Name: quantifying leukocyte egress via lymphatic vessels from murine skin and tumors
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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लेखक YUMM १.१ और YUMM १.७ murine मेलेनोमा लाइनों और डॉ दबोरा जे Fowell प्रदान करने के लिए बी-6 प्रदान करने के लिए डॉ मार्कस Bosenberg शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । तटरक्षक-टीजी (सीएजी-tdKaede) MEXT, जापान के राष्ट्रीय जैव संसाधन के माध्यम से आरआईकेईएन BRC के साथ समझौते में चूहों 15Utr ।

सभी पशु प्रोटोकॉल ओरेगन स्वास्थ्य & विज्ञान विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. सूजन और माउस Pinna के FITC पेंटिंग की प्रेरण
<ol><li>एक लामिना प्रवाह ह?...

हालांकि परिधीय से ल्युकोसैट निकास, गैर लसीकावत् ऊतकों दीक्षा और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के समाधान के लिए महत्वपूर्ण है, आणविक तंत्र है कि सरकार निकास खराब समझ रहे हैं । ज्ञान में यह अंतर काफी हद तक v...

परिधीय ऊतक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं न केवल सूजन की साइटों के लिए ल्युकोसैट भर्ती द्वारा आकार के हैं, लेकिन यह भी तंत्र है कि उनके बाद प्रतिधारण को विनियमित द्वारा । इस प्रकार, सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा संचई सेलुलर और आणविक तंत्र है कि निर्धारित करता है कि एक ल्युकोसैट में प्रवेश करती है, भीतर रहता है, या नहीं बल्कि लसीका वाहिकाओं के माध्यम से परिधीय ऊतक के बाहर प्रवास द्वारा तय है । महत्वपूर्ण बात, ल्यूकोसाइट्स के लिए प्रवृत्ति लसीका वाहिकाओं के माध्यम से ऊतक बाहर निकलने के लिए (निकास) उनके विशेष कार्यों से जुड़ा हुआ है । वृक्ष कक्ष (DC) में परिपक्वता संकेत antigen परिवहन और प्रस्तुति में लिम्फ नोड्स (dLN), एक प्रक्रिया है कि अनुकूली उन्मुक्ति प्रतिरक्षा के लिए आवश्यक है के लिए अग्रणी की प्रतिक्रिया में प्रवासी व्यवहार प्राप्त1। ऐसी मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल के रूप में माइलॉयड कोशिकाओं सफाई, phagocytosis के माध्यम से अपोप्तोटिक मलबे स्पष्ट करने के लिए सेवा करते हैं । बैक्टीरियल संक्रमण के दौरान, न्यूट्रोफिल निकास ऊतक और अंत में dLNs2 में apoptosis से गुजरना और DSS-प्रेरित कोलाइटिस के एक मॉडल में, डेटा परिकल्पना है कि मैक्रोफेज निकास स्थानीय सूजन3को हल करने के लिए आवश्यक है का समर्थन करता है । चाहे न्युट्रोफिल और मैक्रोफेज निकास सभी भड़काऊ संदर्भों में होता है, तथापि, अज्ञात है । टीलिम्फोसाइट निकास स्थिर राज्य से4,5,6,7, संक्रमित8, और सूजन4,9,10, के लिए सबूत 11,12 परिधीय, गैर लसीकावत् ऊतकों को इंगित करता है कि टी कोशिकाओं को सक्रिय रूप से पुनर्संचारित, हालांकि ऊतक आधारित संकेतों है कि इस बाहर निकलें ड्राइव खराब समझ में रहते हैं । कई अध्ययनों से पहचाना लसीका केशिकाओं और बाद में निकास सहित chemokine (सी सी आकृति) ligand 21 (CCL21) और इसकी रिसेप्टर CCR74,11draining की ओर दिशात्मक प्रवास के लिए आवश्यक संकेतों की पहचान की है 13, chemokine (सी-एक्स-सी आकृति) ligand 12 (CXCL12) और इसकी रिसेप्टर CXCR42,14, और sphingosine-1-फॉस्फेट (S1P)10,15,16. इन तंत्रों सभी संदर्भों में सक्रिय नहीं हैं, तथापि, और क्या वे सभी प्रकार के सेल के निकास निर्धारित एक खुला सवाल रहता है । महत्वपूर्ण बात, तंत्र में और अधिक जानकारी है कि निकास और उसकी बीमारी में कार्यात्मक प्रासंगिकता नियंत्रण के विश्लेषण के vivo तरीकों में मात्रात्मक की आवश्यकता है ।
कई तरीकों को लसीका वाहिकाओं के प्रत्यक्ष cannulation सहित vivo में कई पशु मॉडलों में निकास यों तो इस्तेमाल किया गया है, पूर्व वीवो लेबल ल्यूकोसाइट्स, फ्लोरोसेंट अनुरेखक के ट्रांसडर्मल आवेदन के दत्तक हस्तांतरण, लेबल कणों के इंजेक्शन, और vivo photoconversion में17,18. प्रत्यक्ष cannulation के afferent माउस लसीका वाहिकाओं मुश्किल है और तरल पदार्थ है कि एकत्र किया जा सकता है की मात्रा से छोटे जानवरों में सीमित है । इस प्रकार, cannulation मोटे तौर पर बड़े जानवरों में प्रदर्शन किया गया है (जैसे, भेड़) जहां इस तरह के सर्जिकल जोड़तोड़ व्यावहारिक हैं । ये अध्ययन दोनों लसीकावत् और माइलॉयड कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए प्रत्यक्ष सबूत10,19,20में प्रदान करते हैं । इसके अलावा, ovine मॉडल पता चलता है कि तीव्र और जीर्ण सूजन लिम्फ में लिम्फोसाइट उपस्थिति में वृद्धि हुई लगभग १००-गुना10,21.
लेबल और आनुवंशिक रूप से हेरफेर लिम्फोसाइटों के दत्तक स्थानांतरण महत्वपूर्ण रूप से पता चला है कि CCR7 तीव्र सूजन त्वचा से CD4+ टी कोशिकाओं के निकास के लिए आवश्यक है5,11, जबकि लिम्फोसाइटों के उपचार छोटे अणु S1P रिसेप्टर एगोनिस्ट, FTY720 के साथ, केवल आंशिक रूप से उनके10निकास को रोकता है । दिलचस्प है, लंबे समय से सूजन त्वचा से तबादला लिम्फोसाइटों के निकास CCR7-स्वतंत्र10है, लेकिन आंशिक रूप से9CXCR4 की आवश्यकता हो सकती है । adoption स्थानांतरण प्रयोगों, तथापि, गैर शारीरिक संख्या में सक्रिय पूर्व vivo और इंजेक्शन के माध्यम से ऊतक में लिम्फोसाइटों लेबल, जो ऊतकों और ऊंचा मध्यवर्ती द्रव दबाव के यांत्रिक वातावरण बदल वितरित कि प्रारंभिक लसीका केशिकाओं खुला और उनके परिवहन गुण22बदल जाते हैं । एक विकल्प के रूप में, fluorescein isothiocyanate (FITC) की उपस्थिति या चमड़े की अड़चन के अभाव में ट्रांसडर्मल आवेदन (जैसे, dibutyl phthalate, DBP) या23संक्रमण,24 की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है phagocytic कोशिकाओं है कि अनुरेखक जमा और dLNs के लिए माइग्रेट. इसी तरह, फ्लोरोसेंट लेबल ट्यूमर phagocytic कोशिकाओं है कि ट्यूमर सामग्री25घिरा हुआ है ट्रैक करने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं । इन पद्धतियों तंत्र है किडीसी निकास13,14,17,26,27 पर शासन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है, लेकिन गैर phagocytic ट्रैक करने में असमर्थ है लिम्फोसाइटों और, व्याख्या मुक्त घुलनशील FITC के लसीका जल निकासी इस प्रकार गैर प्रवासी, LN निवासी dc लेबल द्वारा जटिल हो सकता है ।
वैकल्पिक रूप से, intravital माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली उपकरण है कि vivo वास्तविक समय28,29में शारीरिक रूप से प्रासंगिक ल्युकोसैट आबादी के ट्रैकिंग में के लिए अनुमति देता है । रिपोर्टर चूहों और एंटीबॉडी-vivo immunofluorescent लेबलिंग में आधारित के साथ संयोजन में प्रयुक्त, intravital माइक्रोस्कोपी मध्य प्रवास 30 सहित प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी के जटिल स्थानिक और लौकिक गतिशीलता से पता चला है , लसीका endothelium भर में स्थानांतरगमन, लसीका लुमेन के भीतर पारित होने और, LN प्रविष्टि28,31पर प्रवासन । intravital इमेजिंग तकनीक के व्यापक अपनाने व्यय द्वारा सीमित है, सेट अप के लिए आवश्यक विशेषज्ञता, और एकाधिक कोशिका प्रकार को बढ़ाता है के लिए सीमित प्रवाह । फिर भी, युग्मन मात्रात्मक विधियों कि intravital इमेजिंग के साथ जनसंख्या गतिशीलता ऊतकों का विश्लेषण गतिशीलता और प्रवास की ओर और लसीका केशिकाओं के भीतर के तंत्र के संबंध में अतिरिक्त और महत्वपूर्ण यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा 18 , 31 , ३२.
नतीजतन, vivo photoconversion में एक तरीका है कि सीटू लेबलिंग में , phagocytic गतिविधि से स्वतंत्र के लिए अनुमति देता है के रूप में उभरा है, और शारीरिक ल्युकोसैट निकास के ठहराव के लिए (जब प्रवाह cytometry के साथ युग्मित) में अनुपस्थिति या चुनौती की उपस्थिति । Kaede-टीजी चूहों constitutively पथरीले कोरल है कि हरी प्रतिदीप्ति (Kaede हरा) से अलग बैंगनी प्रकाश को उजागर जब तक प्रदर्शित एक प्रोटीन व्यक्त, जिसके बाद यह अचल लाल प्रतिदीप्ति (Kaede लाल)३३में धर्मांतरित । Photoconverted कोशिकाओं के रूप में वे परिधीय ऊतक साइटों से निकास और dLNs में जमा ट्रैक किया जा सकता है । यह और इसी तरह के अंय photoconvertible माउस मॉडल३४,३५ से पता चला है महत्वपूर्ण जीव विज्ञान के गठन निकास सहित त्वचा से विनियामक टी कोशिकाओं३६, CXCR4-निर्भर बी सेल निकास से Peyer पैच३७ , पर निवासी स्मृति टी कोशिकाओं के जुड़ाव पेप्टाइड पुनः चुनौती३८, और व्यापक ल्युकोसैट निकास ट्यूमर microenvironments३९से । इस के साथ साथ, हम त्वचा की सूजन और संक्रमण के संदर्भ में ट्रांसडर्मल FITC आवेदन के साथ photoconversion की एक सिर से सिर की तुलना करने के लिए photoconvertible विधि के साथ मौजूदा डेटा की प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, हम प्रत्यारोपित ट्यूमर में photoconversion प्रदर्शन और ट्यूमर microenvironments से रूपांतरण दक्षता और चयनात्मक निकास का वर्णन । जैसे, हम तर्क है कि इन तरीकों के आगे आवेदन के लिए ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास के महत्वपूर्ण जीव विज्ञान स्पष्ट की जरूरत है, जो intratumoral ल्युकोसैट जटिलता की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ होगा, विरोधी ट्यूमर उन्मुक्ति, और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4536282001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor</td>
			<td>Prizmatix Ltd</td>
			<td>V8144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyl phthalate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>524980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>2440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29-guage syringes</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um cell strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>HBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 CD11c (clone N418)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>562363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 CD3e (clone 145-2C11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC CD8a (clone 53-6.7)</td>
			<td>TonBo Biosciences</td>
			<td>20-0081-u100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 CD19 (clone 6D5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 CD11b (clone M1/70)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 CD4 (clone RM4-5)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (Fraction V)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fortessa Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10 Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying leukocyte egress via lymphatic vessels from murine skin and tumors

परिधीय ऊतकों से ल्युकोसैट निकास लिम्फ नोड्स draining के लिए न केवल प्रतिरक्षा निगरानी और दीक्षा के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी परिधीय ऊतक प्रतिक्रियाओं के समाधान के लिए योगदान देता है । जबकि तरीकों की एक किस्म के लिए गैर लसीकावत्, परिधीय ऊतकों, सेलुलर और आणविक तंत्र है कि संदर्भ पर शासन-निर्भर निकास खराब समझ में रहने से ल्युकोसैट निकास यों तो इस्तेमाल किया जाता है । यहां, हम murine त्वचा और ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सीटू photoconversion में उपयोग का वर्णन । Photoconversion चमड़े के नीचे ऊतक के भीतर ल्यूकोसाइट्स निवासी के प्रत्यक्ष लेबलिंग के लिए अनुमति देता है । हालांकि बैंगनी प्रकाश के लिए त्वचा जोखिम स्थानीय भड़काऊ ल्युकोसैट घुसपैठ और संवहनी leakiness द्वारा विशेषता प्रतिक्रियाओं लाती है, एक सिर में फ्लोरोसेंट अनुरेखकों के ट्रांसडर्मल आवेदन के साथ तुलना सिर, photoconversion विशेष रूप से लेबल प्रवासी वृक्ष कोशिका आबादी और इसके साथ ही त्वचा के microenvironments और ट्यूमर से माइलॉयड और लसीकावत् निकास के ठहराव सक्षम होना चाहिए । ल्युकोसैट निकास के तंत्र intratumoral ल्युकोसैट जटिलता के बारे में हमारी समझ में एक लापता घटक रहते हैं, और इस प्रकार के उपकरण के आवेदन के साथ साथ यहां वर्णित ट्यूमर प्रतिरक्षा की गतिशीलता में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा microenvironments दोनों स्थिर राज्य में और चिकित्सा के जवाब में ।

हम पहले photoconversion साहित्य में प्रकाशित करने के लिए दक्षता का मूल्यांकन परिणाम दोहराने की मांग की और माउस त्वचा में जुड़े सूजन निर्धारित करते हैं । कान pinna पहले३३वर्णित के रूप में 3 मिनट...

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Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

यहां, हम ल्युकोसैट निकास के vivo ठहराव में भोले, सूजन, और घातक murine त्वचा के लिए तरीके प्रदर्शित करते हैं । हम दो मॉडलों की एक सिर से सिर की तुलना प्रदर्शन: ट्रांसडर्मल FITC आवेदन और सीटू photoconversion में । इसके अलावा, हम त्वचा के ट्यूमर से ल्युकोसैट निकास पर नज़र रखने के लिए photoconversion की उपयोगिता का प्रदर्शन ।

Murine त्वचा और ट्यूमर से लसीका वाहिकाओं के माध्यम से ल्युकोसैट निकास बढ़ाता

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

फोटोकंवर्सेशन ल्यूकोसिटे निवास में एक यंत्रवादी अंतर्दृष्टि के लिए ल्यूकोसिटे egress के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए वीवो विधि में एक ट्रैक करने योग्य प्रदान करता है और रोगग्रस्त राज्यों में कई ऊतक साइटों से बाहर निकलना गतिशीलता प्रदान करता है। खैर, यहां हम क्यूकोसाइट ट्रैकिंग की उपयोगिता को क्यूकॉयश ट्यूमर से प्रदर्शित करते हैं। अन्य ऊतकों और बीमारियों के लिए इस परख का आवेदन केवल प्रकाश को प्रशासित करने की क्षमता से सीमित है।इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि विवो में सूजन ऊतकों से एक egress के रूप में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी स्थानांतरित करने के बजाय अंतर्जात के मात्राकरण की अनुमति देता है। सूजन को प्रेरित करने के लिए, अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, एक माइक्रोपिपेट का उपयोग डायब्यूटिल थैलेट या डीबीपी के 20 माइक्रोलीटर को एक एनेस्थेटाइज्ड काडे ट्रांसजेनिक माउस के कान पिन्ना के वेंट्रल साइड में प्रशासित करने के लिए करें। डीबीपी को सूखने की अनुमति देने के बाद, एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े में एक भट्ठा के माध्यम से कान खींचें और ऊपर की ओर का सामना कर रहे पृष्ठीय पक्ष के साथ पन्नी के लिए कान को साफ सुरक्षित करने के लिए डबल-तरफा टेप का उपयोग करें।फिर, स्थिति है कि आप सीधे एक 405 नैनोमीटर प्रकाश स्रोत और बिजली के 100 मिलीवाट पर तीन मिनट के लिए फोटोकनवर्ट के तहत कर रहे हैं। वैक्सिनिया संक्रमण के लिए, एक माइक्रोपिपेट का उपयोग 5 गुना 10 को पीबीएस के 10 माइक्रोलीटर में वैसिनिया वायरस की 6 पट्टिका बनाने वाली इकाइयों को एक एनेस्थेटाइज्ड काडे ट्रांसजेनिक माउस के कान पिन्ना पर करने और पिन्ना को 25 बार प्रहार करने के लिए करें। 24 घंटे बाद, फोटो पिन्ना के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया ।उपयुक्त प्रायोगिक समय बिंदु पर, पिन्नी और सर्वाइकल और इंगिनल लिम्फ नोड्स की कटाई करें और प्रत्येक पिन्ना के वेंट्रल और पृष्ठीय पक्ष को अलग करने के लिए चिमटी के दो जोड़े का उपयोग करें। फिर लिम्फ नोड्स और पिन्ना टुकड़ों को कान के अंदर सामना करने के साथ, 24-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में रखें जिसमें कोलेज डी के 1 मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर और कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त एचबीबीएस में पतला डीएनएस के 80 इकाइयां प्रति मिलीलीटर होते हैं। प्रत्येक लिम्फ नोड कैप्सूल को खोलने के लिए दो 29 गेज सुइयों का उपयोग करें और प्लेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक ऊतक के एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए अलग-अलग 70 माइक्रोन नायलॉन सेल स्ट्रेनर्स के माध्यम से पचा पिन्ना और लिम्फ नोड ऊतकों को दबाएं। जब ट्यूमर उचित प्रयोगात्मक आकार के लिए हो गए हैं, ट्यूमर साइट के आसपास किसी भी नए regrown फर दाढ़ी और एल्यूमीनियम पन्नी का एक टुकड़ा में एक परिपत्र छेद कटौती के माध्यम से ट्यूमर खींच । ट्यूमर सीधे 405 नैनोमीटर प्रकाश स्रोत और 200 मिलीवाट बिजली पर 5 मिनट के लिए फोटोकनवर्ट के नीचे स्थिति।फोटोकनॉवर्तन के 24 घंटे बाद, प्रत्येक जानवर से ट्यूमर और ब्रैकिल और इंगिनल लिम्फ नोड्स की कटाई करें और एचबीबीएस में कोलेजनेस डी और डीएनएसे युक्त 24-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं के भीतर ट्यूमर को कीमा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। लिम्फ नोड्स को अलग-अलग कुओं में रखें और कैप्सूल को खोलें जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया है। एक घंटे के लिए ट्यूमर इनक्यूबेटिंग और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक आधे घंटे के लिए लिम्फ नोड्स इनक्यूबेटिंग के बाद, प्रत्येक ऊतक के एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए अलग ७० माइक्रोन छलनी के माध्यम से पचा ऊतकों को दबाएं ।फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एकल कोशिका निलंबन का विश्लेषण करने के लिए, सबसे पहले एक काडे ट्रांसजेनिक माउस से तिल्ली या रक्त एकत्र करें और अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम बफर के साथ लाल रक्त कोशिकाओं को lyse करें। कोशिकाओं को एक अपरिवर्तित काडे फिटसी और एक परिवर्तित काडे पीई आबादी में विभाजित करें और 24-अच्छी प्लेट के एक कुएं में पीबीएस के एक मिलीलीटर में एकल रंग काडे पीई कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, फिर 100 मिलीवाट में 405 नैनोमीटर प्रकाश स्रोत के तहत कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए फोटोकंवर्ट करें। अगला प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल की कुल सीमा के 70 से 80% तक फोटोमल्टीप्लाज़ सेट करने के लिए फोटोकनवर्टेड काडे पीई कोशिकाओं और अपरिवर्तित काडे फिटसी कोशिकाओं का उपयोग करें।एक बार Kaede प्रोटीन के लिए वोल्टेज सेट किया गया है, अंय प्राथमिक एंटीबॉडी दाग के सभी के लिए क्षतिपूर्ति एकल फ्लोरोफोर लेबल मुआवजा मोती का उपयोग कर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार । फिर, मानक प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण प्रोटोकॉल के अनुसार प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने चलाएं। फोटोकनॉवर्स एक्सपोजर के तुरंत बाद कान की त्वचा या सर्वाइकल ड्रेनिंग लिम्फ नोड्स से उत्पन्न सिंगल सेल सस्पेंशन त्वचा में सभी सीडी 45 पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की 78% रूपांतरण दक्षता प्रकट करती है, जिसमें नोइंग लिम्फ नोड्स में कोई परिवर्तित कोशिकाएं नहीं दिखाई देती हैं।फोटोकनवर्टेड कान शून्य और 24 घंटे बाद रूपांतरण में घुसपैठ सीडी 45 सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स की संख्या की मात्रा से पता चलता है कि वायलेट प्रकाश जोखिम ल्यूकोसिटे घुसपैठ में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि का कारण बनता है। CD45 सकारात्मक ल्यूकोसिटे घुसपैठ में यह वृद्धि हालांकि, एक शक्तिशाली भड़काऊ उत्तेजना जैसे वैक्सिनिया वायरस से प्रेरित घुसपैठ के सापेक्ष छोटी है। फोटोकंवर्सेशन भी मीलों परख द्वारा मापा के रूप में कान pinnae में संवहनी पारगम्यता बढ़ जाती है, एक साथ यह दर्शाता है कि ऊतक सूजन पर बैंगनी प्रकाश के प्रभाव पर विचार किया जाना चाहिए जब खुराक, जोखिम समय और डेटा व्याख्या का अनुकूलन ।फोटोकनवर्टेड जानवरों से अलग ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण काडे फिटक सकारात्मक से काडे पीई सकारात्मक करने के लिए इंट्राट्यूमोरल सीडी 45 सकारात्मक कोशिकाओं के एक महत्वपूर्ण रूपांतरण का पता चलता है, जबकि लिम्फ नोड कोशिकाओं को निकालने से अपरिवर्तित रहते हैं। CD45 सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स की फोटोकन्वर्जन दक्षता ट्यूमर प्रकार और आकारों के बीच काफी भिन्न होती है, जिसमें सीडी 45 सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स के साथ छोटे मेलानोमा ट्यूमर के भीतर सबसे कुशल फोटोकंवर्सन का प्रदर्शन होता है। ट्यूमर की मात्रा में वृद्धि के रूप में, रूपांतरण दक्षता लगभग 50% तक कम हो जाती है, विशेष रूप से, मेलेनिन का फोटोकन्वर्जन दक्षता पर एक उल्लेखनीय प्रभाव पड़ता है जिसमें सीडी 45 सकारात्मक कोशिकाओं की अधिकतम फोटोकन्वर्जन के साथ छोटे ट्यूमर में केवल लगभग 30% के ट्यूमर का उत्पादन होता है, जो ट्यूमर की मात्रा 400 घन मिलीमीटर तक पहुंचने के साथ 10% तक गिर जाता है।फोटोकनॉवर्स के 24 घंटे बाद ट्यूमर की जांच लिम्फ नोड्स की जांच से विभिन्न फेनोटाइप की काडे रेड पॉजिटिव इम्यून सेल्स की मौजूदगी का पता चलता है, इस तरह फोटोकनवर्टेड ट्यूमर से ल्यूकोसिट इमीग्रेशन का प्रदर्शन होता है । इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए स्थिर राज्य के काइनेटिक्स को उजागर करने और परिधीय ऊतक में ल्यूकोसाइट टर्नओवर को उजागर करने का मार्ग प्रशस्त किया। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि केवल ब्याज के ऊतकों को फोटोकनवर्ट किया गया है, क्योंकि आसपास के ऊतकों का अनजाना फोटोकनिवर्तन आपके परिणामों से समझौता करेगा।इस विधि के लिए नए व्यक्तियों को अपने ऊतकों के रूपांतरण के लिए जोखिम समय का अनुकूलन करना चाहिए, साथ ही ऊतक संग्रह ब्याज की ल्यूकोसाइट की गतिशीलता के आधार पर समय की अवधि।

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Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Murine अस्थि मज्जा में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

वाई-27632 वयस्क त्वचा ऊतकों से मानव मेलानोसाइट्स की उपज को समृद्ध करता है

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

एक जले हुए घाव का एक मुरीन मॉडल एक एलोजेनिक त्वचा भ्रष्टाचार के साथ खंगाला

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

एक्सोलॉटल अंग पुनर्जनन के दौरान पूर्ण त्वचा प्रालंब सर्जरी के माध्यम से घाव एपिडर्मिस गठन का निषेध

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...