Name: isolation of mouse epidermal keratinocytes and their in vitro clonogenic culture
Uploaded: 2019-08-10T13:00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture at JoVE.com

Авторы не имеют подтверждений.

<ol>
	<li>Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+primary+in+vitro+clonogenic+keratinocytes+from+normal+adult+murine+epidermis,+following+initiation,+and+during+promotion+of+epidermal+tumors.">Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors.</a> Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).</li><li>Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+for+murine+keratinocyte+stem+cells+based+on+cell+surface+phenotype.">Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells.">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).</li><li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+for+living+murine+keratinocytes+from+the+hair+follicle+bulge+with+the+cell+surface+marker+CD34.">Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34.</a> Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).</li><li>Redvers, R. P., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+cultivation+of+primary+adult+murine+keratinocytes.">Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C-treated+3T3+fibroblasts+used+as+feeder+layers+for+human+keratinocyte+culture+retain+the+capacity+to+generate+eicosanoids.">Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids.</a> Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).</li><li>Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in &#8220;high calcium&#8221; defined medium. , (1994).</li><li>Wu, W. Y., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+harvest+and+assay+of+in+vitro+clonogenic+keratinocytes+stem+cells+from+mice.">Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice.</a> Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).</li><li>Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+keratinocyte+stem+cell+regulatory+loci+implicated+in+skin+carcinogenesis.">Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).</li><li>Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+keratinocyte+colony+number+is+genetically+controlled.">Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled.</a> Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).</li><li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+microarray+transcriptome+profiling+of+CD34-enriched+mouse+keratinocyte+stem+cells.">Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).</li><li>Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+covalent+DNA+adducts+in+mouse+epidermal+subpopulations+after+topical+application+of+benzo(a)pyrene+and+7,12-dimethylbenz(a)anthracene.">Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene.</a> Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).</li><li>Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal,+multipotency,+and+the+existence+of+two+cell+populations+within+an+epithelial+stem+cell+niche.">Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.</a> Cell. 118 (5), 635-648 (2004).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Описанный здесь метод сбора кератиноцитов был разработан для получения высоких урожаев высокоурожайных первичных эпидермальных кератиноцитов со спины взрослых самок мышей. Эти кератиноциты подходят для цитометрии потока, применения молекулярной биологии и первичной клеточной культуры, включая клоногенный анализ, о который сообщалось здесь. Этот метод сбора кератиноцитов также был полезен для изучения других аспектов кожного химического канцерогенеза и поощрения опухоли1,13.
В протоколе есть несколько важных шагов. Во-первых, для строгости и воспроизводимости использовались самки мышей в возрасте 54 лет и 2 дня. Это позволило нам выполнять чувствительные и количественные анализы колонии от нескольких штаммов мышей и использовать их в качестве фенотипа в анализе связей, ведущих к выявлению по крайней мере один новый ген регулятивного стволовых клеток10,11. Во-вторых, полезно разрезать шкуры на более мелкие кусочки, так как трипсинизация более эффективна, чем попытка сохранить кожу целиком. В-третьих, время и температура флотации трипсина очень важны для последующей виновности. Кроме того, нужно "тыкать значительно" на волосы, оставшиеся на фильтре, чтобы выбить прикрепленные клетки. Этот шаг важен для получения высоких урожаев клеток. Кроме того, температура инкубатора в 32 градуса имеет важное значение для долгосрочного выращивания кератиноцитов у взрослых мышей. Наконец, в этом протоколе параллельные считывания экспериментов in vitro и in vivo1 основаны на первичных культурах, а не на субкультурах или клеточных линиях. Примечательно, что если сбор первичных кератиноцитов в первый раз с помощью этого протокола, сохранить оставшиеся дермы после соскабливания, чтобы подтвердить полное удаление волосяных фолликулов вместе с эпидермис гистопатологического наблюдения.
Основная сила этого протокола для сбора взрослых кератиноцитов мыши является то, что он производит высокие урожаи виновных клеток, которые подходят для многих приложений вниз по течению. Главным ограничением является то, что некоторые эпитопы поверхности клеток могут быть чувствительны к трипсинизации, что иммуностоирование может быть скомпрометировано. Поэтому при тестировании нового антитела поверхности клетки, это может быть разумным использовать dispase6 или термолизин5 метод для сбора урожая для сравнения. Значение этого протокола является то, что он был тщательно протестирован, количественно, и применяется к таким разнообразным приложениям, как анализы для клоногенных стволовых клеток1,9,10,11, для массовых культур в биохимии8, для сортировки FACS в анализе стволовых клеток3,4, для молекулярной биологии3,12, и для текущего РНК и секвенирования ДНК.

Кожа млекопитающих охватывает все тело и выполняет множество функций (например, первичный физический барьер, регулирование температуры и удержание влаги). За последние пять десятилетий, фундаментальные исследования кожи мыши дали новую информацию о структуре и функции кожи. Модель кожи мыши в значительной степени помогла понять основную биологию, лежащую в основе сложных молекулярных механизмов химического или ультрафиолетового радиационного канцерогенеза. Эти модели кожи мыши вносят значительный вклад в понимание кожных заболеваний человека и их смягчения. Для дальнейшего молекулярного вскрытия первичных кератиноцитов в биологии развития волосяного фолликула, исследования стволовых клеток, канцерогенеза и генетического исследования эпидермиса, часто желательно изолировать и культуры первичного эпителия кератиноциты из кожи мышей для использования параллельно с in vivo экспериментов. Мотивирующей фактором при разработке этого метода была необходимость анализа in vitro для клоногенных эпидермальных и волосяных фолликулов стволовых клеток1,2. Существовал также насущной необходимости для одноклеточных суспензий эпидермальных клеток, пригодных для клоногенных анализов3, флуоресценция активированной сортировки клеток, и поток цитометрии3,4. Преимуществами этого метода являются надежный урожай увеличить напорядок по сравнению с другими методами 5,6, включение эпителиальной части волосяных фолликулов, и высокая виновность собранных клеток. В 80-е годы не существовало известных методов, которые могли бы удовлетворить эти потребности. В последующие годы этот метод был усовершенствован для повышения урожайности клеток. Основным ограничением этого метода будет маскировка некоторых пробипсин чувствительных антител, которые поставят под угрозу иммунореактивность6.
Мыши получили животноводство в соответствии с конкретными рекомендациями патогена Бесплатно. Было получено от одной до пяти самок мышей в возрасте от 54 до 2 дней. У пожилых мышей жизнеспособность кератиноцитов будет снижена из-за фазы анагена (роста) волосяного цикла. Кроме того, процесс трипсиизации сложнее по сравнению с молодыми мышами. Процедура сбора урожая была успешно оптимизирована для более тонкой кожи самок мышей по сравнению с самцами. Мышей, как правило, не используются для кератиноцитов урожаи, поскольку они имеют тенденцию бороться друг с другом во время проживания и, следовательно, может оставить царапины или раны на коже.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring</td>
			<td>Bel-Art, Wayne</td>
			<td>371101128</td>
			<td>in 2 oz Nalgene jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable pipettes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile conical tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 (T-150) culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Screw Cap Micro Tube Conical</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 oz Nalgene jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2118-0002</td>
			<td>60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin solution 10X</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>225 cm2 (T-225) culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2019-1000</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm sterile culturing dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable pipets</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile conicle tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm sterile culturing dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-&#181;m pore size</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>145956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics (penicillin-streptomycin)</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine calf serum (BCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td>
			<td>SH30073.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Ram34 FITC conjugated antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 70-&#181;m sterile</td>
			<td>BD Discovery Labware</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Bovine, Type I, 30mg</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials</td>
			<td>Biocison</td>
			<td>BCS-136PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>made fresh; twice distilled reverse osmosis water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td>
			<td>SH 300070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-320-730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 50 mg/mL 10</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene &#8220;Mr. Frosty&#34; cell freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2116-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 22 sterile stainless-steel blades</td>
			<td>BD Bard-Parker</td>
			<td>371222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 4 scalpel handles</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>26-1200</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One pair of full-curve eye dressing forceps</td>
			<td>Militex</td>
			<td>18-784</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One pair of scissors</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>25-1050</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One pair of thumb dressing forceps</td>
			<td>Militex</td>
			<td>6-4</td>
			<td>In a cup with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade</td>
			<td>Jarden Consumer Solutions/Oster</td>
			<td>78997-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6240-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2akappa PE isotype control antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SFM</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>10725-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMEM</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>11380-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>11380-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square sterile plastic Petri dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss mouse 3T3 fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-92</td>
			<td>used within 10 passages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz</td>
			<td>Triad Group</td>
			<td>10-8216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams E Medium</td>
			<td>Life Technologies Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziploc bag</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse epidermal keratinocytes and their in vitro clonogenic culture

Описанный здесь протокол является надежным методом сбора первичных кератиноцитов у взрослых самок мышей (54 и 2 дня), приносящих примерно 30 х 106 жизнеспособных клеток на мышь. Первичные взрослые кератиноциты мыши собирают из сонной кожи самок мышей. Мышей мужского пола (6 недель) можно использовать для сбора кератиноцитов в зависимости от требований эксперимента. Эвтанированные мыши бритят и стерилизовать с помощью серийных спусков в растворах йода и этанола (70% алкоголя). После дезинфекции мышей, сонна кожа удаляется и подкожный жир и мышцы удаляются скальпелем и отбрасываются. Шкуры разрезаются на мелкие кусочки и обрабатываются мягкой, низкой температурой трипсинизации, чтобы отделить нижнюю дерму от эпидермиса. Царапины эпидермизпереваются на низкой скорости, фильтруются для удаления волос, подсчитываются и повторно подвешены в среде культуры. Этот метод обеспечивает отличную одноклеточную подвеску высоковозмутимых ячеек для многих приложений ниже по течению.

Как правило, урожайность эпидермальных кератиноцитов на мышь в диапазоне от 20 х 106 до 30 х 106 Трипан синий исключая клетки получаются 8,9. Выживаемость колеблется от 80%-90%. Типичная эффективность посева составляет около 30% вложения на 24 ч. Формирование колонии на облученных 3T3 фидерных слоев составляет около 60 колоний на 1000 жизнеспособных клеток, посеянных для мышей C57BL/6, и приблизительно 30 колоний на 1000 клеток для мышей швейцарского типа10 ,11. Типичные результаты анализов формирования колонии иллюстрируются на рисунке 1. Количество стволовых клеток волосяного фолликуласоставляет примерно 9% CD34 /CD49f- стволовые клетки для c57BL/6 мышей12. Типичные результаты цитометрии потока приведены на рисунке 2.
Характеристики роста четырех различных носителей иллюстрируются на рисунке 3. Средства массовой информации испытания включают KGM-золото, SFM, Уильямe E среды, и Моррис-2 (снижение кальция среды, разработанной в лаборатории Моррис аналеки на основе Уильямс E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig1.jpg"> Рисунок 1: Репрезентативные примеры из асссея на клоногенные кератиноциты взрослых мышей. Эта фотография демонстрирует кератиноцитов колонии формирования из CD-1 самок мышей 54 дней лечение местно с 1) без лечения, 2) ацетон следуют через неделю ацетон два раза в неделю в течение двух недель, 3) DMBA следуют одну неделю спустя ацетон два раза в неделю в течение двух недель, 4) ацетон следуют одну неделю спустя TPA два раза в неделю в течение двух недель, и 5) DMBA следуют одну неделю спустя TPA два раза в неделю в течение двух недель. После их лечения in vivo, кератиноциты были собраны и посеяны по 1000 клеток на блюдо на фидер слоев облученных 3T3, и культивируется в течение двух недель, после чего блюда были зафиксированы с буферным формалином и окрашены родамина B. Блюда в каждой колонке являются репликациями из каждой группы лечения мыши. Обратите внимание, что число крупных колоний увеличилось после лечения ДМБА, а общее число колоний увеличило tPA лечение мышей до сбора кератиноцитов. Аббревиативы: ДМБА: 7,12-диметилбенбенззан; ТПА: 12-О-Тетрейдраканойлгорбол-13-ацетат. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig2.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативный пример цитометрии потока стволовых клеток волосяного фолликула у взрослых мышей. Короче говоря, изолированные первичные кератиноциты были выделены из кожи предстных мышей и фильтруются для клеточного мусора с помощью клеточного фильтра. Изолированная подвеска кератиноцитов была помечена антителами CD49f или No6-итегрин (PE) и CD34 (FITC) вместе с живым мертвым красителем и другими элементами управления. FitC и PE изотип контроля антител (Крыса IgG2akappa) были использованы для компенсации цели (см. Таблица материалов). Стволовые клетки были выбраны с помощью CD49f (PE канал), который признал внешний компонент геми-десмосомы найти на базальных эпидермальных и волосяных фолликуляций клеток, и CD34 (канал FITC), который признал волосяной фолликул стволовых клеток (т.е., CD34-FITC и a6-PE (верхняя правая колонка, всего 5%)). Правая боковая колонка показывает различные популяции кератиноцитов, а именно только CD34-FITC, CD34-FITC и a6-PE-клетки (двойная положительная популяция стволовых клеток), a6-PE только, и неокрашенные клетки. Обратите внимание, что Есть два CD34и стволовых клеток населения, как было сообщено6,14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig3.jpg"> Рисунок 3: Сравнение четырех различных носителей первичных культур эпидермальных клеток у взрослых самок мышей. Первичные кератиноциты были выделены из кожи дорсалом мышей и рассчитывали для посева с использованием четырех различных носителей (KGM, SFM, Willem's-E и Morris-2). Равное количество кератиноцитов были посеяны и следуют за их общей морфологии и модели роста. Обратите внимание, что размножающиеся кератиноциты имеют несколько иную морфологию. KGM, SFM и Morris-2, все из которых снижены кальция средств имеют наиболее устойчивый рост после четырнадцати дней. В отличие от этого, клетки не сохраняются, когда культивируется в Уильямс E среды, которая имеет 1,4 мМ кальция и высокое соотношение калия к натрию. Удивительно, Уильямс E среды с добавками и двадцать процентов плода сыворотки крупного рогатого скота поддерживает кератиноцитов клональных культур гораздо лучше, чем любой другой среде испытания, вероятно, потому, что обогащенный Уильямс E среды помогает 3T3 фидерных клеток "кормить" лучше. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Решения и медиа</td>
			<td>Комментарии</td>
		</tr>
<tr>
<td>Решения для сбора урожая</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2,5% трипсин (5 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS Дульбекко (500 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Гентамицин (2 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS с 2x гентамицин (45 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Фосфат-буферный солен (PBS) с 2x гентамицином</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Решение trypsin</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Решения для клеточной культуры</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Решение похотливого покрытия purecol-fibronectin:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M HEPES (1 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>116 мМ CaCl2 (1 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Бовин сывороточный альбомин 1,0 мг/мл (10 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Среда культуры клеток (100 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Фибронектин (1 мг)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Пуркольный коллаген (1 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Решение для замораживания ячеек</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMSO (2 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM с 10% БКС и пером-стрептококком</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Урожай Средний</td>
			<td>Нужно быть без кальция</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x гентамицин (1 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS (50 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>МЭМ (500 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Высоко-Кальций Уильямс 'E Сми с:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF (5 мкг/мл) 1 мл</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Глутамин 14,5 мл</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Гидрокортизон (1 мг/мл) 0,5 мл</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Инсулин 1 мл</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Линокислота-BSA (0,1 мг/мл) 0,5 мл</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MEM Ess AminoAcids 4 мл</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MeM Витамины 5 мл</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Пенициллин-стрептомицин 5 мл</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Трансферрин (5 мг/мл) 1 мл</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Вит А (1 мг/1000 л) 57,5 л</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vit E 1 мг/мл (4 градуса) 3,5 л</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vit D2 (10 мг/мл) 50 л</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3T3 фибробластполный средний рост (CGM)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>БКС (100 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM (900 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Пенициллин-стрептомицин (10 мл)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Кгм</td>
			<td>Средний, используемый для массовой культуры, является уменьшенной средой кальция</td>
		</tr>
<tr>
<td>Моррис 2 среды с теми же добавками, как Уильямс E</td>
			<td>Уменьшенный вариант кальция Williams E с добавками</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Рецепты решения и мультимедиа.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture at JoVE.com

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

Целью этого протокола является изоляция эпидермальных кератиноцитов из псовой кожи взрослых мышей для различных приложений вниз по течению, таких как молекулярная биология, биохимия, флуоресценция активированной сортировки клеток, и первичных в пробирке использует (например, клоногенные приложения кератиноциты).

Изоляция мыши Эпидермальных кератиноцитов и их в пробирке клоногенной культуры

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Наш метод сбора эпидермальных клеток у взрослых мышей полезен для применения ниже по течению, таких как стволовые клетки кератиноцитов. Наша техника очень воспроизводится и может быть использована в сочетании с процедурами in vivo у мышей в контексте модели канцерогенеза кожи. После сбора образцов спинной кожи от усыпляемых взрослых мышей, используйте автоматические миппы и скальпель, чтобы поместить одну спинную кожу в то время, волосатые стороны вниз в тонкую чашку Петри и отказаться от подкожной ткани, включая жир из брюшной ткани кожи, пока ткань полупрозрачной.Поместите царапины кожи в PBS до тех пор, пока все другие оставшиеся шкуры обрабатываются. Затем используйте скальпель, чтобы нарезать образцы кожи на 0,5 на 1,5 сантиметра полосы. Поместите полоски волосатые стороны вверх в стерильной чашке Петри перед плавающей образцы волосатые стороны на поверхности 20 миллилитров PBS плюс два х гентамицина раствор, дополненный 0,25%трипсина в пластиковых 100 на 20 миллиметров Петри блюдо в течение двух часов при 32 градусов по Цельсию.В конце инкубации поместите стерильную, пластиковую, квадратную чашку Петри, содержащую 15 миллилитров среды сбора урожая на наклоне 30 градусов, и используйте изогнутые типсы, чтобы тщательно перенести плавающую полоску кожи в блюдо. Держа новое лезвие скальпеля под перпендикулярным углом к коже и используя достаточную, но не чрезмерную силу, откаблив эпидермис и волосы из образца в среду. Когда все полоски были Царапины, тщательно декант эпидермальной клетки, содержащие supernatant в стерильной 60 миллилитров банку, содержащую 1,5 дюйма магнитного перемешать бар и промыть чашку Петри с дополнительной среды сбора урожая для сбора оставшихся эпидермальных клеток.Довнесите окончательный объем в банке до 30 миллилитров со свежей средой и перемешайте раствор эпидермальных клеток при 100 вращениях в минуту в течение 20 минут при комнатной температуре. В конце перемешивания инкубации в шкафу биобезопасности удалить перемешать бар и фильтровать клеточный раствор через 70 микрометровый ситечко в 50 миллилитров конической трубки. Используйте типсы, а затем пипетку, чтобы нажать волосы и слои роговицы материалов через ситечко манипулировать ткани, чтобы освободить захваченных волосковых клеток и использовать дополнительные пять миллилитров уборки среды, чтобы освободить остающиеся захваченных волосковых клеток в трубку.Очень важно, чтобы эпидермальные клетки и волосы манипулировали, чтобы освободить клетки от волосяных фолликулов. Довнесите общий объем в трубке до 50 миллилитров со свежей средой и соберите клеточный фильтрат путем центрифугации. Resuspend гранулы в 5 миллилитров свежей среды сбора урожая примерно в 20 тритураций с 5 миллилитров пипетки.Возьмите 0,5 миллилитров от одного до 20 разбавления и перенесите его в 2 миллилитровую трубку микрофуза. После тщательного смешивания образца возьмите 200 микролитров из трубки микротехи и аккуратно перемешайте с равным объемом 0,4%trypan синий раствор. Аккуратно смешайте этот раствор три раза и перенесите клетки на гемоцитометр для подсчета нуклеонированных кератиноцитов.Оценка всех темно-синих клеток, как неприкосновенные клетки и оценка малых золотых и розоватых клеток в качестве жизнеспособных клеток. Жизнеспособность в среднем составляет около 80%, а окончательный выход кератиноцитов на мышь должен быть около 30 миллионов жизнеспособных клеток. После подсчета, собирать клетки с другой центрифугации, и для массовой культуры resuspend два-четыре раза от 10 до шестой жизнеспособной кератиноцитов на 35 миллиметров Петри блюдо в 2 миллилитров клеточной культуры среды.Для анализа формирования клоногенной колонии, повторное использование клеток в один раз от 10 до третьего кератиноцитов на четыре миллилитров модифицированного Уильяма E Medium с добавками в концентрации сыворотки на коллаген покрытием 60 миллиметров Петри блюдо на рентгеновском облученных швейцарских мыши 3T3 фидер слоев. Для массовой культуры, расти культур на 32 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа для соответствующего периода культуры клеток. Изменение среды через 24 часа после первоначального посева для массовой культуры и три раза в неделю после этого.В конце клональной культуры аспирировать среды и исправить колоний в 10%buffered формалин в течение ночи при комнатной температуре. На следующее утро, пятно колоний с 0,5% родамина B в автоклавной воде в течение одного часа, прежде чем полоскания посуды в холодной автоматической воде, пока вода не протекает ясно. Затем наклонять посуду на крышках, чтобы высохнуть, прежде чем считать колонии.Здесь показаны типичные результаты анализа образования кератиноцитов колонии после различных актуальных методов лечения. Стволовые клетки волосяного фолликула обычно составляют около 9% клеток, изолированных от взрослых C57BL/6 мыши спинной кожи, как оценивается потоком цитометрического окрашивания для маркеров стволовых клеток волосяного фолликула мыши. В этой цифре можно наблюдать характеристики роста колоний стволовых клеток кератиноцитов после культуры в четырех различных средних условиях.После этой процедуры клетки могут быть использованы для цитометрии потока, флуоресценции активированной сортировки клеток, клеточной культуры и молекулярного биологического анализа. Этот метод позволил нам определить, что количество эпидермальных стволовых клеток является количественной и сложной чертой, ведущей к идентификации нового гена регулятивных стволовых клеток.

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Мышь эпидермального нервного гребня стволовых клеток (EPI-NCSC) Культур

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Клоногенных Пробирной: прилипшие клетки

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Выделение и культура Индивидуальные мышечных волокон и их сателлитные клетки от взрослых скелетных мышц

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Выделение и Культура неонатологическую мыши кардиомиоцитов

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Изоляция, культура и функциональная характеристика взрослой мыши Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Выделение и Культура Стоматологическая эпителиальных стволовых клеток из взрослых мышей резца

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Выделение и Культура взрослой мыши кардиомиоцитов для клеточной сигнализации и<em&gt; В пробирке</em&gt; Гипертрофия сердца

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...