Name: isolation of mouse epidermal keratinocytes and their in vitro clonogenic culture
Uploaded: 2019-08-10T13:00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture at JoVE.com

وليس لدى أصحاب البلاغ أي اعتراف.

<ol>
	<li>Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+primary+in+vitro+clonogenic+keratinocytes+from+normal+adult+murine+epidermis,+following+initiation,+and+during+promotion+of+epidermal+tumors.">Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors.</a> Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).</li><li>Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+for+murine+keratinocyte+stem+cells+based+on+cell+surface+phenotype.">Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells.">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).</li><li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+for+living+murine+keratinocytes+from+the+hair+follicle+bulge+with+the+cell+surface+marker+CD34.">Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34.</a> Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).</li><li>Redvers, R. P., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+cultivation+of+primary+adult+murine+keratinocytes.">Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C-treated+3T3+fibroblasts+used+as+feeder+layers+for+human+keratinocyte+culture+retain+the+capacity+to+generate+eicosanoids.">Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids.</a> Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).</li><li>Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in &#8220;high calcium&#8221; defined medium. , (1994).</li><li>Wu, W. Y., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+harvest+and+assay+of+in+vitro+clonogenic+keratinocytes+stem+cells+from+mice.">Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice.</a> Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).</li><li>Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+keratinocyte+stem+cell+regulatory+loci+implicated+in+skin+carcinogenesis.">Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).</li><li>Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+keratinocyte+colony+number+is+genetically+controlled.">Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled.</a> Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).</li><li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+microarray+transcriptome+profiling+of+CD34-enriched+mouse+keratinocyte+stem+cells.">Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).</li><li>Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+covalent+DNA+adducts+in+mouse+epidermal+subpopulations+after+topical+application+of+benzo(a)pyrene+and+7,12-dimethylbenz(a)anthracene.">Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene.</a> Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).</li><li>Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal,+multipotency,+and+the+existence+of+two+cell+populations+within+an+epithelial+stem+cell+niche.">Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.</a> Cell. 118 (5), 635-648 (2004).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

تم تطوير طريقة حصاد الخلايا الكيراتينية الموصوفة هنا لإنتاج غلة عالية من الخلايا الجلدية الأولية القابلة للزراعة للغاية من الجزء الخلفي من الفئران الإناث البالغات. هذه الخلايا الكيراتينية هي مناسبة لتدفق قياس الخلايا، وتطبيق البيولوجيا الجزيئية، وثقافة الخلية الأولية، بما في ذلك القول الكلوجيني ذكر هنا. هذه الطريقة حصاد الخلايا الكيراتينية كانت مفيدة أيضا لدراسة الجوانب الأخرى المصب من السرطنة الكيميائية الجلدية وتعزيز الورم1،13.
هناك عدة خطوات حاسمة في البروتوكول. أولا، لصرامة واستنساخ، واستخدمت الفئران الإناث من سن 54 ± 2 أيام. وقد مكننا ذلك من إجراء عمليات اختبار مستعمرة حساسة وكمية من سلالات متعددة من الفئران واستخدامها كنمط فينوتاي في تحليل الربط مما يؤدي إلى تحديد جين تنظيمي جديد واحد على الأقل من الخلايا الجذعية10و11 . ثانيا، فمن المفيد لقطع الجلود إلى قطع أصغر، كما التربسينيهو أكثر فعالية من محاولة للحفاظ على الجلد كله. ثالثا، الوقت ودرجة الحرارة من التعويم التربسين مهم جدا للculturability اللاحقة. وعلاوة على ذلك، يحتاج المرء إلى "كزة إلى حد كبير" في الشعر المتبقية على مرشح لطرد الخلايا المرفقة. هذه الخطوة مهمة للحصول على عوائد عالية من الخلايا. وعلاوة على ذلك، فإن درجة حرارة الحاضنة البالغة 32 درجة مئوية مهمة لزراعة الخلايا الكيراتينية على المدى الطويل من الفئران البالغة. وأخيرا، في هذا البروتوكول، تستند التلاوة المتوازية للتجارب في المختبر وفي الجسم الحي1 إلى الثقافات الأولية بدلا من الثقافات الفرعية أو خطوط الخلايا. وتجدر الإشارة إلى أنه إذا كان حصاد الخلايا الكيراتينية الأولية لأول مرة باستخدام هذا البروتوكول، والحفاظ على الأدمة المتبقية بعد كشط لتأكيد الإزالة الكاملة لبصيلات الشعر جنبا إلى جنب مع البشرة عن طريق الملاحظة الأنسجة المرضية.
القوة الرئيسية لهذا البروتوكول لحصاد الخلايا الكيراتينية الماوس الكبار هو أنه ينتج عوائد عالية من الخلايا القابلة للزراعة التي هي مناسبة للعديد من التطبيقات المصب. الحد الرئيسي هو أن بعض النعوت سطح الخلية قد تكون حساسة للتريبسينت بحيث قد تتعرض لتلطيخ المناعة للخطر. لذلك، عند اختبار جسم مضاد سطح خلية جديدة، قد يكون من الحكمة استخدام ديسباس6 أو ثيرموليسين5 طريقة قائمة للحصاد للمقارنة. أهمية هذا البروتوكول هو أنه قد تم اختباره بدقة، وكمي، وتطبيقها على هذهالتطبيقات المتنوعة كما اختبارات للخلايا الجذعية clonogenic 1،9،10،11،للثقافات الجماهيرية في الكيمياء الحيوية8، لفرز FACS في تحليل الخلايا الجذعية3،4، للبيولوجيا الجزيئية3،12، وللحمض النووي الريبي الجارية وتسلسل الحمض النووي الريبي.

تغطي بشرة الثدييات الجسم بأكمله وتخدم العديد من الوظائف (على سبيل المثال، حاجز مادي أساسي، وتنظيم درجة الحرارة، والاحتفاظ بالرطوبة). على مدى العقود الخمسة الماضية، أسفرت البحوث الأساسية على جلد الماوس معلومات جديدة عن بنية ووظيفة الجلد. وقد ساعد نموذج جلد الماوس إلى حد كبير على فهم البيولوجيا الأساسية وراء الآليات الجزيئية المعقدة للتسرطن الكيميائي أو الأشعة فوق البنفسجية الناجمة عن الأشعة. قدمت هذه النماذج الجلد الماوس مساهمة كبيرة نحو فهم الأمراض الجلدية البشرية والتخفيف منها. لاستكشاف المزيد من تشريح الجزيئية من الخلايا الكيراتينية الأولية في البيولوجيا التنموية بصيلات الشعر، والبحوث الخلايا الجذعية، والسرطنة، والاستكشاف الوراثي للالبشرة، فمن المستحسن في كثير من الأحيان لعزل وثقافة الظهارية الأولية الخلايا الكيراتينية من جلد الفئران لاستخدامها بالتوازي مع تجارب في الجسم الحي. وكان العامل الدافع في تطوير هذه الطريقة هو الحاجة إلى إجراء تحليل في المختبر للخلايا الجذعية الجلدية وجريصال الشعر1،2. كما كانت هناك حاجة ملحة لتعليق خلية واحدة من الخلايا الجلدية مناسبة للفحص clonogenic3، الفلورة تنشيط فرز الخلايا ، وتدفق قياس الخلايا3،4. مزايا هذه الطريقة هي حصاد قوي زيادة حجم على طرق أخرى5،6، إدراج الجزء الظهاري من بصيلات الشعر ، والقابلية للزراعة العالية للخلايا التي تم حصادها. وفي الثمانينات، لم تكن هناك أساليب معروفة يمكن أن تفي بهذه المتطلبات. في السنوات اللاحقة، تم صقل هذه الطريقة لزيادة غلة الخلية. والقيد الرئيسي لهذه الطريقة هو إخفاء بعض الأجسام المضادة الحساسة التربسين التي من شأنها أن تضر بالتفاعل المناعي6.
تلقت الفئران تربية وفقا للمبادئ التوجيهية محددة خالية من مسببات الأمراض. تم الحصول على واحد إلى خمسإناث الفئران 54 ± 2 أيام من العمر. في الفئران القديمة ، سيتم تقليل صلاحية الخلايا الكيراتينية بسبب مرحلة أناجين (النمو) لدورة الشعر. أيضا، عملية التربسيني أكثر صعوبة بالمقارنة مع الفئران الشباب. وقد تم تحسين إجراء الحصاد بنجاح للبشرة أرق من الفئران الإناث بالمقارنة مع الذكور. لا تستخدم الفئران الذكور عموما لحصاد الخلايا الكيراتينية كما لديهم ميل للقتال مع بعضها البعض أثناء السكن، وبالتالي قد تترك الخدوش أو الجروح على الجلد.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring</td>
			<td>Bel-Art, Wayne</td>
			<td>371101128</td>
			<td>in 2 oz Nalgene jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable pipettes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile conical tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 (T-150) culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Screw Cap Micro Tube Conical</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 oz Nalgene jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2118-0002</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin solution 10X</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>225 cm2 (T-225) culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2019-1000</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm sterile culturing dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable pipets</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile conicle tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm sterile culturing dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-&#181;m pore size</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>145956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics (penicillin-streptomycin)</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine calf serum (BCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td>
			<td>SH30073.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Ram34 FITC conjugated antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 70-&#181;m sterile</td>
			<td>BD Discovery Labware</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Bovine, Type I, 30mg</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials</td>
			<td>Biocison</td>
			<td>BCS-136PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>made fresh; twice distilled reverse osmosis water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td>
			<td>SH 300070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-320-730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 50 mg/mL 10</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene &#8220;Mr. Frosty&#34; cell freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2116-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 22 sterile stainless-steel blades</td>
			<td>BD Bard-Parker</td>
			<td>371222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 4 scalpel handles</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>26-1200</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One pair of full-curve eye dressing forceps</td>
			<td>Militex</td>
			<td>18-784</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One pair of scissors</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>25-1050</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One pair of thumb dressing forceps</td>
			<td>Militex</td>
			<td>6-4</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade</td>
			<td>Jarden Consumer Solutions/Oster</td>
			<td>78997-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6240-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2akappa PE isotype control antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFM</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>10725-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMEM</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>11380-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>11380-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square sterile plastic Petri dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss mouse 3T3 fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-92</td>
			<td>used within 10 passages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz</td>
			<td>Triad Group</td>
			<td>10-8216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams E Medium</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziploc bag</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse epidermal keratinocytes and their in vitro clonogenic culture

البروتوكول الموصوف هنا هو طريقة موثوق بها لحصاد الخلايا الكيراتينية الأولية من الفئران الإناث البالغين (54 ± 2 أيام من العمر) مما أسفر عن ما يقرب من 30 × 106 خلايا قابلة للحياة لكل فأر. يتم حصاد الخلايا الكيراتينية الماوس الكبار الأولية من الجلد الظهري للفئران الإناث. يمكن استخدام الفئران الذكور (~ 6 أسابيع من العمر) لحصاد الخلايا الكيراتينية اعتمادا على متطلبات التجربة. يتم حلق الفئران القتل الرحيم وتعقيمها مع الشهي التسلسلي في اليود povidone وحلول الإيثانول (70٪ الكحول). بعد تطهير الفئران ، تتم إزالة الجلد الظهري ويتم إزالة الدهون والعضلات تحت الجلد مع مشرط وتجاهلها. يتم قطع الجلود إلى قطع صغيرة ومعالجتها مع الترببسينات خفيفة ومنخفضة درجة الحرارة لفصل الأدمة السفلى من البشرة. يتم تحريك البشرة كشط بسرعة منخفضة، وتصفيتها لإزالة الشعر، عد، وإعادة تعليق هافيت وسط الثقافة. توفر هذه الطريقة تعليق خلية واحدة ممتازة من الخلايا القابلة للزراعة للغاية للعديد من التطبيقات المصب.

عادة، يتم الحصول على غلة الخلايا الكيراتينية البشرة لكل ماوس تتراوح بين 20 × 106 إلى 30 × 106 التريبان الأزرق باستثناء الخلايا8،9. وتتراوح نسبة البقاء بين 80% و90%. تبلغ كفاءة البذر النموذجية حوالي 30% مرفقة في 24 ساعة. ،11. يتم توضيح النتائج النموذجية من الاختبارات تشكيل المستعمرة في الشكل 1. عدد الخلايا الجذعية بصيلات الشعر هو ما يقرب من 9٪ CD34+/CD49f+ الخلايا الجذعية للفئران C57BL/612. وترد النتائج النموذجية من قياس التدفق في الشكل 2.
ويبين الشكل 3خصائص النمو لأربع وسائط مختلفة. وتشمل وسائل الإعلام التي تم اختبارها KGM-الذهب، SFM، وليام E المتوسطة، وموريس-2 (وهو انخفاض وسط الكالسيوم وضعت في مختبر موريس على أساس وليامز E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig1.jpg"> الشكل 1: أمثلة تمثيلية من اختبار لخلايا الكيراتين الكلونية من الفئران البالغة. توضح هذه الصورة تشكيل مستعمرة الكيراتينية من الفئران الإناث CD-1 54 يوما من العمر تعامل موضعيا مع 1) لا علاج، 2) الأسيتون تليها أسبوع واحد في وقت لاحق من قبل الأسيتون مرتين أسبوعيا لمدة أسبوعين، 3) DMBA تليها أسبوع واحد في وقت لاحق من قبل الأسيتون مرتين أسبوعيا لمدة أسبوعين، 4) الأسيتون تليها أسبوع واحد في وقت لاحق من قبل TPA مرتين أسبوعيا لمدة أسبوعين، و 5) DMBA تليها أسبوع واحد في وقت لاحق من قبل TPA مرتين في الأسبوع لمدة أسبوعين. بعد العلاجات في الجسم الحي، تم حصاد الخلايا الكيراتينية وبذرها في 1000 خلية لكل طبق على طبقات التغذية من 3T3 المشعة، ومثقفلمدة أسبوعين، وبعد ذلك تم إصلاح الأطباق مع الرسميين المخزنة وملطخة rhodamine B. يتم نسخ الأطباق في كل عمود من كل مجموعة معالجة الماوس. لاحظ أن عدد المستعمرات الكبيرة زادت عند العلاج مع DMBA، وزاد العدد الإجمالي للمستعمرات TPA العلاج من الفئران قبل حصاد الخلايا الكيراتينية. المختصرات: DMBA: 7,12-dimethylbenz[a]anthracene; TPA: 12-O-tetradecanoylphorbol-13-خلات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig2.jpg"> الشكل 2: مثال تمثيلي لتدفق الخلايا الجذعية بصيلات الشعر من الفئران البالغة. وباختصار، تم عزل الخلايا الكيراتينية الأولية المعزولة عن جلد الفئران الظهرية وتصفيتها للحطام الخلوي باستخدام فلتر الخلايا. تم تسمية تعليق الخلايا الكيراتينية المعزولة مع الأجسام المضادة CD49f أو α6 integrin (PE) و CD34 (FITC) جنبا إلى جنب مع صبغة ميتة حية وغيرها من الضوابط. واستخدمت الأجسام المضادة للتحكم في نوع الأونوع (Rat IgG2akappa) لأغراض التعويض (انظر جدولالمواد). تم اختيار الخلايا الجذعية عن طريق CD49f (قناة PE)، التي اعترفت بالمكون الخارجي للهيمي-desmosomes وجدت على البشرة القاعدية وخلايا بصيلات الشعر، وCD34 (قناة FITC)، التي اعترفت الخلايا الجذعية بصيلات الشعر (أي CD34-FITC+ وa6-PE+ (العمود الأيمن العلوي، المجموع 5٪). يظهر العمود الأيمن مجموعات الخلايا الكيراتينية المختلفة وهي CD34-FITC فقط، CD34-FITC وخلايا a6-PE (مجموعة الخلايا الجذعية الإيجابية المزدوجة)، a6-PE فقط، والخلايا غير الملطخة. لاحظ أن هناك اثنين CD34+ مجموعات الخلايا الجذعية كما تم الإبلاغ عن6،14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig3.jpg"> الشكل 3: مقارنة بين أربع وسائط مختلفة بشأن الثقافات الأولية للخلايا الجلدية من الفئران الإناث البالغات. تم عزل الخلايا الكيراتينية الأولية من جلد الفئران الظهرية وتحسب للبذر باستخدام أربعة وسائل إعلام مختلفة (KGM، SFM، ويلم-E وموريس-2). تم زرع أعداد متساوية من الخلايا الكيراتينية واتبعها لشكلها العام ونمط النمو. لاحظ أن الخلايا الكيراتينية المنتشرة لها مورفولوجيات مختلفة قليلاً. KGM، SFM، وموريس-2 كلها هي انخفاض وسائل الإعلام الكالسيوم لديها النمو أقوى بعد أربعة عشر يوما. في المقابل، لا تستمر الخلايا عندما يتم التزراع في ويليامز E المتوسطة التي لديها 1.4 مليون كالسيوم ونسبة عالية من البوتاسيوم إلى الصوديوم. من المستغرب, وليامز E المتوسطة مع المكملات الغذائية وعشرين في المئة المصل البقري الجنيني يدعم الثقافات clonal الكيراتينية أفضل بكثير من أي وسيلة أخرى اختبارها, ربما لأن المتوسط وليامز E المخصب يساعد الخلايا المغذية 3T3 على "تغذية" أفضل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الحلول والإعلام</td>
			<td>تعليقات</td>
		</tr>
<tr>
<td>حلول الحصاد</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2.5٪ تريبسين (5 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>[دولبكو] [ببس] (500 [مل])</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>جنتاميسين (2 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS مع 2X جنتاميسين (45 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ملحي مُسَّاب بالفوسفات (PBS) مع جنتاميسين 2x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>محلول التربسين</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>حلول زراعة الخلايا</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>بيوركول فيبرونيكتين طبق طلاء الحل:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 م هيبس (1 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>116 مليون متر CaCl2 (1 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الزلال المصل البقري 1.0 ملغ/ مل (10 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>خلية ثقافة متوسّطة (100 [مل])</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>فيبرونيكتين (1 ملغ)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>بيوركول كولاجين (1 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>حل تجميد الخلايا</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMSO (2 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM مع 10٪ BCS والقلم العقدية</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>حصاد متوسط</td>
			<td>يجب أن يكون بدون كالسيوم</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x جنتاميسين (1 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS (50 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الملايين والمتوسطة الحجم (500 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>عالية الكالسيوم وليامز 'E وسائل الإعلام مع:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF (5 ميكروغرام/مل) 1 مل</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الجلوتامين 14.5 مل</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>هيدروكورتيزون (1 ملغ / مل) 0.5 مل</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الأنسولين 1 مل</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>لينوسيد-BSA (0.1 ملغ / مل) 0.5 مل</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MEM Ess AminoAcids 4 مل</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MEM فيتامينات 5 مل</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>البنسلين-ستربيتميوسين 5 مل</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ترانسفيرين (5 ملغ/ مل) 1 مل</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vit A (1 مغ/1000 ميكرولتر) 57.5 ميكرولتر</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vit E 1 ملغ / مل (4 درجة مئوية) 3.5 درجة مئوية</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vit D2 (10 ملغ / مل) 50 درجة مئوية</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3T3 الليفية النمو الكامل المتوسطة (CGM)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>BCS (100 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM (900 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>البنسلين-ستربيميتاسين (10 مل)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>KGM</td>
			<td>المتوسط المستخدم للزراعة الجماهيرية هو انخفاض وسط الكالسيوم</td>
		</tr>
<tr>
<td>موريس 2 المتوسطة مع نفس المكملات الغذائية كما وليامز 'E</td>
			<td>انخفاض الكالسيوم البديل من وليامز E مع المكملات الغذائية</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: الحلول وصفات الوسائط.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture at JoVE.com

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

الهدف من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا القرنية البشرة من الجلد الظهري للفئران البالغة لمجموعة متنوعة من التطبيقات النهائية مثل البيولوجيا الجزيئية، والكيمياء الحيوية، وفرز الخلايا المنشطة الفلورية، والاستخدامات الأولية في المختبر (على سبيل المثال، clonogenic الخلايا الكيراتينية).

عزل الخلايا الكيراتينية البشرة الماوس وثقافتهم في المختبر Clonogenic

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

إن طريقتنا في حصاد خلايا البشرة من الفئران البالغة مفيدة لتطبيقات المصب مثل الخلايا الجذعية الكيراتينوسيت. لدينا تقنية قابلة للاستنساخ للغاية ويمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع إجراءات في الجسم الحي في الفئران في سياق الجلد نموذج مسرطنة. بعد حصاد عينات الجلد الظهرية من الفئران الكبار القتل الرحيم، واستخدام ملقط autoclaved ومشرط لوضع واحد الجلد الظهري في الجانب شعر مرة أسفل في طبق بيتري رقيقة وخردة قبالة الأنسجة تحت الجلد بما في ذلك الدهون من أنسجة الجلد البطني حتى الأنسجة شبه شفافة.ضع الجلد المكشط في برنامج تلفزيوني حتى تتم معالجة جميع الجلود المتبقية الأخرى. ثم استخدم مشرط لشريحة عينات الجلد إلى 0.5 من قبل واحد إلى 1.5 شرائط سنتيمتر. وضع شرائح الجانب شعر حتى في طبق بيتري العقيمة قبل تعويم العينات الجانب شعر حتى على سطح برنامج تلفزيوني 20 ملليلتر بالإضافة إلى اثنين من الحل gentamicin x, تكمل مع 0.25٪ التربسين في البلاستيك 100 في 20 ملليمتر طبق بيتري لمدة ساعتين في 32 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، ضع طبق بيتري معقمة، بلاستيكية، مربعة تحتوي على 15 ملليلتر من متوسط الحصاد في منحدر 30 درجة واستخدام ملقط منحنية لنقل بعناية شريط الجلد العائمة في الطبق. عقد شفرة مشرط جديدة في زاوية عمودي على الجلد واستخدام قوة كافية ولكن ليست مفرطة، والخردة قبالة البشرة والشعر من العينة إلى المتوسطة. عندما تم كشط جميع الشرائط، بعناية decant الخلية البشرة التي تحتوي على عظمى في جرة 60 ملليلتر العقيمة التي تحتوي على شريط 1.5 بوصة يحرك المغناطيسي وشطف طبق بيتري مع متوسطة الحصاد إضافية لجمع أي خلايا البشرة المتبقية.جلب حجم النهائي في جرة إلى 30 ملليلتر مع المتوسطة الطازجة، ويحرك حل خلية البشرة في 100 دوران في الدقيقة الواحدة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة اثارة في مجلس الوزراء السلامة الحيوية إزالة شريط اثارة وتصفية حل الخلية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. استخدام ملقط ومن ثم ماصة للضغط على الشعر والمواد القرنية الطبقة من خلال مصفاة للتلاعب الأنسجة لإطلاق سراح خلايا الشعر المحاصرين واستخدام خمسة ملليلتر إضافية من حصاد المتوسطة لإطلاق خلايا الشعر المتبقية المحاصرين في الأنبوب.من المهم أن يتم التلاعب بالخلايا البشرة والشعر وذلك لتحرير الخلايا من بصيلات الشعر. جلب الحجم الإجمالي في أنبوب يصل إلى 50 ملليلتر مع المتوسطة الطازجة وجمع الترشيح الخلية عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في 5 ملليلتر من حصاد المتوسطة الطازجة في حوالي 20 triturations مع ماصة 5 ملليلتر.تأخذ 0.5 ملليلتر من واحد إلى 20 تخفيف ونقلها إلى أنبوب ميكروفروج 2 ملليلتر. بعد خلط العينة بعناية، واتخاذ 200 ميكرولترات من أنبوب microfuge ومزيج بلطف مع حجم متساو من 0.4٪ trypan حل الأزرق. خلط بلطف هذا الحل ثلاث مرات ونقل الخلايا إلى هاموسيتاتوميمتر لعد الخلايا الكيراتينية النووية.تسجيل جميع الخلايا الزرقاء الداكنة كخلايا غير قابلة للحياة وتسجيل الذهب الصغيرة والخلايا الوردية كخلايا قابلة للحياة. متوسطات قابلية البقاء حوالي 80٪ وينبغي أن يكون العائد النهائي للكيراتينوسيت لكل فأر حوالي 30 مليون خلية قابلة للحياة. بعد العد، وجمع الخلايا مع طرد مركز آخر، ولثقافة الشامل resuspend 2-4 مرات 10 إلى سادس قابل للحياة keratinocytes لكل 35 ملليمتر طبق بيتري في 2 ملليلتر من خلية ثقافة المتوسطة.لفرز القولون clonogenic، resuspend الخلايا في مرة واحدة 10 إلى keratinocytes الثالثة لكل أربعة ملليلتر من تعديل وليام E المتوسطة مع ملاحق في تركيز المصل لكل الكولاجين المغلفة 60 ملليمتر طبق بيتري على الأشعة السينية شعاع الماوس السويسري 3T3 طبقات التغذية. للثقافة الجماهيرية، تنمو الثقافات في 32 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لفترة مناسبة ثقافة الخلية. تغيير المتوسط 24 ساعة بعد البذر الأولي للثقافة الجماهيرية وثلاث مرات في الأسبوع بعد ذلك.في نهاية الثقافة التخفي التعرق المتوسطة وإصلاح المستعمرات في 10٪ buffered formalin خلال الليل في درجة حرارة الغرفة. في صباح اليوم التالي، وصمة عار المستعمرات مع 0.5٪ rhodamine B في الماء autoclaved لمدة ساعة واحدة، قبل شطف الأطباق في الماء البارد autoclaved حتى المياه يعمل واضحة. ثم تميل الأطباق على أغطية لتجف قبل عد المستعمرات.هنا, تظهر نتائج نموذجية من تشكيل القولون keratinocyte بعد العلاجات الموضعية المختلفة. الخلايا الجذعية بصيلات الشعر عادة ما تشكل ما يقرب من 9٪ من الخلايا المعزولة من الجلد دورسال C57BL/6 ماوس بالغ كما تم تقييمها بواسطة تلطيخ تدفق الخلايا الخلوية لعلامات الخلايا الجذعية بصيلات الشعر الماوس. في هذا الرقم يمكن ملاحظة خصائص النمو من مستعمرات الخلايا الجذعية keratinocyte بعد الثقافة في ظل أربعة ظروف متوسطة مختلفة.بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام الخلايا لعملية استئصال الخلايا المتدفقة، وفرز الخلايا المنشطة بالفلور، واستزراع الخلايا، والتحليلات البيولوجية الجزيئية. وقد مكنتنا هذه التقنية من تحديد أن عدد الخلايا الجذعية البشرة هو سمة كمية ومعقدة تؤدي إلى تحديد جين تنظيمي جديد للخلايا الجذعية.

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

الماوس البشرة الجذعية العصبية خلية كريست (EPI - NCSC) الثقافات

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

العزلة وثقافة الكبار ماوس العضلية للاشارة الخليوي و<em&gt; في المختبر</em&gt; تضخم القلب

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...