Name: isolation of mouse epidermal keratinocytes and their in vitro clonogenic culture
Uploaded: 2019-08-10T13:00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture at JoVE.com

למחברים אין ותודות.

<ol>
	<li>Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+primary+in+vitro+clonogenic+keratinocytes+from+normal+adult+murine+epidermis,+following+initiation,+and+during+promotion+of+epidermal+tumors.">Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors.</a> Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).</li><li>Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+for+murine+keratinocyte+stem+cells+based+on+cell+surface+phenotype.">Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells.">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).</li><li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+for+living+murine+keratinocytes+from+the+hair+follicle+bulge+with+the+cell+surface+marker+CD34.">Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34.</a> Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).</li><li>Redvers, R. P., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+cultivation+of+primary+adult+murine+keratinocytes.">Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C-treated+3T3+fibroblasts+used+as+feeder+layers+for+human+keratinocyte+culture+retain+the+capacity+to+generate+eicosanoids.">Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids.</a> Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).</li><li>Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in &#8220;high calcium&#8221; defined medium. , (1994).</li><li>Wu, W. Y., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+harvest+and+assay+of+in+vitro+clonogenic+keratinocytes+stem+cells+from+mice.">Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice.</a> Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).</li><li>Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+keratinocyte+stem+cell+regulatory+loci+implicated+in+skin+carcinogenesis.">Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).</li><li>Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+keratinocyte+colony+number+is+genetically+controlled.">Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled.</a> Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).</li><li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+microarray+transcriptome+profiling+of+CD34-enriched+mouse+keratinocyte+stem+cells.">Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).</li><li>Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+covalent+DNA+adducts+in+mouse+epidermal+subpopulations+after+topical+application+of+benzo(a)pyrene+and+7,12-dimethylbenz(a)anthracene.">Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene.</a> Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).</li><li>Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal,+multipotency,+and+the+existence+of+two+cell+populations+within+an+epithelial+stem+cell+niche.">Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.</a> Cell. 118 (5), 635-648 (2004).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

שיטת הקציר keratinocyte תיאר כאן פותחה כדי לייצר תשואה גבוהה של keratinocyte ראשונית באפידרמיס העיקרי מאחורי של עכברים נקבה בוגרים. אלה keratinocytes מתאימים לזרימה cy, ליישום הביולוגיה המולקולרית, ואת התרבות התא הראשוני, כולל את הבקשה הclonogenic דיווחו כאן. זו שיטת הקציר keratinocyte גם היה שימושי ללמוד היבטים במורד הזרם השני של מסרטנים כימיים קרצינובגנזה וקידום הגידול1,13.
קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, עבור הקשיחות והתוכסות, עכברים נקבה של גיל 54 ± 2 ימים שימשו. זה איפשר לנו לבצע מושבה רגישה וכמותית בחני מזנים מרובים של עכברים ולהשתמש בהם כפנוטיפ בניתוח הצמדה המוביל לזיהוי של לפחות תא גזע חדש אחד הרגולציה10,11. שנית, מועיל לחתוך את העורות לחתיכות קטנות יותר, מכיוון שהטריסיזציה יעילה יותר מלנסות לשמור על העור כולו. שלישית, הזמן וטמפרטורת הטריפסין. מאוד חשובים ליכולתם הבאה יתר על כן, האדם צריך "לתקוע באופן משמעותי" על השערות שנותרו על הפילטר לעקור את התאים המחוברים. שלב זה חשוב לקבל תשואות גבוהות של תאים. יתרה מזאת, הטמפרטורה 32 ° c של החממה חשובה לטיפוח ארוך טווח של keratinocytes מעכברים למבוגרים. בסופו של דבר, בפרוטוקול זה, הקריאות המקבילות של מבחנה ובניסויים vivo1 מבוססים על תרבויות ראשיות ולא על קווי משנה או של תאי תאים. בעיקר, אם קצירת keratinocytes הראשי בפעם הראשונה באמצעות פרוטוקול זה, לשמור על דרמיס הנותרים לאחר גירוד כדי לאשר את ההסרה המלאה של זקיקי השיער יחד עם האפידרמיס על ידי התבוננות histopathological.
החוזק העיקרי של פרוטוקול זה לקצירת keratinocytes עכבר למבוגרים היא כי הוא מייצר תשואות גבוהות של תאים מיועדים להיות מתאימים עבור יישומים רבים במורד הזרם. המגבלה העיקרית היא שחלק מהתאפיסקופים הסלולריים עשויים להיות רגישים לטריסיזציה, כך שניתן יהיה להתפשר על הנוגדנים. לכן, כאשר בדיקת נוגדן משטח התא חדש, זה עשוי להיות נבון להשתמש dispase6 או thermolysin5 שיטה מבוססת לקציר להשוואה. המשמעות של פרוטוקול זה היא כי הוא נבדק בקפדנות, בכמת, והוחל על יישומים מגוונים כאלה כמו בחני עבור תאי גזע clonogenic1,9,10,11, עבור תרבויות המוני בביוכימיה8, עבור מיון facs בניתוח תאי גזע3,4, עבור ביולוגיה מולקולרית3,12, ועל רצפי רנ א מתמשך ו-DNA רצף.

העור מכסה את הגוף כולו ומשמש מגוון פונקציות (למשל, מכשול פיסי ראשוני, רגולציה ושימור לחות). במהלך חמשת העשורים האחרונים, מחקר בסיסי על עור העכבר הניב מידע חדש על המבנה והתפקוד של העור. מודל העור של העכבר עזר מאוד להבין את הביולוגיה הבסיסית מאחורי מנגנונים מולקולריים מורכבים של מסרטנים כימיים או אולטרה סגולה מושרה בקרינה. אלה מודלים העור העכבר סיפק תרומה משמעותית להבנת מחלות עור האדם ואת ההקלה שלהם. כדי לחקור ניתוח מולקולרי נוסף של keratinocytes העיקרי בביולוגיה התפתחותית זקיק השיער, תאי גזע מחקר, קרצינובגנזה, וחקר גנטי של האפידרמיס, הוא רצוי לעתים קרובות לבודד ותרבות האפיתל העיקרי keratinocytes מן העור עכברים להשתמש במקביל עם ניסויים vivo. הגורם מוטיבציה בפיתוח שיטה זו היה הצורך באופן מתורבת בתוך שיטת מבחנה בלתי עוריות ושיער זקיק תאי גזע1,2. היה גם צורך דחוף השעיות תא בודד של תאים עוריות מתאים לclonogenic בחני3, מיון תא מופעל פלואורסצנטית, וזרימה cy, try3,4. היתרונות של שיטה זו הם קציר חזק להגדיל את סדר הגודל על פני שיטות אחרות5,6, הכללת החלק האפיתל של זקיקי השיער, ואת היכולת הגבוהה של התאים שנקטפו. בשנות השמונים לא היו שיטות ידועות שיכולות לעמוד בדרישות הללו. בשנים הבאות, שיטה זו היה מעודן כדי להגדיל את תפוקת התאים. המגבלה העיקרית של שיטה זו תהיה מסווה של מספר טריפסין של נוגדנים רגישים שהיו מתפשרים על פעילות חיסונית6.
העכברים קיבלו טיפול בהתאם הנחיות ספציפיות הפתוגן חינם. אחד עד חמש עכברים נקבה 54 ± 2 ימים של גיל הושגו. בעכברים מבוגרים, הכדאיות של keratinocytes יופחת עקב שלב anagen (צמיחה) של מחזור השיער. כמו כן, תהליך הטריסינוניזציה קשה יותר בהשוואה לעכברים צעירים. הליך הקציר הותאם בהצלחה לעור הדליל של העכברים הנקביים בהשוואה לזכר. עכברים זכרים בדרך כלל לא משמשים ליבול keratinocyte כפי שיש להם נטייה להילחם אחד עם השני במהלך הדיור ולכן יכול להשאיר שריטות או פצעים על העור.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring</td>
			<td>Bel-Art, Wayne</td>
			<td>371101128</td>
			<td>in 2 oz Nalgene jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable pipettes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile conical tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 (T-150) culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Screw Cap Micro Tube Conical</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 oz Nalgene jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2118-0002</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin solution 10X</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>225 cm2 (T-225) culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2019-1000</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm sterile culturing dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable pipets</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile conicle tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm sterile culturing dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-&#181;m pore size</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>145956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics (penicillin-streptomycin)</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine calf serum (BCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td>
			<td>SH30073.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Ram34 FITC conjugated antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 70-&#181;m sterile</td>
			<td>BD Discovery Labware</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Bovine, Type I, 30mg</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials</td>
			<td>Biocison</td>
			<td>BCS-136PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>made fresh; twice distilled reverse osmosis water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td>
			<td>SH 300070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-320-730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 50 mg/mL 10</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene &#8220;Mr. Frosty&#34; cell freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2116-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 22 sterile stainless-steel blades</td>
			<td>BD Bard-Parker</td>
			<td>371222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 4 scalpel handles</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>26-1200</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One pair of full-curve eye dressing forceps</td>
			<td>Militex</td>
			<td>18-784</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One pair of scissors</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>25-1050</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One pair of thumb dressing forceps</td>
			<td>Militex</td>
			<td>6-4</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade</td>
			<td>Jarden Consumer Solutions/Oster</td>
			<td>78997-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6240-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2akappa PE isotype control antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFM</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>10725-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMEM</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>11380-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>11380-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square sterile plastic Petri dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss mouse 3T3 fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-92</td>
			<td>used within 10 passages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz</td>
			<td>Triad Group</td>
			<td>10-8216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams E Medium</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziploc bag</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse epidermal keratinocytes and their in vitro clonogenic culture

הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיטה אמינה של קצירת keratinocytes העיקרי מעכברים נקבה בוגרים (54 ± 2 ימים) מניב כ 30 x 106 תאים קיימא לכל עכבר. העכבר הראשי מבוגרים keratinocytes נקצרו מן העור החלק של עכברים נקבה. עכברים זכרים (~ 6 שבועות בן) ניתן להשתמש עבור קצירת keratinocyte בהתאם לדרישות של הניסוי. עכברים מורדמים הם מגולח ומעוקר עם שוטף סדרתי povidone יוד והאתנול פתרונות (70% אלכוהול). לאחר חיטוי העכברים, את העור העורמת מוסר את השומן התת עורי השריר מוסרים עם אזמל ומושלך. העורות חתוכים לחתיכות קטנות ומטופלים עם טריסיזציה קלה ונמוכה כדי לנתק את הדרסטיות הנמוכות מהאפידרמיס. Epidermises מגורד מעורבב במהירות נמוכה, מסוננים כדי להסיר את השערות, נספר, ו מחדש מושעה במדיום התרבות. שיטה זו מספקת תא השעיה מעולה יחיד של תאים מאוד מסוגלים לעבור יישומים רבים במורד הזרם.

בדרך כלל, תשואות של keratinocytes באפידרמיס לעכבר החל מ 20 x 106 כדי 30 x 106 טרילון כחול למעט תאים מתקבלים8,9. הכדאיות נעה בין 80%-90%. הקרינה האופיינית לזריעה הם סביב 30% מצורף 24 שעות ביממה. היווצרות המושבה על שכבות ממזין 3T3 הוקרן הוא סביב 60 מושבות לכל 1,000 תאים קיימא שנזרע עבור C57BL/6 עכברים, ו כ 30 מושבות לתאים 1,000 עבור עכברים מסוג שוויצרי10 ,11. התוצאות האופייניות ממערך המושבה מומחשות באיור 1. מספר תאי גזע שיער זקיק הוא כ 9% CD34+/cd49f+ תאי גזע עבור C57BL/6 עכברים12. תוצאות טיפוסיות מתוך הזרימה cy, מקבלים באיור 2.
מאפייני צמיחה של ארבעה מדיה שונים מומחשים באיור 3. התקשורת נבדקה כולל KGM-gold, SFM, המדיום E של ויליאם, ו-מוריס -2 (בינוני סידן מופחת שפותחה במעבדה מוריס מבוסס על ויליאמס E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig1.jpg"> איור 1: דוגמאות מייצגות מתוך שיטת הפעולה של מספר העכברים הבגירים. צילום זה מדגים את היווצרות המושבה keratinocyte מ-CD-1 עכברים נקבה 54 ימים של גיל שטופלו למריחה עם 1) אין טיפול, 2) אצטון ואחריו שבוע לאחר מכן על ידי אצטון פעמיים בשבוע במשך שבועיים, 3. DMBA שלאחר מכן שבוע לאחר מכן על ידי אצטון פעמיים בשבוע במשך שבועיים, 4) אצטון בעקבות שבוע לאחר מכן על ידי הסברתי פעמיים שבועי במשך שבועיים, ו-5) DMBA בעקבות שבוע לאחר מכן על ידי הסברתי פעמיים שבועי לשבועיים. לאחר שלהם טיפולים vivo, שנקטפו keratinocytes והזרע ב 1,000 תאים לכל מנה על שכבות מאכל של 3t3 הוקרן, ומתורבת במשך שבועיים, לאחר מכן הכלים היו קבועים עם פורמלין ומוכתם עם rhodamine B. הכלים בכל עמודה משכפל כל אחת מקבוצות הטיפול בעכבר. שים לב כי מספר מושבות גדולות גדל על הטיפול עם DMBA, ואת המספר הכולל של מושבות גדל הסברתי טיפול של העכברים לפני הקציר keratinocyte. קיצורים: DMBA: 7, 12-דימתילבנץ [a] פחם; הסברתי: 12-ו-טטרדאנולילפורובול-13-אצטט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig2.jpg"> איור 2: הדוגמה הנציגה של cy, להזרים הזרע של תאי גזע שיער מעכברים למבוגרים. בקצרה, keratinocytes הראשי מבודדים היו מבודדים מעור העכברים האלה מסוננים לפסולת תאית באמצעות מסנן התא. ההשעיה keratinocyte מבודדים היה מתויג עם CD49f או α6-אינטגרציה (PE) ו CD34 (FITC) נוגדנים יחד עם צבע חי מת ובקרות אחרות. השימוש בנוגדנים מסוג FITC ו-PE (Rat IgG2akappa) שימשו למטרת פיצוי (ראה טבלת חומרים). תאי גזע נבחרו באמצעות CD49f (PE ערוץ), אשר זיהה את הרכיב החיצוני של המי-desmosomes שנמצאו על בסיס באפידרמיס ובתאי זקיק השיער, ו CD34 (הערוץ FITC), אשר זיהה את תאי גזע השיער זקיק (כלומר, CD34-FITC+ ו-a6-PE+ (עמודה ימנית עליונה, סה כ 5%)). העמודה בצד ימין מראה את אוכלוסיות keratinocyte שונים כלומר CD34-FITC בלבד, CD34-FITC ו a6-PE תאים (כפול חיובי תא גזע האוכלוסיה), a6-PE בלבד, ותאים בלתי מוכתם. שים לב שיש שני CD34+ אוכלוסיות של תאי גזע כפי שדווחו6,14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig3.jpg"> איור 3: השוואה בין ארבעה מדיה שונים על התרבויות העיקריות של תאים באפידרמיס מפני עכברים נקבה מבוגרת. הkeratinocytes העיקרי היו מבודדים מהעור עכברים מעורבי ונספרו לזריעה באמצעות ארבעה מדיה שונים (KGM, SFM, וילם-E ומוריס -2). מספר שווה של keratinocytes הופרה ואחריו המבנה הכללי שלהם דפוס הצמיחה. שים לב keratinocytes מתרבים יש מעט שונה מורפולוגיות. KGM, SFM, ו-מוריס -2 כולם מופחת מדיה סידן יש את הצמיחה החזקה ביותר לאחר 14 ימים. לעומת זאת, התאים אינם ממשיכות כאשר מתורבתים במדיום E ויליאמס כי יש 1.4 מ"מ סידן ויחס גבוה של אשלגן כדי נתרן. באופן מפתיע, ויליאמס E בינוני עם תוספי ועשרים אחוז העובר סרום העוברי תומך בתרבויות שבטים keratinocyte הרבה יותר טוב מכל בינוני אחר נבדק, כנראה בגלל מועשר ויליאמס E בינונית מסייע התאים 3T3 המזין "להאכיל" טוב יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פתרונות ומדיה</td>
			<td>ערות</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרונות קצירת מזון</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2.5% טריפסין (5 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>הערוץ הPBS של דולבוקו (500 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>גנאמיצין (2 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS עם 2x הגברות (45 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>תמיסת מלח באגירה מפוספז (PBS) עם 2x בעלי בנייה</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>טריפסין תמיסה</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרונות לתרבות התאים</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל הציפוי-מענה:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M הפסי (1 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>116 מ"מ CaCl2 (1 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>סרום של שור 1.0 mg/mL (10 מ"ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>בינונית תרבותית של תאים (100 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פיברוטין (1 מ ג)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>קולגן לנפיחות (1 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון הקפאת תא</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(2 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dמאמ עם 10% BCS ו-עט-דלקת</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>קציר בינוני</td>
			<td>צריך להיות ללא סידן</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x שאמיאמצין (1 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS (50 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>סמימ (500 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>התקשורת האלקטרונית של ויליאמס High-סידן עם:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF (5 μg/mL) 1 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>גלוטמין 14.5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>הידרוקורטיזון (1 מ"ג/mL) 0.5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>אינסולין 1 מ ל</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>לינאואסיד-BSA (0.1 mg/mL) 0.5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>חומצות אמינו 4 מ ל</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ויטמינים של הגברת 5 מ ל</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין-סטרפטומיצין 5 מ ל</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>העברת (5mg/mL) 1 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ויט A (1 מ"ג/1000 μL) 57.5 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vit E 1 mg/mL (4 ° צ') 3.5 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vit D2 (10 מ"ג/mL) 50 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3T3 פיברובלסט בינונית צמיחה מלאה (CGM)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>סינכרון BCS (100 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM (900 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין-סטרפטומיצין (10 מ"ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>KGM</td>
			<td>בינונית המשמשת לתרבות המונית היא בינונית-סידן מופחתת</td>
		</tr>
<tr>
<td>מוריס 2 בינוני עם תוספי אותו כמו ויליאמס ' E</td>
			<td>גרסה מופחתת של סידן של ויליאמס E עם תוספי</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מתכוני פתרונות ומדיה.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture at JoVE.com

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד keratinocytes עוריות מן העור העורבי של עכברים מבוגרים עבור מגוון של יישומים במורד הזרם כגון ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה, מיון תא מופעל פלואורסצנטית, ו העיקרי בשימוש בלתי מתורבת (למשל, clonogenic keratinocytes).

בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

השיטה שלנו לקצירת תאי אפידרמיס מעכברים בוגרים שימושית עבור יישומים במורד הזרם כגון תאי גזע keratinocyte. הטכניקה שלנו ניתנת לשחזור מאוד ו ניתן להשתמש בה בשילוב עם הליכים in vivo בעכברים בהקשר של מודל מסרטנים העור. לאחר קצירת דגימות עור הגב מעכברים בוגרים שעברו המתת דם, השתמש במלקחיים אוטוקלאבים ואזמל כדי למקם עור דורסי אחד בכל פעם בצד שעיר למטה לתוך צלחת פטרי דקה ולגרד את הרקמה התת עורית כולל השומן מרקמת העור הגחוני עד הרקמה היא שקופה למחצה.מניחים את העור שרוט PBS עד כל העורות הנותרים האחרים מעובדים. לאחר מכן השתמש אזמל לחתוך את דגימות העור לתוך 0.5 על ידי אחד עד 1.5 ס"מ רצועות. מניחים את הצד השעיר של הרצועות בצלחת פטרי סטרילית לפני שהם צפים את הצד השעיר של הדגימות על פני השטח של PBS 20 מיליליטר בתוספת שני תמיסת ג'נטמיצין x, בתוספת 0.25% טריפסין בצלחת פטרי פלסטיק 100 על 20 מילימטר במשך שעתיים ב 32 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, מניחים צלחת פטרי סטרילית, מפלסטיק, מרובעת המכילה 15 מיליליטר של מדיום קציר ב שיפוע של 30 מעלות ולהשתמש במקלות מעוגלים כדי להעביר בזהירות רצועת עור צפה לתוך המנה. החזקת להב אזמל חדש בזווית ניצבת לעור ושימוש בכוח מספיק אך לא מוגזם, לגרד את האפידרמיס ואת השערות מן המדגם לתוך המדיום. כאשר כל הרצועות כבר גירד, בזהירות decant התא האפידרמלי המכיל supernatant לתוך צנצנת סטרילית 60 מיליליטר המכיל 1.5 אינץ ' מגנטי מערבב בר ולשטוף את צלחת פטרי עם מדיום קציר נוסף כדי לאסוף את כל התאים האפידרמיס שנותרו.מביאים את הנפח הסופי בצנצנת ל-30 מיליליטר עם מדיום טרי, ומערבבים את תמיסת התא האפידרמיס ב-100 סיבובים בדקה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה המרגשת בארון biosafety להסיר את בר מערבב ולסנן את פתרון התא דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. השתמש ממטרות ולאחר מכן פיפטה ללחוץ על השערות ואת חומרי הקרנית שכבה דרך מסננת כדי לתפעל את הרקמה כדי לשחרר את תאי השיער לכודים ולהשתמש חמישה מיליליטר נוספים של מדיום קציר לשחרר את תאי השיער לכודים שנותרו לתוך הצינור.זה קריטי כי תאי האפידרמיס ואת השערות הם מניפולציה כדי לשחרר את התאים זקיקי השיער. להביא את הנפח הכולל בצינור עד 50 מיליליטר עם מדיום טרי ולאסוף את התא לסינון על ידי צנטריפוגה. תן מחדש את גלולה ב 5 מיליליטר של מדיום קציר טרי על 20 triturations עם פיפט 5 מיליליטר.קח 0.5 מיליליטר של אחד עד 20 דילול ולהעביר אותו לצינור microfuge 2 מיליליטר. לאחר ערבוב הדגימה בזהירות, יש ליטול 200 מיקרוליטרים מצינור המיקרופוג' ולערבב בעדינות עם נפח שווה של 0.4% פתרון כחול טריפאן. מערבבים בעדינות פתרון זה שלוש פעמים ומעבירים את התאים להמוציטומטר לספירת קרטינוציטים גרעינים.ציון כל התאים הכחולים הכהים כמו תאים שאינם ניתנים לשימוש ציון תאים קטנים זהב ורדפל כמו תאים קיימא. ממוצע הכדאיות הוא כ-80%, ותפוקת הקרטינוציטים הסופית לעכבר צריכה להיות כ-30 מיליון תאים בני קיימא. לאחר הספירה, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת, ועל תרבות ההמונים resuspend פעמיים עד ארבע פעמים 10 כדי keratinocytes קיימא השישי לכל 35 צלחת פטרי מילימטר ב 2 מיליליטר של מדיום תרבות התא.עבור מקדם היווצרות מושבה clonogenic, resuspend התאים באחת פעמים 10 כדי keratinocytes השלישי לכל ארבעה מיליליטר של שונה ויליאם E מדיום עם תוספי תזונה בריכוז סרום לכל קולגן מצופה 60 מילימטר צלחת פטרי על רנטגן מוקרן עכבר שוויצרי 3T3 שכבות הזנה. לתרבות ההמונים, לגדל את התרבויות ב 32 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני לתקופה המתאימה תרבות התא. שינוי המדיום 24 שעות לאחר הזריעה הראשונית לתרבות ההמונים ושלוש פעמים בשבוע לאחר מכן.בסוף תרבות השיבוטים שאפו את המדיום ותקן את המושבות בפורמלין 10% במהלך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, להכתים את המושבות עם 0.5% rhodamine B במים autoclaved במשך שעה אחת, לפני שטיפה את הכלים במים אוטוקלאבים קרים עד המים זורמים צלולים. ואז לשים את הכלים על העפעפיים שלהם להתייבש לפני ספירת המושבות.כאן, תוצאות אופייניות של keratinocyte המושבה היווצרות משגיח לאחר טיפולים אקטואליים שונים מוצגים. תאי גזע זקיקי השיער בדרך כלל לפצות כ 9% של התאים מבודדים עור עור הגב בוגר C57BL/6 העכבר כפי שהוערך על ידי כתמים ציטומטריים זרימה עבור סמני תא גזע זקיק שיער העכבר. בנתון זה ניתן לראות את מאפייני הצמיחה של מושבות תאי גזע קרטינוציטים לאחר תרבות בארבעה תנאים בינוניים שונים.בעקבות הליך זה, התאים יכולים לשמש עבור ציטומטריית זרימה, מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, תרבות תאים וניתוחים ביולוגיים מולקולריים. טכניקה זו אפשרה לנו לקבוע כי מספר תאי גזע אפידרמליים הוא תכונה כמותית ומורכבת המובילה לזיהוי גן רגולטורי חדש של תאי גזע.

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (EPI-NCSC) תרבויות

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...