Name: establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים 53110000117 (כדי G.W.) ו 043222019 (ל X.W.) מאוניברסיטת צינג.

שימו לב: כל הניסויים העכבר המתוארים כאן היו אישר וביצע בהתאם טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת צינג.
1. דור של שורות תאים ביטוי DR3
<ol><li>לבנות את פלסמיד לביטוי DR3 (pMXs-IRES-DR3-דגל) על-ידי הוספת cDNA DR3 באורך מלא עם 3 x הדגל על קצה קרבוקסילי לתוך retroviral וקטור pMXs-IRES-Bla...

<ol>
	<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+for+gene+transfer,+expression,+knockdown,+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals.">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li><li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+BCR/ABL-induced+leukemias.">Animal models of BCR/ABL-induced leukemias.</a> Leukemia &amp; Lymphoma. 11, 57-60 (1993).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+correction+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+ex+vivo+gene+therapy.+The+New+England.">Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li><li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation,+self-inactivating+gp91(phox)+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD/SCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34++cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease.">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).</li><li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors.">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).</li><li>Zhou, J., Giannakakou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+microtubules+for+cancer+chemotherapy.">Targeting microtubules for cancer chemotherapy.</a> Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).</li><li>Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeted+agents:+when+mitochondria+become+essential+to+chemotherapy.">Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).</li><li>Bhalla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-targeted+anticancer+agents+and+apoptosis.">Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis.</a> Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).</li><li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs.">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li><li>Bhat, K. M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy.">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li><li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+destabilising+agents:+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs.">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li><li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells.">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li><li>Marsters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apo-3,+a+new+member+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family,+contains+a+death+domain+and+activates+apoptosis+and+NF-kappa+B.">Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B.</a> Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).</li><li>Chinnaiyan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+DR3,+a+death+domain-containing+receptor+related+to+TNFR-1+and+CD95.">Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.</a> Science. 274 (5289), 990-992 (1996).</li><li>Xu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+3+mediates+TNFSF15-+and+TNFalpha-induced+endothelial+cell+apoptosis.">Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 55, 109-118 (2014).</li><li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells.">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+TWEAK-induced+cell+death.">Multiple pathways of TWEAK-induced cell death.</a> Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li><li>Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division.">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li><li>Hassan, M. S., von Holzen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Model:+Xenograft+Mouse+Models+in+Esophageal+Adenocarcinoma.">Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma.</a> Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).</li><li>Potter, H., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+by+electroporation.">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effects+of+transfection:+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells.">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).</li><li>Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection.">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li><li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells.">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li></ol>

כתב יד זה, אנו מתארים שיטה ליצירת שורות תאים יציב HT29-DR3. תאים HT29-DR3 מספקות מודל לימוד המנגנון המולקולרי שבאמצעותו DR3 תורמת אפופטוזיס המושרה על ידי סוכנים antimitotic. גישה זו היא תכליתי הדיר. כדי להבטיח ההצלחה של ההליך, ארבעה שלבים מרכזיים של הפרוטוקול צריך להיחשב. ראשית, על מנת לייצר גבוה מספיק כי?...

ביטוי גנים heterologous הוא מועסק בדרך כלל ללמוד את התפקוד של הגנים של עניין. שתי השיטות, תרביות תאים ארעית ויציבה, משמשים prevalently תאים וביולוגיה מולקולרית כדי להוסיף מקטע של DNA או RNA1,תא מארח2. ה-DNA או RNA transiently transfected שאי אפשר לעבור לתאי הבת, אז שינוי גנטי יכול להישמר רק לתקופה קצרה של זמן. מצד שני, stably transfected תאים, גנים אקסוגני משולבים לתוך הגנום התא המארח, סופגת ביטויה של הקו הסלולרי. לפיכך, תרביות תאים יציבה היא שיטה זה שמורה בדרך כלל למחקר לתוך תקנה גנטי לטווח ארוך. גם יכול להיות מושתלים הקו הסלולרי יציב כמו xenografts לתוך עכבר מודלים עבור ויוו ללמוד3. תרביות תאים יציבה ניתן לחלק לשתי קטגוריות: ויראלי, nonviral. לעומת תקנים nonviral, זיהום ויראלי יכול להעביר גנים לתוך מגוון רחב יותר של תאים אנושיים עם גבוה יותר יעילות4,5,6,7. יתר על כן, קו יציב תא שיבוט יחיד מציעה את היתרון של הומוגניות וטוהר המשובטים.
גידול תאים בלתי מבוקרת וחילוק הם בעלי התכונות להבחין ביותר של סרטן. הגדרות קליני, סוכנים antimitotic הם הטיפולים העיקרי עבור סוגים רבים של גידולים8. עם זאת, שאי אפשר להתעלם ממנו כמה מגבלות משמעותיות של סוכנים antimitotic. ראשית, אלה chemotherapies גם יכול להרוג תאים נורמליים יחד עם תאים סרטניים רצויה, לפיכך, יכול לגרום תופעות לוואי חמורות8. שנית, antitubulin סמים אינם יעילים נגד כל סוגי גידולים, למרות ביטוי בכל מקום של טובולין במגוון רחב של רקמות שונות כמו חלבון cytoskeletal9,10. לא ברור מדוע סוכנים antitubulin הראה מבטיח יעילות כנגד השחלות, ריאות, סרטן hematological בטיפול קליני, אך לא כליה, המעי הגס או סרטן הלבלב11. בסופו של דבר, אפילו חולים עם אותו סוג של גידול יכול להשיב antimitotics באופן שונה באופן בלתי צפוי. אולי יש מולקולה אפקטור המפתח המשפיעה על הרגישות של מטופלים שונים לסוכנים antimitotic, וכתוצאה מכך התוצאות מגוונות ראיתי טיפול רפואי12. לפיכך, פוטנציאל שהיא התכוונה דיפרנציאלית של חולים לטיפול antimitotic צריך לקחת בחשבון כדי לייעל התערבויות טיפוליות13.
מסך ספריית תפוקה גבוהה הגנום כולו siRNA הפגינו DR3 נוקאאוט לחסרת רגישות תאים עמידים בפני תרופות antimitotic, שמערבות תפקיד עבור DR3 אפופטוזיס כימותרפיה14. כחבר superfamily קולטן (TNFR) הגידול נקרוזה מקדם, דווח DR3 לתווך תא אפופטוזיס שונים מערכות15,16,17,18. לפיכך, יצאנו להקים שורות תאים יציב overexpressing DR3 ללמוד המנגנון המולקולרי שבאמצעותו סמים antimitotic לגרום אפופטוזיס. מודל תאים מתאים עבור הלומדים DR3 ביטוי יכולה להינתן על ידי הקו התא סרטן המעי הגס האנושי HT29, אשר נמצאה להיות DR3 לקויה. בנוסף, במרפאה, סרטן המעי הגס הם רגישות antimitotic סמים19.
במאמר זה, אנו מתארים שיטה המאפשרת את הדור של קו יציב תא HT29-DR3 דרך retroviral זיהום. בהמשך נראה כיצד לאמת את הביטוי DR3 בתאים אלה באמצעות סופג המערבי וכיצד להעריך את הרגישות לסוכנים antimitotic על-ידי שימוש assay הכדאיות תא והתבוננות מורפולוגי. התאים הם מוגבר מן שיבוטים יחיד, ולכן, יש את היתרון של רקע גנטי הומוגני. בנוסף, דגל תג על DR3 מותר עבור הפריט החזותי של DR3 התאית על ידי מיקרוסקופ וניתוח של ג'ין ביטוי וחלבון אינטראקציה על ידי גישות הביוכימי. יתר על כן, התאים ניתן xenografted בעכברים לנתח יותר התקדמות הגידול בתגובה antimitotics ויוו14.
תא HT29-DR3 המערכת המוצגת כאן מוצעים כלי יעיל עבור הלומדים את המנגנונים המולקולריים של מה antimitotics להרוג את תאי הסרטן14. מאז ביטוי וקווים תא תמונות ציפורים הם כלים נפוצים ללמוד תפקוד הגן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות גנים אחרים מעניינים או שורות תאים אחרים והפכו, לפיכך, גישה בשימוש נרחב.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C11965500BT</td>
			<td>Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMXs-IRES-Blasicidin</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RTV-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14190500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse secondary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plat-A cell line</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Immobilon-P</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning Cylinder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>BTCYT3MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX53 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>712001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture plates</td>
			<td>Nest</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m steril filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810000327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well White Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>ImageQuant LAS 4000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring Shaker&#160;</td>
			<td>HINOTECH</td>
			<td>TS-2000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-bl-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>TC 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing cell lines overexpressing dr3 to assess the apoptotic response to anti-mitotic therapeutics

לומד את הפונקציה של הגן עניין יכולה להיות מושגת על-ידי מניפולציה לרמת הביטוי, כגון הפחתת הביטוי שלה עם שורות תאים תמונות ציפורים או להגדיל את הביטוי שלה עם שורות תאים ביטוי. תרביות תאים ארעית ויציבה הם שתי שיטות שבהן משמשים לעתים קרובות על ביטוי גנים אקסוגני. תרביות תאים ארעי שימושית רק ביטוי לטווח קצר, ואילו תקנים יציב מאפשר גנים אקסוגני לשלב את הגנום של התא המארח היכן זה ברציפות יתבטא. כתוצאה מכך, תרביות תאים יציב בדרך כלל מועסק למחקר לתוך תקנה גנטי לטווח ארוך. כאן נתאר פרוטוקול פשוט כדי ליצור קו יציב תא overexpressing מוות מתויג קולטן 3 (DR3) לחקור פונקציה DR3. בחרנו שיבוטים יחיד לאחר זיהום retroviral על מנת לשמור על הומוגניות של טוהר השורות תא יציב. הקווים תא יציב שנוצר באמצעות פרוטוקול זה לבלתי DR3 לקויה HT29 תאים רגישים לסמים antimitotic, ובכך לשחזר את התגובה אפופטוטיים להיפגע בתאים HT29. יתר על כן, התג דגל על DR3 מפצה על אי זמינות של נוגדן DR3 טוב ואסטמה ומקילה על המחקר הביוכימי של המנגנון המולקולרי שבאמצעותו סוכנים antimitotic לגרום אפופטוזיס.

אפיון של תאים HT29 stably לבטא DR3 מוצג באיור1. השיבוטים מביעים רמות משתנות של DR3, בעוד תאי פראי-סוג, אשר לשמש פקד שלילי, לא להראות ביטוי גנים אקסוגני. הנה אנחנו מראים רק שיבוטים חמש, ביניהם לשבט 1 ו- 5 express הרמה הגבוהה ביותר של DR3. בחרנו שיבוט 1 ו-5 על הניסויים הבאים.
<p...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics at JoVE.com

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

הקמת שורות תאים Overexpressing DR3 כדי להעריך את התגובה אפופטוטיים להיפגע הרפוי אנטי-mitotic

הקמת קו יציב תא overexpressing הגן עניין ללמוד פונקציה ג'ין יכול להיעשות על ידי שיבוטים יחיד יציב של חיטוט תרביות תאים לאחר transfecting אותם באמצעות retroviral זיהום. הנה אנחנו מראים כי HT29-DR3 שורות תאים שנוצרו בדרך זו להבהיר את מנגנוני מוות איזה קולטן 3 (DR3) תורמת antimitotics-induced אפופטוזיס.

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

דיכוי יתר של גנים בתאים הוא דרך חשובה לחקר תפקוד הגנים. Transfection יציב עם רטרווירוס מאפשר גנים אנדוגניים להיות משולבים בגנום המארח לידי ביטוי ברציפות. אספנו מושבות בודדות של הזיהום הרטרו-ויראלי ויצרנו קווי תאים יציבים המדחקים יתר על כן את DR3 המתויג בדגל.קווי התאים פיצו על אי זמינות של נוגדן DR3 טוב וסיפקו כלים מצוינים עבור DR3 פונקציה מחקר פוסט במבחנה ו vivo. אנחנו ייצרנו את קווי תאים לחץ יתר DR3 על ידי להרים מושבה אחת של זיהום רטרו-ויראלי. קווי תאים מושבה אחת יכולים לשמור על ההומוגניות והטוהר.בנוסף, הפרוטוקול קל ופשוט לטיפול. כדי להתחיל בהליך זה, לגדל תאים plat-A לילה ב 60 מילימטר מנות עם ארבעה מיליליטר של DMEM. כאשר התאים מגיעים ל-80%-90%, השתמש ברגנט טרנספקט כדי לשנות אותם בשני מיקרוגרם של הפלסמיד הבנוי כמתואר במדריך היצרן.לאחר 72 שעות, לאסוף את העל טבעי. באמצעות מסנן סטרילי 0.45 מיקרומטר, לסנן את המדיה, ולשמור על ההשעיה הנגיפית בחושך בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לגדל תאים HT29 לילה בצלחת 60 מילימטר עם DMEM, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.כאשר התאים מגיעים 30 עד 50%confluence, להדביק אותם עם שני מיליליטר של השעיה ויראלית בנוכחות שמונה מיקרוגרם של פוליברן למיליליטר של השעיה ויראלית. דגירה התאים הנגועים ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד שש שעות. לאחר מכן, שאף את ההשעיה הוויראלית.מוסיפים ארבעה מיליליטר של DMEM טרי ומחזירים את המנה לחממה. ב 24 שעות לאחר זיהום, להסיר את התקשורת מן הכלים בזהירות לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS מחומם מראש. מוסיפים מיליליטר אחד של טריפסין EDTA, ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה פי 10, התבונן בתאים כדי לוודא שרובם התנתקו. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של DMEM המכיל 10%FBS כדי לעצור את טריפסיניזציה, ולאסוף את ההשעיה התא בצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant.להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מיליליטר של DMEM בעדינות פיפטה למעלה ולמטה לערבב. לאחר מכן, לדלל את התאים על ידי גורמים של 30, 100, ו 300. זרע התאים הוא 150 מילימטר מנות כי כל מכילים 20 מיליליטר של DMEM המכיל blasticidin בריכוז של מיקרוגרם אחד למיליליטר.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך כשני שבוע עד שבועיים. במהלך תקופה זו, השתמש במיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 10 כדי להתבונן במושבות מדי יום. סמן את המושבות המבודדות היטב בתחתית המנה כאשר קוטר המושבות הוא בערך 1-2 מילימטרים.כאשר תקופת הדגירה הושלמה, שאפו את המדיום ושטפו את התאים בשלושה מיליליטר של PBS מחומם מראש. מוסיפים שני מיליליטר של טריפסין EDTA בצלחת 60 מ"מ. השתמש מלקחים סטריליים להרים צילינדרים שיבוט סטרילי autoclaved ולמקם אותם בצלחת.לאחר מכן, להרים את הצילינדרים אשר כעת כל אחד מכיל כ 30 microliters של טריפסין EDTA, בעדינות למקם אותם מעל המושבות המסומנות. מחזירים את המנה לאנקובטור לשלוש דקות. לאחר מכן, בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהם התנתקו.כאשר התאים הרימו, ב 70 microliters של תרבות בינוני לכל גליל כדי להשבית את טריפסין. השתמש פיפטה 200 מיקרוליטר לערבב בעדינות את המתלה התא, הקפד לא להזיז את הצילינדר תוך ערבוב. הגדר שתי צלחות 24 באר, ולתייג אותם צלחת A וצלחת B.Add מיליליטר אחד של DMEM לכל באר.מוסיפים 30 מיקרוליטרים של מתלי תאים לכל באר של צלחת A, ומוסיפים 70 מיקרוליטרים ל הבאר המתאימה של צלחת B. מניחים את הצלחות בחזרה לתוך החממה. כאשר התאים בצלחת B הם ב 90%confluence, להסיר את המדיה בזהירות לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS. הסר את ה- PBS לחלוטין והוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר טעינה של 1X SDS-PAGE כדי לריס את התאים.לאחר חמש דקות, להעביר את התא lysate מצלחת 24 באר ל 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה. מרתיחים את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הפעל את הדגימות על 10% ג'ל SDS במתח קבוע של 80 וולט במשך 15 דקות ולאחר מכן ב 120 וולט במשך שעה אחת.לאחר מכן מעבירים את החלבון לממברנה פלואוריד פוליווינילידין על ידי העברה רטובה בזרם קבוע של 400 מיליאמפר במשך שעתיים. לדלל את הנוגדן העיקרי על ידי גורם של 5, 000 ב 5% חלב דל שומן כי הוא מומס ב- TBST. מוסיפים את הנוגדן של FLAG לממברנה, ודגירה בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.באמצעות שייקר decoloring להגדיר 200 סל"ד, לשטוף את הממברנה עם TBST במשך 15 דקות, רענון TBST כל חמש דקות. לאחר מכן, לדלל נוגדן משני נגד העכבר על ידי גורם של 10, 000 בחלב 5% דל שומן. דגירה הממברנה עם נוגדן משני מדולל בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש עד שש שעות.לשטוף את הממברנה על שייקר decoloring שוב כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, השתמש chemiluminescence משופרת המערבית מערכת תיעוד ג'ל כדי תמונה הממברנה ולזהות את הביטוי FLAG. ראשית, לאסוף הן HT29 ו HT29-DR3 תאים על ידי טריפסיניזציה, ולהשתמש מונה תאים אוטומטי כדי למדוד את צפיפות התא.זרע את התאים לתוך בארות של 12 צלחות היטב עם DMEM בצפיפות של 30, 000 תאים ל באר, ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת, להוסיף 10 nanomolar של דיאזונמואיד לכל באר המכילה תאים באמצעות 1% DMSO כשליטה שלילית, ולהעביר את הצלחות לאנקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני. לאחר 48 שעות של טיפול, תמונה התאים תחת מיקרוסקופ ב 10 פעמים הגדלה.לאחר מכן, זרע הן HT29 ו HT29-DR3 תאים לתוך הבאר של צלחת 96 גם עם DMEM בצפיפות של 3, 000 תאים ל הבאר, ולאפשר להם לגדול ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, להוסיף ריכוזי דיאזונומיד הסלמה במינון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר 48 שעות של טיפול, השתמש בערכת בדיקה לכדאיות תאים המבוססת על זוהר כדי למדוד את הכדאיות התאית.מוציאים את צלחת ה-96 היטב מהחמה, ותנו לה לעמוד בטמפרטורת החדר במשך כ-30 דקות. לאחר מכן, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של רה-גנטים לכל באר, ומנערים את הצלחת במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לתפושים את התאים. הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולאחר מכן להשתמש בקורא מיקרופלסטיק כדי לקבוע את luminescence של כל באר.אפיון של תאי HT29 המבטאים את DR3 מגלה כי השיבוטים מבטאים רמות משתנות של DR3 בעוד שתאי הבר אינם מראים ביטוי גנים אקסוגני. גנים 1 ו-5 נראים מבטאים את הרמות הגבוהות ביותר של DR3, ולכן נבחרים לניסויים נוספים. המורפולוגיה של HT29 ו HT29-DR3 תאים נצפו לאחר שטופלו במשך 48 שעות עם דיאזונמיד.תאי HT29-DR3 מציגים אפופטוזיס ברור עם קרום תא שבור ופסולת תאים. עם זאת, תאי HT29 מראים מעצר מיתוטי בלבד עם תאים שלמים המציגים צורת תא מעוגל. הכדאיות התאית של סוגי תאים אלה נקבעת לאחר טיפול במשך 48 שעות עם שלושה ננומולרים של דיאזונומיד.HT29-DR3 תאים נראים יש מוות תאי של מעל 80%בעוד התאים ההורים HT29 להפגין רק תגובה קלה בצורה של מעצר מיתוטי. הדבר מצביע על כך שדיכוי יתר של DR3 מחדש את מסלול האפטומטי הנגרמת על ידי דיאזונומיד בתאים אלה. דילול סדרתי נכון חשוב כדי לקבל צפיפות אופטימלית של שיבוטים בודדים.חשוב גם לוודא שכל גליל שיבוט מכיל רק מושבה אחת ולהימנע מזיהום מושבות סמוכות. קווי התאים המדפרסים יתר על כן של DR3 הקלו על המחקר הביוכימי של המנגנונים המולקולריים במבחנה. אנחנו יצרנו HT29-DR3 xenografts באמצעות הזרקה תת עורית של תאים HT29-DR3, וזה עזר לפרט את המנגנונים של אפופטוזיס הנגרמת על ידי סוכנים אנטימיטוטיים ב vivo.פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר גנים של עניין בקווי תאים אחרים. בנוסף, נוקאאוט גנים הוא דרך נוספת למחקר תפקודי, והפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם למערכות הפלת הגנים. לכן, זה בדרך כלל ישים כדי להבהר פונקציות גנים.זכור להפיל את ממסר הווירוס לאשפה למכולות ספציפיות לסילוק בטיחות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Cell הזרקת הסרטן Intracarotid לייצר מודלי עכבר של המוח גרור

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

דור של סרטן הערמונית תאים מודלים של ההתנגדות דוסטקסול סוכן אנטי mitotic

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

רגישות רדיושל תאי גזע סרטן בסרטן ריאות תאים קווי

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...