gibi. Spesifik olması için, pHrodo sadece araştırmacı içselleştirilmiş hücreler ile ilgili veri elde etmek için izin verir. Bu doğrultuda hücrelerin boyanmadan önce fosfat tampon çözeltisinde asılı olması ve amip ortamının nötr pH olması önemlidir.İletim elektron mikroskobu operatörleri, genellikle sonuçların çarpıtılabileceği ve elektron bombardımanı sonucu mikrografın zarar görebileceği bir nokta olduğu için düzgün bir şekilde kesişmek üzere iyi eğitilmelidir. Araştırmacıların sunulan protokolden yeterli bilgiyi alabilecekleri ve kendi çalışmalarında optimize edebilmeleri öngörülmektedir. Ayrıca araştırmacılar, hedeflenen metabolite karşı antikorgeliştirebilir ve TEM muayenesi sırasında immünoaltın etiketleme dahil immünororesans mikroskopi çalışmaları sırasında uygulayabilirler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Germ-free Mouse Aşamalı Kolonizasyon sırasında Karaciğer metabolik değişiklikler Değerlendirilmesi 1 H-NMR Spektroskopi

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Etkileşimi incelenmesi<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

İnsan Miyeloid U937 Hücrelerinde Akış Sitometrisi ile SAMHD1 Kısıtlamasının Analizi

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...