Name: establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies 53110000117 (naar G.W.) en 043222019 (met X.W.) van Tsinghua Universiteit.

Houd er rekening mee dat alle hier beschreven muis experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd overeenkomstig de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van Tsinghua.
1. generatie van DR3 overexpressie cellijnen
<ol><li>Bouw van de plasmide voor DR3 expressie (pMXs-IRES-DR3-FLAG) door het invoegen van full-length DR3 cDNA met 3 x vlag in het C-terminus in retrovirale vector pMXs-IRES-Blasticidin op de sites van de beperking van BamHI/XhoI.</li>
	<li>Groeie...

<ol>
	<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+for+gene+transfer,+expression,+knockdown,+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals.">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li><li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+BCR/ABL-induced+leukemias.">Animal models of BCR/ABL-induced leukemias.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 11, 57-60 (1993).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+correction+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+ex+vivo+gene+therapy.+The+New+England.">Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li><li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation,+self-inactivating+gp91(phox)+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD/SCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34++cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease.">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).</li><li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors.">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).</li><li>Zhou, J., Giannakakou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+microtubules+for+cancer+chemotherapy.">Targeting microtubules for cancer chemotherapy.</a> Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).</li><li>Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeted+agents:+when+mitochondria+become+essential+to+chemotherapy.">Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).</li><li>Bhalla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeted+anticancer+agents+and+apoptosis.">Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis.</a> Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).</li><li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs.">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li><li>Bhat, K. M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy.">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li><li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destabilising+agents:+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs.">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells.">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li><li>Marsters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apo-3,+a+new+member+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family,+contains+a+death+domain+and+activates+apoptosis+and+NF-kappa+B.">Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B.</a> Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).</li><li>Chinnaiyan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+DR3,+a+death+domain-containing+receptor+related+to+TNFR-1+and+CD95.">Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.</a> Science. 274 (5289), 990-992 (1996).</li><li>Xu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+3+mediates+TNFSF15-+and+TNFalpha-induced+endothelial+cell+apoptosis.">Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 55, 109-118 (2014).</li><li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells.">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+TWEAK-induced+cell+death.">Multiple pathways of TWEAK-induced cell death.</a> Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li><li>Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division.">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li><li>Hassan, M. S., von Holzen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Model:+Xenograft+Mouse+Models+in+Esophageal+Adenocarcinoma.">Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma.</a> Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).</li><li>Potter, H., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+by+electroporation.">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effects+of+transfection:+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells.">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).</li><li>Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection.">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li><li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells.">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li></ol>

In dit manuscript beschrijven we een methode voor het genereren van HT29-DR3 stabiele cellijnen. HT29-DR3 cellen bieden een model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die door die DR3 draagt bij aan apoptosis geïnduceerd door antimitotische agenten. Deze aanpak is veelzijdig en herhaalbaar. Om te verzekeren het succes van de procedure, vier belangrijke stappen van het protocol moeten worden overwogen. Eerst, produceren een hoog genoeg virus titer, wordt u aangeraden uitvoeren DNA transfectie wanneer de Pla...

Heterologe genexpressie is vaak aangewend om te bestuderen van de functie van genen van belang. Twee methoden, voorbijgaande en stabiele transfectie, worden prevalently gebruikt in cellen en moleculaire biologie aan een segment van DNA of RNA invoegen een host cel1,2. Transient-transfected DNA of RNA kan niet worden doorgegeven aan dochtercellen, zodat de genetische wijziging kan alleen worden gehandhaafd voor een korte periode van tijd. Aan de andere kant, in stabiel transfected cellen, zijn exogene genen geïntegreerd in het ontvangende cel genoom, behoud van de expressie in de cellijn. Dus, stabiele transfectie is een methode die is meestal gereserveerd voor onderzoek naar lange termijn genetische verordening. De stabiele cellijn kan ook worden getransplanteerd zoals xenografts in Muismodellen voor in vivo studie3. Stabiele transfectie kan worden onderverdeeld in twee categorieën: virale en nonviral. In vergelijking met nonviral transfectie, kunt virale infectie overbrengen van genen in een breder scala aan menselijke cellen met een hogere efficiëntie4,5,6,7. Bovendien biedt een stabiele cellijn van een enkele kloon het voordeel van homogeniteit en klonen zuiverheid.
Ongecontroleerde celgroei en deling zijn de meest onderscheidende kenmerken van de kanker. In klinische instellingen zijn antimitotische agenten de primaire behandelingen voor vele soorten tumoren8. Echter, enkele belangrijke beperkingen van antimitotische agenten kunnen niet worden genegeerd. Eerst, deze chemokuren kunnen ook doden normale cellen samen met de ongewenste kankercellen en, dus, kunnen leiden tot ernstige bijwerkingen8. Tweede, antitubulin medicijnen zijn niet effectief tegen alle soorten tumoren, ondanks tubuline de alomtegenwoordige expressie in een breed scala aan verschillende weefsels als een cytoskeletal eiwit9,10. Het is onduidelijk waarom antitubulin agenten toonde veelbelovende werkzaamheid tegen ovariële, Long-, en hematologische kankers in klinische behandeling, maar niet in de nier, dubbele punt of alvleesklier kanker11. Ten slotte, zelfs patiënten met hetzelfde type tumor kunnen reageren op de antimitotics anders op een onvoorspelbare wijze. Kan er een belangrijke effector molecuul dat is van invloed op de gevoeligheid van verschillende patiënten aan antimitotische agentia, resulterend in de uiteenlopende resultaten gezien in klinische behandeling12. Dus moeten de potentiële differentiële gevoeligheden van patiënten antimitotische behandeling in aanmerking worden genomen voor het optimaliseren van therapeutische interventies13.
Een high-throughput geheel-genoom siRNA bibliotheek scherm aangetoond dat DR3 knockdown gevoelige cellen resistent tegen antimitotische geneesmiddelen, we een rol voor DR3 in chemotherapie-veroorzaakte apoptosis14kan renderen. Als een lid van de tumor necrose factor receptor (TNFR) superfamilie, is DR3 gemeld te bemiddelen cel apoptosis in verschillende systemen15,16,17,18. Dus zetten we uit om stabiele cellijnen DR3 om te bestuderen van de moleculaire mechanismen waarmee antimitotische geneesmiddelen apoptosis induceren overexpressing. Een model van de juiste cel voor het bestuderen van DR3 overexpressie kan worden verstrekt door de menselijke Colón kanker cellijn HT29, die bleek te zijn DR3-deficiënte. Bovendien, in de kliniek, dikke darm kankers zijn ongevoelig voor antimitotische geneesmiddelen19.
In dit artikel beschrijven we een methode waarmee de generatie van een HT29-DR3 stabiele cellijn door retrovirale infectie. Verder laten we zien hoe de DR3 expressie in deze cellen gebruikend het westelijke bevlekken valideren en hoe om te beoordelen van de gevoeligheid voor antimitotische agentia met behulp van een cel levensvatbaarheid assay en morfologische observatie. De cellen van één klonen worden versterkt en, dus, hebben het voordeel van een homogene genetische achtergrond. Bovendien mag de vlag-tag op DR3 voor de visualisatie van cellulaire DR3 door microscopie en analyse van gen expressie en eiwit interactie door biochemische benaderingen. Bovendien, kunnen de cellen xenografted in muizen aan tumor progressie in reactie op antimitotics in vivo14verder te analyseren.
De HT29-DR3 cel systeem gepresenteerd hier aangeboden een doeltreffend instrument voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van hoe antimitotics doden van kanker cellen14. Aangezien overexpressie en vechtpartij cellijnen gemeenschappelijke hulpmiddelen zijn voor de bestudering van de genfunctie, kan dit protocol worden aangepast gemakkelijk aan andere genen van belang of andere cellijnen en, dus, omgevormd tot een veel gebruikte aanpak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C11965500BT</td>
			<td>Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMXs-IRES-Blasicidin</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RTV-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14190500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse secondary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plat-A cell line</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning Cylinder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT3MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m steril filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>ImageQuant LAS 4000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring Shaker&#160;</td>
			<td>HINOTECH</td>
			<td>TS-2000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-bl-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>TC 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics

Bestuderen van de functie van een gen van belang kan worden bereikt door het manipuleren van het niveau van meningsuiting, zoals minderen qua uitdrukkingswijze met vechtpartij cellijnen of het verhogen van de expressie met overexpressie cellijnen. Voorbijgaande en stabiele transfectie zijn twee methoden die worden vaak gebruikt voor exogene genexpressie. Voorbijgaande Transfectie is alleen handig voor korte termijn expressie, overwegende dat stabiele transfectie kunt exogene genen worden geïntegreerd in het genoom van de cel host waar het voortdurend zal worden uitgedrukt. Dientengevolge, is stabiele transfectie meestal werkzaam voor onderzoek in lange termijn genetische verordening. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het genereren van een stabiele cellijn tagged dood receptor 3 (DR3) te verkennen DR3 functie overexpressing. We pakte enkele klonen na een retrovirale infectie teneinde de homogeniteit en de zuiverheid van de stabiele cellijnen. De stabiele cellijnen gegenereerd met behulp van dit protocol maken DR3-deficiënte HT29 cellen gevoelig voor antimitotische geneesmiddelen, aldus bijenpopulatie de apoptotic reactie in HT29 cellen. Bovendien, de vlag-tag op DR3 compenseert de onbeschikbaarheid van goede DR3 antilichaam en vergemakkelijkt de biochemische studie van het moleculaire mechanisme waarmee antimitotische agenten apoptosis induceren.

Een karakterisering van HT29 cellen stabiel uiten DR3 is afgebeeld in Figuur 1. De klonen express uiteenlopende niveaus van DR3, terwijl de wild-type-cellen, die als een negatieve controle dienen, geen exogene genexpressie vertonen. Hier tonen we slechts vijf klonen, waaronder kloon 1 en 5 express het hoogste niveau van DR3. We kozen de kloon 1 en 5 voor de volgende experimenten.
De morfologie van c...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics at JoVE.com

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Tot oprichting van de cellijnen Overexpressing DR3 om te beoordelen van de Apoptotic reactie op anti-mitotische Therapeutics

Tot vaststelling van een stabiel cellijn overexpressing een gen van belang zijn voor het bestuderen van de genfunctie kan gebeuren door stabiele transfectie-picking enkele klonen na transfecting hen via retrovirale infectie. Hier laten we zien dat HT29-DR3 cellijnen gegenereerd op deze manier verhelderen de mechanismen door welke dood receptor 3 (DR3) draagt bij tot antimitotics-veroorzaakte apoptosis.

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Overexpressie genen in cellen is een belangrijke manier om genfunctie te bestuderen. Stabiele transfectie met het retrovirus maakt het mogelijk om endogene genen in het gastheergenoom te integreren en continu uit te laten. We pikten enkele kolonies van de retrovirale infectie op en genereerden stabiele cellijnen die de DR3 met flag-taggen overexpressen.De cellijnen compenseerden voor de onbeschikbaarheid van goed DR3-antilichaam en boden uitstekende instrumenten voor dr3-functiestudie post in vitro en in vivo. We genereerden de DR3 overexpressie cellijnen door het oppakken van een enkele kolonie van de retrovirale infectie. Cellijnen uit één kolonie kunnen de homogeniteit en zuiverheid behouden.Bovendien is het protocol eenvoudig en eenvoudig te hanteren. Om te beginnen met deze procedure, groeien plat-A cellen 's nachts in 60-millimeter gerechten met vier milliliter DMEM. Wanneer cellen 80 tot 90% samenvloeiing bereiken, gebruikt u transfection reagens om ze te transfecteren met twee microgram van het geconstrueerde plasmide zoals beschreven in de handleiding van de fabrikant.Na 72 uur, het verzamelen van de supernatant. Met behulp van een 0,45 micrometer steriel filter, filter de media, en houd de virale suspensie in het donker op vier graden Celsius. Vervolgens groeien HT29 cellen 's nachts in een 60-millimeter schotel met DMEM, het uitbroeden van de cellen op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.Wanneer de cellen bereiken 30 tot 50%samenvloeiing, infecteren ze met twee milliliter virale suspensie in aanwezigheid van acht microgram polybrene per milliliter van virale suspensie. Broed de geïnfecteerde cellen op 37 graden Celsius gedurende vier tot zes uur. Dan, aspirate de virale schorsing.Voeg vier milliliter verse DMEM toe en breng de schotel terug naar de couveuse. Verwijder na 24 uur na infectie de media uit de afwas en was de cellen zorgvuldig met twee milliliter voorverwarmde PBS. Voeg een milliliter trypsine EDTA toe en broed de cellen gedurende drie minuten uit op 37 graden Celsius.Met behulp van een microscoop op 10 keer vergroting, observeren de cellen om ervoor te zorgen dat de meeste van hen hebben losgemaakt. Voeg hierna twee milliliter DMEM toe met 10%FBS om de trypsinisatie te stoppen en verzamel de celsuspensie in een buis van 15 milliliter. Centrifuge op 200 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, en verwijder de supernatant.Schort de celpellet opnieuw op in 10 milliliter DMEM enpipet zachtjes op en neer om te mengen. Verdun vervolgens de cellen met factoren van 30, 100 en 300. Zaad van de cellen is 150-millimeter schotels die elk 20 milliliter DMEM met blasticidin bevatten bij een concentratie van één microgram per milliliter.Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende ongeveer één tot twee weken. Gebruik tijdens deze periode een omgekeerde microscoop bij 10 keer vergroting om de kolonies elke dag te observeren. Markeer de goed geïsoleerde kolonies op de bodem van de schotel wanneer de diameter van de kolonies ongeveer één tot twee millimeter is.Wanneer de incubatietijd is voltooid, aspiraat het medium en was de cellen met drie milliliter van voorverwarmde PBS. Voeg twee milliliter trypsin EDTA toe in een schaal van 60 millimeter. Gebruik steriele tangen op te halen autoclaved steriele klooncilinders en leg ze in de schotel.Dan, pick-up van de cilinders die nu elk zal bevatten ongeveer 30 microliter trypsin EDTA, en voorzichtig plaats ze over de gemarkeerde kolonies. Breng de schotel drie minuten terug naar de couveuse. Controleer hierna de cellen onder een microscoop om er zeker van te zijn dat ze loskomen.Wanneer de cellen zijn opgetild, bij 70 microliter van cultuurmedium aan elke cilinder om trypsine te inactiveren. Gebruik een pipet van 200 microliter om de celsuspensie voorzichtig te mengen, zodat u de cilinder niet beweegt tijdens het mengen. Stel twee 24-well platen, en label ze plaat A en plaat B.Voeg een milliliter dmem aan elke put.Voeg 30 microliter celsuspensie toe aan elke put van plaat A en voeg 70 microliter toe aan de overeenkomstige putten van plaat B.Plaats de platen terug in de couveuse. Wanneer de cellen in plaat B op 90% samenvloeiing zijn, verwijder de media en was de cellen zorgvuldig met één milliliter PBS. Verwijderde de PBS volledig en voeg 50 microliters 1X SDS-PAGE laadbuffer toe om de cellen te lyse.Breng na vijf minuten de cellysaat van de 24-putplaat over naar 1,5 milliliter centrifugebuizen. Kook de monsters op 100 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voer de monsters op 10% SDS gel op een constante spanning van 80 volt gedurende 15 minuten en vervolgens op 120 volt gedurende een uur.Breng het eiwit vervolgens over op een polyvinylideenfluoridemembraan door natte overdracht bij een constante stroom van 400 milliampère gedurende twee uur. Verdun het primaire antilichaam met een factor 5.000 in 5% vetvrije melk die wordt opgelost in TBST. Voeg de VLAG-antilichaam aan het membraan, en incubeer op vier graden Celsius 's nachts.Met behulp van een ontkleurende shaker ingesteld op 200 RPM, was het membraan met TBST gedurende 15 minuten, het vernieuwen van de TBST om de vijf minuten. Verdun vervolgens een anti-muis secundair antilichaam met een factor 10.000 in 5% vetvrije melk. Incubeer het membraan met verdund secundair antilichaam bij vier graden Celsius gedurende vijf tot zes uur.Was het membraan op de ontkleuringshaker opnieuw zoals eerder beschreven. Gebruik hierna Western enhanced chemiluminescence en een geldocumentatiesysteem om het membraan in beeld te brengen en de FLAG-expressie te detecteren. Verzamel eerst zowel HT29- als HT29-DR3-cellen door trypsinisatie en gebruik een automatische celteller om de celdichtheid te meten.Zaad de cellen in de putten van 12-well platen met DMEM bij een dichtheid van 30.000 cellen per put, en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. De volgende dag, voeg 10 nanomolar van diazonamide aan elke put die cellen met behulp van 1%DMSO als een negatieve controle bevat, en breng de platen naar een incubator op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Na 48 uur behandeling, beeld de cellen onder een microscoop bij 10 keer vergroting.Vervolgens, zaad zowel HT29 en HT29-DR3 cellen in de putten van 96-well plaat met DMEM op een dichtheid van 3,000 cellen per put, en laat ze groeien op 37 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, voeg dosis-escalerende diazonamide concentraties zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik na 48 uur behandeling een op luminescentie gebaseerde celreetiekit om de levensvatbaarheid van de cel te meten.Haal de 96-put plaat uit de couveuse en laat hem ongeveer 30 minuten op kamertemperatuur staan. Voeg vervolgens 50 microliter testsneert aan elke put toe en schud de plaat twee minuten bij kamertemperatuur om de cellen te lyse. Incubeer de plaat op kamertemperatuur gedurende 10 minuten, en gebruik vervolgens een microplaatlezer om de luminescentie van elke put te bepalen.Karakterisering van HT29 cellen stabiel uitdrukken DR3 blijkt dat de klonen verschillende niveaus van DR3 uitdrukken, terwijl de wild-type cellen geen exogene genexpressie vertonen. Genen een en vijf worden gezien om de hoogste niveaus van DR3 uit te drukken, en dus worden gekozen voor verdere experimenten. De morfologie van HT29- en HT29-DR3-cellen wordt waargenomen na 48 uur te zijn behandeld met diazonamide.HT29-DR3 cellen vertonen duidelijke apoptose met een gebroken celmembraan en celpuin. Echter, HT29 cellen tonen alleen mitotische arrestatie met intacte cellen die een round-up cel vorm vertonen. De cel levensvatbaarheid van deze celtypes wordt vervolgens bepaald na behandeling gedurende 48 uur met drie nanomolar van diazonamide.HT29-DR3 cellen worden gezien als een cel dood van meer dan 80%, terwijl de ouderlijke HT29 cellen tonen slechts een lichte reactie in de vorm van mitotische arrestatie. Dit geeft aan dat de overexpressie van DR3 de door diazonamide geïnduceerde apoptotische route in deze cellen reconstrueerde. Goede seriële verdunningen zijn belangrijk om een optimale dichtheid van enkele klonen te krijgen.Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat elke klooncilinder slechts één kolonie bevat en om te voorkomen dat nabijgelegen kolonies besmet raken. De DR3 overexpressie cellijnen vergemakkelijkten de biochemische studie van de moleculaire mechanismen in vitro. We genereerden HT29-DR3 xenografts door onderhuidse injectie van HT29-DR3 cellen, en het hielp bij het uitwerken van de mechanismen van antimitotische middelen-geïnduceerde apoptose in vivo.Dit protocol kan worden gebruikt om genen van belang in andere cellijnen te bestuderen. Bovendien is gen knock-out een andere manier voor functionele studie, en ons protocol kan worden aangepast aan de gen knockdown systemen. Het is dus algemeen toepasbaar om genfuncties te verduidelijken.Vergeet niet om het virus te laten vallen naar het afval naar specifieke containers voor de veiligheid verwijdering.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotid Cancer Cell Injection aan muismodellen van Brain metastase Produce

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Generatie van prostaatkanker modellen van de cel van de weerstand tegen de anti-mitotische Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Voorwaardelijke Knockdown van genexpressie in kanker cellijnen te bestuderen van de aanwerving van monocyten/macrofagen naar de Tumor communicatie

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Op lange termijn Live-cel Imaging om te beoordelen van cel lot in reactie op Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radio sensitiviteit van kanker stamcellen in longkanker cellijnen

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimalisatie van prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...