Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

نعترف بموظفي الدعم في "مرفق خدمات أوكدنا"، وكذلك موظفي مرفق "رعاية الحيوان" في جامعة كالغاري. ونشكر ووركينتيني مات لدعمه المعلوماتية الحيوية وينس دوروثي لدعمه التقني. وكان هذا العمل ممول بمنحه استوفوا (جمهورية مقدونيا وج. ب.)، "جائزة المحقق استوفوا جديدة" إلى ج. ب.، والصحة بحوث المعهد زمالة (ج. س. الطفولة ألبرتا).

<ol>
	<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+for+cellular+variation.">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation.</a> Nature. 510, 363-369 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161, 1202-1214 (2015).</li><li>Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+single-cell+RNA-seq+analysis+landscape+with+the+scRNA-tools+database.">Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database.</a> bioRxiv:206573. , (2018).</li><li>Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+defines+heterogeneity+and+transcriptional+dynamics+in+the+adult+neural+stem+cell+lineage.">Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage.</a> Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).</li><li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+Reveals+a+Population+of+Dormant+Neural+Stem+Cells+that+Become+Activated+upon+Brain+Injury.">Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Schwann+Cells+from+Adult+Human+Skin+and+Nerve.">Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Agilent Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135">https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135</a> (2018)</li><li>Kolodziejczyk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+RNA-Sequencing+of+Pluripotent+States+Unlocks+Modular+Transcriptional+Variation.">Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation.</a> Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex.">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).</li><li>. Sequencing Requirements for Single Cell 3' Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3</a> (2018)</li><li>. Introduction to R Available from: <a target="_blank" href="https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r">https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Creating a Reference Package with cellranger mkref Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references</a> (2018)</li><li>. System Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements</a> (2018)</li><li>. Software Downloads Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</a> (2018)</li><li>. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization</a> (2018)</li><li>. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial</a> (2018)</li><li>. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data Available from: <a target="_blank" href="https://www.scrna-tools.org/">https://www.scrna-tools.org/</a> (2018)</li><li>. Downloading conda Available from: <a target="_blank" href="https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html">https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html</a> (2018)</li><li>. r / packages / r 3.5.1 Available from: <a target="_blank" href="https://anaconda.org/r/r">https://anaconda.org/r/r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. Seurat - Guided Clustering Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html">https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>Github. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).</li><li>. GenBank Submission Portal Wizards Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/</a> (2018)</li><li>. Submitting data Available from: <a target="_blank" href="https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/">https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/</a> (2018)</li><li>Shah, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+and+Fate+Mapping+of+Ependymal+Cells+Reveals+an+Absence+of+Neural+Stem+Cell+Function.">Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function.</a> Cell. 173, 1045-1057 (2018).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11, 1 (2013).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144, 3625-3632 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96, 313-329 (2017).</li><li>Zeigenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+states+versus+single-cell+atlases+-+two+classes+of+heterogeneity+that+differ+in+meaning+and+method.">Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method.</a> Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).</li><li>Herman, J. S., Sagar, D., Gr&#252;n, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FateID+infers+cell+fate+bias+in+multipotent+progenitors+from+single-cell+RNA-seq+data.">FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data.</a> Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).</li></ol>

لا توجد عمليات الكشف

هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن الكشف عن عدم تجانس النسخي الآلاف من الخلايا المفردة المناسبة إعداد الخلايا المفردة وتميز الدول الوظيفية أو هويات الخلوية فريدة داخل أنسجة. البروتوكول لا يتطلب البروتينات الفلورية مراسل أو الأدوات المعدلة وراثيا ويمكن تطبيقها على عزل الخلايا المفردة من أنسجة مختلفة من الاهتمام بما فيها من البشر؛ مع الأخذ في الاعتبار كل الأنسجة فريدة من نوعها وهذا البروتوكول سوف تتطلب قدرا من التكيف/التعديل.
وأكدت البرامج النسخي متنوعة وديناميكية للغاية داخل الخلايا قيمة الجينوميات خلية واحدة. وبصرف النظر عن عزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة، خطوة إعداد عينة حاسمة اللازمة لمجموعات بيانات عالية الجودة هو ضمان أن الخلايا تصدر تماما من الأنسجة وأن خلايا صحية وسليمة. هذا نسبيا على التوالي إلى الأمام لجمع الخلايا بسهولة إصدارها، مثل تعميم خلايا أو أنسجة خلايا فضفاضة استبقي فيها، مثلما حدث في الأنسجة اللمفاوية. ولكن هذا يمكن أن يكون تحديا للأنسجة الأخرى الكبار، بسبب البنية الخلوية متطورة جداً التي تمتد على مسافات كبيرة، المحيطة بالمصفوفة خارج الخلية وبروتينات cytoskeletal جامدة في كثير من الأحيان المشاركة في الحفاظ على هيكل الخلية. حتى مع تقنيات الانفصال المناسبة للإصدار الكامل من الخلايا، هناك إمكانية أن معالجة دقيقة وطويلة وكثيراً ما تتطلب أن يغير سلامة الجودة وخلية مرناً. وبالإضافة إلى ذلك، تؤثر درجات الحرارة العالية المستخدمة للانفصال بمساعدة إنزيم أيضا التوقيعات النسخي29،30. أن قصد البروتوكول تقديم مراقبة الجودة يتحقق، استخدام أنسجة مثل العصب الكبار ميليناتيد والجلد الكبار الغنية بالمصفوفة خارج الخلية، لإظهار كيف يمكن أن تساعد الأمثل للتغلب على هذه العقبات.
أحد الاعتبارات رئيسية عند تصميم أي تجربة Seq سرنا هو اختيار عمق التسلسل. يمكن جداً متعدد التسلسل وقراءة العمق يمكن أن تختلف من كونها منخفضة جداً باستخدام Seq قطره2 ليصل إلى 5 مليون خلية يقرأ/14 استخدام أسلوب تسلسل الحمض النووي الريبي كاملة طول مثل ما يليها الذكية يمكن اكتشاف معظم Seq سكرنا تجارب النصوص التعبير معتدلة إلى عالية مع تسلسل منخفضة قدر ما يلي 10,000/الخلية، وعادة ما تكون كافية للخلية نوع التصنيف41،42. عمق ضحل التسلسل القيمة لإنقاذ على تكاليف التسلسل عند محاولة الكشف عن خلية نادرة السكان عبر الأنسجة المعقدة حيث آلاف خلايا قد تكون مطلوبة لثقة تنسب نادرة السكان. ولكن تسلسل عمق ضحل لا يكفي عند معلومات مفصلة عن التعبير الجيني والعمليات المرتبطة بالتوقيعات النسخي خفية ضروري. ويقدر حاليا، أن يتم الكشف عن الغالبية العظمى من المورثات في خلية ما يلي 500,000/في الخلية، ولكن هذا يمكن أن تختلف تبعاً للبروتوكول والأنسجة اكتب43،44. تكاليف التسلسل بينما تعاقب نسخة كاملة الطول تلتف الحاجة إلى الجمعية، ويمكن، لذلك، الكشف عن رواية أو المتغيرات لصق نادرة، كثيرا ما تحد من توسيع نطاق هذا النهج لدراسة آلاف خلايا التي تتألف من نظام معقد من أنسجة. وفي المقابل، 3 ' معلم مكتبات خلية واحدة مثل تلك المبينة في هذا البروتوكول عادة أقل من التعقيد وتتطلب تسلسل ضحالة. من المهم أن نلاحظ أن المكتبات التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكول وصف يمكن أن تكون متسلسلة على واحد من خمسة التعاقب معتمدة: 1) نوفاسيق, 2) هيسيق 3000/4000، 2500 3) هيسيق التشغيل السريع وإخراج عالي، 4) نيكستسيق 500/550 و 5) مسك.
نهج بديل لخلية مفردة الجيش الملكي النيبالي-Seq، أن يقلل من الحاجة إلى الأنسجة الحساسة وخلية معالجة بعد يحافظ على بعض فوائد خلية مفردة تسلسل الحمض النووي الريبي، وإجراء تحليل للحمض النووي الريبي من نواة واحدة45. هذا النهج يسمح أكثر سرعة معالجة الحد من تدهور الجيش الملكي النيبالي، والمزيد من الإجراءات المتطرفة لضمان الإفراج كافية من نوى، والمرجح أن يسمح بالتالي لالتقاط أكثر ثقة من الملامح النسخي يمثلون كافة الخلايا داخل نسيج معين. وبطبيعة الحال، وهذا سيوفر فقط جزء من النشاط الترانسكربتي موجودة داخل خلية معينة، وبالتالي اعتماداً على ما أهداف تجريبية لفائدة هذا النهج قد أو قد لا يكون مناسباً.
بالإضافة إلى توصيف كامل للهويات الخلوية داخل نسيج معين، واحدة من التحليلات الأكثر قيمة لمجموعات البيانات سكرنا Seq هو أنصبة الدول النسخي المتوسطة عبر السكان خلية 'المعرفة'. يمكن نقل هذه الدول الوسيطة ثاقبة علاقات النسب بين الخلايا داخل السكان التي تم تحديدها، والتي لم يكن من الممكن مع الجملة التقليدية نهج تسلسل الحمض النووي الريبي. الآن وضعت عدة أدوات bioinformatic Seq سرنا لتوضيح هذا. يمكن تقييم هذه الأدوات في عمليات المشاركة في، على سبيل المثال، الخلايا السرطانية الانتقال إلى حالة النمطان/المنتشر، الخلايا الجذعية الناضجة في مصائر المحطة الطرفية المتنوعة أو الخلايا المناعية يتنقلون بين الدول النشطة وهادئة. قد تكون الخلافات الترنسكربيتوم خفية في الخلايا أيضا يدل على التحيزات القائمة على النسب، أدوات bioinformatic وضعت مؤخرا مثل فاتيد، يمكن الاستدلال47. نظراً للفروق بين الانتقال من الخلايا يمكن أن يكون صعباً للتأكد من نظراً للاختلافات النسخي قد تكون خفية، تسلسل أعمق قد يكون ضروريا46. لحسن الحظ، يمكن زيادة التغطية لمكتبة شالوولي التسلسل إذا كان مهتما بسبر dataset المزيد عن طريق إعادة تشغيل المكتبة في آخر تدفق الخلية.
أخذت معا، يوفر هذا البروتوكول سهلة للتكيف مع سير عمل التي تمكن المستخدمين من ترانسكريبتيونالي الشخصية مئات آلاف خلايا مفردة ضمن تجربة واحدة. الجودة النهائية من dataset Seq سرنا يعتمد على التدفق الخلوي وكدنا مكتبة الجيل، عزل الخلية الأمثل وتفسير لمصفوفات الباركود الجين الخام. وتحقيقا لهذه الغاية، يوفر هذا البروتوكول استعراضاً شاملا لجميع الخطوات الرئيسية التي يمكن تعديلها بسهولة لتمكين الدراسات أنواع الأنسجة المتنوعة.

مع تطور الإنتاجية العالية التكنولوجيا خلية مفردة1،2 والتقدم في أدوات سهلة الاستعمال المعلوماتية الحيوية على مدى العقد الماضي3، برز حقل جديد لتحليل التعبير الجيني عالية الدقة – خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي (سرنا-Seq). ووضعت دراسة التعبير الجيني خلية مفردة أولاً لتحديد عدم التجانس داخل خلية محددة بالسكان، كما هو الحال في الخلايا الجذعية أو الخلايا السرطانية، أو لتحديد السكان نادرة من الخلايا4،5، الذي قد لا يمكن تحقيقه باستخدام تقنيات تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة التقليدية. ومكنت الأدوات بيوينفورماتيك تحديد هوية السكان الفرعية رواية (سورا)2، التصور وسام الخلايا على طول بسويدوتيمي الفضاء (مونوكل)6، تعريف الشبكات إشارات نشطة داخل أو بين السكان ( المناظر الطبيعية الخلابة)7، والتنبؤ بجمعية خلايا مفردة في مساحة ثلاثية الأبعاد اصطناعية (سورا، وأكثر)8. مع هذه التحليلات الجديدة والمثيرة المتاحة للمجتمع العلمي، سرنا Seq سريعة-أصبح نهج قياسية جديدة لتحليل التعبير الجيني.
على الرغم من الإمكانات الهائلة ل Seq سرنا، skillsets التقنية المطلوبة لإنتاج مجموعة بيانات نظيفة وتفسير النتائج بدقة يمكن أن يكون تحديا للقادمين الجدد. هنا، بدءاً من عزل الخلايا المفردة من الأنسجة الابتدائية كاملة للتصور وعرض البيانات للنشر يقدم بروتوكول أساسي، ولكنه شامل، (الشكل 1). أولاً، عزل الخلايا المفردة صحية يمكن أن يعتبر تحديا، كما أنسجة مختلفة تتفاوت في درجة حساسية الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكية اللاحقة. هذا البروتوكول يوفر الإرشاد في هذه الخطوات العزلة، ويحدد نقاط التفتيش مهمة مراقبة الجودة في جميع مراحل العملية. وثانيا، فهم التوافق ومتطلبات بين تكنولوجيا خلية مفردة وتسلسل الجيل القادم يمكن أن يكون مربكاً. هذا البروتوكول يوفر مبادئ توجيهية لتنفيذ منصة المتوازية خلية واحدة سهلة الاستخدام المستندة إلى الحبرية، وإجراء تسلسل. وأخيراً، برمجة الحاسوب شرطا أساسيا هاما لتحليل مجموعات البيانات ترانسكريبتوميك خلية واحدة. هذا البروتوكول يوفر الموارد للشروع في العمل مع لغة البرمجة R، ويقدم توجيهات بشأن تنفيذ مجموعتي R سرنا Seq-الخاصة بشعبية. معا، هذا البروتوكول يمكن توجيه الوافدين الجدد في أداء تحليل Seq سرنا للحصول على نتائج واضحة، والتفسير. هذا البروتوكول يمكن أن يتكيف مع معظم الأنسجة في الماوس، والأهم من ذلك يمكن تعديلها للاستخدام مع الكائنات الأخرى، بما في ذلك الأنسجة البشرية. وسوف يلزم إدخال تعديلات اعتماداً على الأنسجة والمستخدم.
وهناك عدة اعتبارات يجب وضعها في الاعتبار حين عقب هذا البروتوكول؛ 1) بعد جميع المبادئ التوجيهية لمراقبة الجودة في الخطوات 1 و 2 من هذا البروتوكول يوصي بما في ذلك، لضمان تعليق خلية واحدة فقط قابلة للتطبيق لكافة الخلايا داخل عينة مصلحة مع ضمان دقيقة خلية الإجمالي عدد من التهم الموجهة إليه (الملخصة في رقم 2 ). حالما يتحقق ذلك، وإذا ما اتبعت جميع الشروط الأمثل، يمكن أن يكون إسقاط خطوات مراقبة الجودة (لتوفير الوقت--الحفاظ على جودة الجيش الملكي النيبالي، والحد من خلية الخسارة). تؤكد عزلة ناجحة من استمرارية ارتفاع الخلايا المفردة من الأنسجة لمصلحة هو الغاية يوصي قبل أي المصب تجهيز. 2) تقنيات تفارق المفرطة دون قصد نظراً لبعض أنواع الخلايا أكثر حساسية من غيرها التأكيد، يمكن أن التحيز السكان، ولذلك الخلط تحليل المتلقين للمعلومات. الانفصال لطيف دون قص الخلوية لا لزوم لها والهضم أمر بالغ الأهمية لتحقيق ارتفاع غلة الخلوية وتمثيل دقيق لتكوين الأنسجة. قوي القص تحدث خلال الخطوات تريتوريشن، ونظام مراقبة الأصول الميدانية، واستثارة. 3) كما مع أي عمل الجيش الملكي النيبالي، من الأفضل أن إدخال رناسي إضافية صغيرة في العينة قدر الإمكان أثناء الإعداد. وهذا سيساعد في الحفاظ على الحمض النووي الريبي عالية الجودة. استخدام حلول المانع ribonuclease مع الشطف بأدوات نظيفة وأي معدات غير خالية من رناسي ولكن تجنب المنتجات المعالجة ديبك. 4) أداء الأعمال التحضيرية، في أسرع وقت ممكن. وهذا سيساعد على الحفاظ على الحمض النووي الريبي عالية الجودة، والحد من موت الخلايا. اعتماداً على طول تشريح الأنسجة وعدد الحيوانات، النظر في بدء تشريح/استعدادات متعددة في نفس الوقت. 5) إعداد الخلايا على الجليد عند الخلية من الممكن الحفاظ على الحمض النووي الريبي عالية الجودة، والحد من موت الخلايا، وبطء النشاط إرسال الإشارات والنسخي. بعض أنواع الخلايا (مثلاً، العَدلات) أن كان تجهيز المثلج المثل الأعلى لمعظم أنواع الخلايا، أداء أفضل عند معالجة في درجة حرارة الغرفة. 6) تجنب الكالسيوم والمغنيسيوم، يدتا والمنتجات المعالجة ديبك أثناء إعداد الخلية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

تحليل التعبير الجيني خلية مفردة عبر آلاف خلايا الفردية داخل الأنسجة أو المكروية أداة قيمة لتحديد تكوين الخلية، والتمييز الدول الوظيفية، والمسارات الجزيئية الكامنة وراء الأنسجة الملاحظة وظائف والسلوك الحيواني. ومع ذلك، يمكن أن يكون تحديا عزل الخلايا المفردة سليمة وصحية من أنسجة الثدييات الكبار للتحليل الجزيئي خلية مفردة المصب اللاحقة. هذا البروتوكول يصف العمليات العامة ومراقبة جودة التدقيق اللازم للحصول على الأعمال التحضيرية خلية مفردة الكبار عالية الجودة من على الجهاز العصبي أو الجلد التي تم تمكين تسلسل خلية مفردة غير متحيزة اللاحقة الجيش الملكي النيبالي والتحليل. كما يتم توفير مبادئ توجيهية لتحليل bioinformatic المتلقين للمعلومات.

مرجع حزم مفتوحة المصدر مصممة لتحليل مجموعات البيانات Seq سرنا ازداد كبيرة40 مع غالبية هذه استخدام حزم اللغات المستندة إلى ص3. هنا، يتم عرض نتائج تمثيلية باستخدام اثنين من هذه الطرود: تقييم التجميع دون إشراف من واحد الخلايا استناداً إلى التعبير الجيني، ويأمر الخلايا المفردة على طول مسار من أجل حل الخلية التغايرية وتفكيك البيولوجية العمليات.
ويبين الشكل 4 استخدام سورا لتجهيز ما قبل عمليات التحقق من النوعية وتحليل المعلوماتية المتلقين للمعلومات. أولاً، الترشيح وإزالة الخلايا المنحرف من التحليل ضروري للتحقق من الجودة. وقد تم ذلك باستخدام الكمان (الشكل 4a) ومبعثر مؤامرات (الشكل 4 باء) تصور النسبة المئوية لجينات الميتوكوندريا وعدد الجينات (نجني) وعدد من أومي (نومي) لتحديد الخلية دوبليتس والقيم المتطرفة. تمت إزالة أي خلية مع عدد واضح الخارجة من الجينات، أومي، أو النسبة المئوية من جينات الميتوكوندريا باستخدام الدالة فيلتيرسيلس لسورا. منذ سورا يستخدم المكون الرئيسي (PC) من عشرات التحليل لخلايا المجموعات وتحديد أجهزة الكمبيوتر ذات دلالة إحصائية تشمل خطوة حاسمة. واستخدمت قطع الكوع (الشكل 4 ج) لاختيار جهاز كمبيوتر، استبعدت في أجهزة الكمبيوتر التي وراء الهضبة 'الانحراف المعياري للكمبيوتر' المحور. قرار التكتل أيضا التلاعب بها مما يدل على أنه يمكن تغيير عدد الكتل، تتراوح بين 0.4 (دقة منخفضة مما يؤدي إلى مجموعات خلية أقل، الرقم 4 د) إلى 4 (دقة عالية مما أدى إلى أعلى الخلية مجموعات، 4e الشكل ). بدقة منخفضة، فمن المحتمل أن يمثل كل مجموعة نوع خلية محددة، بينما بدقة عالية وهذا قد يمثل أيضا الأنواع الفرعية أو الدول الانتقالية لمحتوى الخلية. في هذه الحالة، استخدمت إعدادات المجموعة منخفضة الدقة لمواصلة تحليل التعبير heatmaps (باستخدام الدالة دوهيتماب لسورا) لتحديد الجينات الأكثر شدة المعرب عنها في مجموعة معينة (الشكل 4f). وفي هذه الحالة، حددت الجينات الأكثر شدة أعرب تقييم التعبير التفاضلية في مجموعة معينة مقابل المجموعات الأخرى جنبا إلى جنب، مما يدل على أن كل مجموعة مثلت فريد بجينات محددة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تصور الجينات المرشحة الفردية في مؤامرات تسن استخدام الدالة فيتوريبلوت لسورا (الشكل 4 ز). وهذا يسمح لفك رموز عما إذا كانت هناك مجموعات تمثل الضامة. باستخدام فيتوريبلوت، وجدنا أن كل المجموعة 2 وتم الإعراب عن 4 Cd68-علامة عموم بلعم.
حزمة مونوكل تم استخدامه لمساندة مجموعات الخلية المحددة في سورا، وبناء مسارات الخلية، أو يأمر بسيودوتيمبورال، بإيجاز العمليات البيولوجية (الشكل 5). يمكن استخدام الأمر بسيودوتيمبورال لعينات حيث من المتوقع ملامح التعبير خلية واحدة لمتابعة دورة الساعة بيولوجية. الخلايا يمكن أن يؤمر على طول سلسلة متصلة بسيودوتيمبورال لحل الدول المتوسطة، نقاط التشعب اثنين خلية البديلة الأقدار، والتعرف على التواقيع الجينات الكامنة وراء اقتناء كل مصير. أولاً، على غرار الترشيح لسورا، وأزيلت الخلايا ذات النوعية الرديئة أن كان توزيع مرناً عبر جميع خلايا السجل العادي وسقطت بين حدود العلوية والسفلية كما تم تحديدها في الشكل 5a. ثم، باستخدام الدالة نيوسيلتيبهيراركهي في مونوكل، صنفت الخلايا المفردة وتحسب باستخدام الجينات علامة النسب المعروفة (الشكل 5b، ج 5). على سبيل المثال، عين نوع الخلية #1 الخلايا معربا عن PDGF مستقبلات ألفا أو تنتجها الخلايا الليفية المحددة البروتين 1 لإنشاء معيار لتحديد الخلايا الليفية. بعد ذلك، تم تقييم هذه الفئة من السكان (خلية نوع #1) فك المسارات تنتجها الخلايا الليفية. للقيام بذلك، استخدم الدالة جينيتيست التفاضلية في مونوكل، الذي مقارنة الخلايا تمثل الدول المتطرفة داخل السكان والعثور على جينات التفاضلية لترتيب الخلايا المتبقية في السكان (الشكل 5 د). عن طريق تطبيق أساليب التعلم المتعددة (وهو نوع من الحد من أبعاد غير الخطية) عبر كافة الخلايا، كلف تنسيق على طول مسار بسيودوتيمبورال. تم تصور هذا المسار ثم بالدولة الخلية (الشكل 5e) وبسيودوتيمي (5f الشكل).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> رقم 1: الرسم البياني- الخطوات من إعداد الحيوانات كاملة لتحليل واحد الخلية مجموعات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي لتقديم مجموعات البيانات النهائية لمستودع متاحة للجمهور. هلام الخرز في شكل مستحلب (GEMs) تشير إلى الخرز مع النوكليوتيد المراقب التي تغلف آلاف خلايا المفردة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> رقم 2: إنشاء تعليق خلية واحدة فقط قابلة للاستمرار من أنسجة العصب. (أ) نظرة عامة على الرسوم متحركة لمراقبة الجودة بالتحقق. لا يزال إدراج الخلايا (ب) والحطام مع الخلايا في الحطام (الأسهم الحمراء). (ج) الخلايا صدر من الحطام (الأسهم الحمراء). (د) خلية العزل بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية. P0: كسر الحطام; P1: خلية مثل الكسر؛ P3: استبعاد duplets؛ P4: صلاحية صبغ (سيتوكس البرتقالي) كسر السلبية. (ﻫ) أي سيطرة صبغ البقاء. (و) الصورة لكسر P0 يمثل الحطام معزولة. (ز) صورة لكسر P4 يمثل خلايا قابلة للحياة المعزولة (الأسهم الحمراء). (ب) (ج) (و (و (ز) وقد صبغ النووية إضافة 20 دقيقة قبل التصوير. أشرطة الحجم: 80 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> الشكل 3: تسلسل الضحلة تتوقع عدد الخلايا المستردة في 10 × العينات المجهزة. (أ) مثال (العينة 1.6) csv الذي تم إنشاؤه ميسيق إدراج الرموز الشريطية الخلية ولها أومي المقابلة التهم كما يحددها ثقة المعينة ما يلي:. (ب) ارسم الرمز الشريطي رتبة للعينة 1.6 يظهر قطره كبيرة واحدة في العد أومي كدالة للخلية الرموز الشريطية. وتمثل الخطوط المتقطعة والصلبة قطع بين الخلايا والخلفية كما يحدده الفحص البصري. (ج) خلية الرموز الشريطية لاحظ استخدام "الحارس الخلية" خط أنابيب آخر-هيسيق يكشف تسلسل الضحلة دقة تقريب عدد الخلايا للعينة 1.6. (د) مثال لهيكل الخلية تدفق استناداً إلى تسلسل الضحلة اشتقاق تقديرات الخلية. للعينة 1.6، نظراً لتوقع تسلسل الضحلة الخلايا 3480، تم تعيين ممرات 1.17 لضمان > 100,000 يقرأ كل خلية تتابع التغطية في هيسيق. ملاحظة: يجب إضافة جميع الممرات إلى 100%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> الشكل 4: مراقبة الجودة والمعلوماتية الحيوية من خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي dataset باستخدام حزمة "آر سورا". (أ) قطع مقاييس الجودة التي تشمل عدد الجينات وعدد معرفات فريدة الجزيئية (أميس)، والنسبة المئوية للنصوص رسم خرائط الجينوم المتقدرية. (ب) الجينات عينة يرسم الكشف عن الخلايا مع مستويات المنحرف المستنسخات mitochondrial واميس. (ج) عينة الكوع الأرض المستخدمة لتحديد المخصص لأجهزة الكمبيوتر ذات دلالة إحصائية. وتمثل الخطوط المتقطعة ومتقطع دوت قطع حيث يصبح واضحا "كوع" الظاهر في الرسم البياني. يتم تضمين الأبعاد PC قبل هذا الكوع في تحليل المتلقين للمعلومات. (د، ه) الخلية على أساس الرسم البياني الكتل تصور في قرارين المختلفة في مساحة منخفضة ثلاثي الأبعاد باستخدام قطعة تسنى. (و (أعلى علامة الجينات (أصفر) لكل مجموعة تصور في heatmap تعبير استخدام الدالة دوهيتماب لسورا. (ز) وضع تصور لها علامة التعبير عن، على سبيل المثال، Cd68 الجينات تمثل الضامة (الأرجواني) باستخدام الدالة فيتوريبلوت لسورا. وهذا يوحي بأن الكتلة 2 و 4 (في لوحة d) من dataset هذه تمثل الضامة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> الرقم 5: الخلية تصنيف وترتيب على طول مسار بيودوتيمبورال باستخدام أدوات مونوكل. (أ) تفتيش توزيع مرناً (الاستدلال من التهم أومي) عبر كافة الخلايا في عينة. فقط الخلايا مع مرناً بين 0-~ 20,000 كانت تستخدم لتحليل المتلقين للمعلومات. (ب، ج) تعيين والعد أنواع الخلايا استناداً إلى علامات خلية النسب المعروفة. على سبيل المثال، خصصت الخلايا معربا عن PDGF مستقبلات ألفا أو تنتجها الخلايا الليفية المحددة البروتين 1 خلية نوع # 1 تمثل عموم الليفية باستخدام الدالة نيوسيلتيبهيراركهي في مونوكل. يمكن تصور عدد من أنواع مختلفة من الخلايا كمخطط دائري (ب) وجدول (ج). (د) استخدام الخلية نوع #1 (الليفية) على سبيل مثال، الجينات المستخدمة لترتيب الخلايا يمكن تصور استخدام مؤامرة مبعثر الذي يوضح التشتت الجينات مقابل التعبير يعني. ويبين المنحنى الأحمر قطع للجينات المستخدمة لترتيب محسوب بالطراز يعني الفرق باستخدام الدالة استيماتيديسبيرسيونس في مونوكل. واستخدمت الجينات التي تفي بهذا قطع لترتيب بسيودوتيمي المتلقين للمعلومات. (ه، و) التصور لمسارات الخلية في الفضاء ثنائي الأبعاد تقليص الملونة "الدولة للخلية" (ه)، وتعيين مونوكل "بسيودوتيمي" (و). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

هذا البروتوكول يصف العمليات العامة ومراقبة الجودة الشيكات اللازمة لإعداد الخلايا المفردة الثدييات الكبار صحية التحضيرات تسلسل الحمض النووي الريبي في خلية مفردة المستندة إلى الحبرية، وارتفاع الإنتاجية. ترتيب المعلمات، محاذاة قراءة وتحليل المصب خلية واحدة bioinformatic تتوفر أيضا.

ترانسكريبتوميكس خلية واحدة على أساس المتوازية الحبرية من أنسجة الثدييات الكبار

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة، مثل فهم التغيرات في التعبير الجيني عبر آلاف الخلايا الفردية بعد الإصابة أو المرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتشريح نسخ الخلايا الفردية داخل نسيج معقد ، وتقدير الديناميكيات الوظيفية بشكل أفضل داخل مجموعة سكانية معينة. وميزة بروتوكولنا هو أنه يوفر أساليب شاملة، من عزل الخلايا الفردية في الأنسجة الأولية، إلى تحليل وتصور مجموعة البيانات هذه.على الرغم من أن هذه الطريقة تبدأ من التعليقات أحادية الخلية من الجلد والعصب، يمكن تطبيق أساليب التسلسل التي وصفناها لدراسة أي أنسجة الثدييات. إثبات هذا الإجراء سيكون (إلودي لابيت) و(ويسو شين) متدربان من مختبري للبدء ، تشريح العصب الوركي من الماوس القتل الرحيم عن طريق قطع الجلد أولا بعيدا عن المنطقة الخلفية من الجزء الخلفي من الماوس.استخدم شفرة مشرط معقمة لعمل شق على طول الفخذ. ثم استخدام ملقط غرامة ومقص لفضح وإزالة العصب الوركي. لتشريح الجلد الظهري، استخدم ملقط ومقصات دقيقة لعمل شقوق من كتف إلى كتف، عبر الردف، وإلى أسفل الظهر.غسل الأنسجة مرتين مع الجليد الباردة HBSS. تحت المجهر تشريح، وإزالة النسيج الضام غير المرغوب فيها، ورواسب الدهون، أو الحطام. للجلد فقط، وقطع الجلد إلى شرائح رقيقة، وذلك باستخدام شفرة مشرط معقمة.للحصول على أدمة الجلد، تعويم شرائح الجلد في dispase، في HBSS في طبق 10 سم، لمدة 30 إلى 40 دقيقة في 37 درجة مئوية. استخدم ملقط ناعم لتقشير البشرة وفصلها عن الأدمة، ثم تخلص من البشرة. ثم، للجلد والأعصاب، واستخدام زوج من شفرات مشرط معقم ل mince كل عينة في قطعة ملليمتر واحد إلى اثنين.ضع قطع الأنسجة في ذوبان حديث ، غرامين لكل ملليلتر كولكولاجيناز -أربعة إنزيم بارد في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. احتضان كل عينة في الإنزيم في حمام 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف كل 10 دقائق. في 30 دقيقة، واستخدام أنبوب P1000 ل triturate الأنسجة 20 إلى 30 مرة، والعودة إلى حمام الماء.كرر التثاثر كل 30 دقيقة حتى يبدو المحلول غائمًا ، ويتم فصل قطع الأنسجة إلى حد كبير. للبشرة فقط، في الساعة الأخيرة من الحضانة، إضافة ملليغرام واحد لكل ملليلتر DNAse إلى عينة الجلد. منذ بعض أنواع الخلايا هي أكثر حساسية من غيرها للإجهاد الميكانيكية، وتقنيات التحلل المفرط يمكن التحيز السكان الخاص بك.إن الانفصام العام أمر بالغ الأهمية لتحقيق غلة الخلايا العالية، والتمثيل الدقيق لتكوين الأنسجة. بعد ذلك، استخدم فلتر 40 ميكرومتر على رأس أنبوب مخروطي 50 ملليلتر لتصفية كل عينة الأنسجة مرتين. شطف المرشح مع واحد في المئة BSA / HBSS.بعد الطرد المركزي للعينات كما هو موضح في المخطوطة، إعادة تعليق بيليه الخلية في HBSS، التي تحتوي على واحد في المئة BSA، وذلك باستخدام طرف واسعة تتحمل، ووضع على الجليد. إضافة صبغة القدرة على البقاء سوف تساعدك على تحسين إعداد الخاص بك. يجب أن تهدف إلى خلايا قابلة للحياة بنسبة 80 في المائة على الأقل.مرة واحدة الأمثل، يمكن حذف هذا وغيرها من خطوات مراقبة الجودة من أجل تعجيل عملية الانفصال، والتي سوف تحافظ على جودة الحمض النووي الريبي بشكل أفضل والحد من فقدان الخلايا. لعزل الخلايا القابلة للحياة وصحية باستخدام FACS، أولا إعداد 15 ملليلتر أنابيب ضيقة القاع مع ثمانية ملليلتر من الجليد الباردة واحد في المئة BSA / HBSS لمجموعات العينات. لضمان أن الواجهة بين سطح السائل وداخل الأنبوب رطبة ، ولمنع التوتر الساكن والسطحي ، عكس الأنابيب قبل المجموعات.مباشرة بعد فرز الخلايا FACS، مرة واحدة يتم جمع الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر، استخدام ملليلتر واحد من واحد في المئة BSA / HBSS لغسل ودفع جميع الخلايا إلى أسفل من السطح الجانبي للأنبوب. ثم الطرد المركزي كل عينة في 260 غرام لمدة ثماني دقائق. بعد التخلص من المابير، إعادة تعليق بيليه الخلية في واحد في المئة BSA / HBSS، وإضافة 33.8 ميكرولترات إلى أنبوب، والحفاظ على هذا الأنبوب على الجليد.تم تصميم هذه الخطوة ليتم القيام به باستخدام الكواشف التي تم الحصول عليها من مجموعة موحدة. يجب تنفيذ كافة الخطوات التي تم عرضها باتباع إرشادات الشركة المصنعة. للتحضير لجيل GEM ، ضع رقاقة في حامل الشريحة ، وإعداد مزيج رئيسي الخلية على الجليد ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.إضافة 56.2 ميكرولترات من المزيج الرئيسي إلى أنبوب يحتوي على 33.8 ميكرولترات من التعليق الذاتي. لإعداد رقاقة، أولا في 50 في المئة الجلسرين إلى الآبار التي لن تستخدم. ثم إضافة 90 microliters من مزيج سيد الخلية إلى حد ما واحد، 40 microliters من حبات هلام إلى اثنين جيدا، و 270 microliters من النفط تقسيم إلى ثلاثة جيدا.غطي الرقاقة بـ حشية لتحميل الرقاقة وتشغيلها في وحدة تحكم ذات خلية واحدة، قم أولاً بإخراج الدرج. ضع الرقاقة في الدرج.اسحب الدرج، واضغط على تشغيل. بعد المدى الكامل، وجمع 100 ميكرولترات من العينة، ووضعها في أنبوب PCR. ضع أنابيب PCR في جهاز PCR مسبقًا ، وركض وفقًا للطقم.بعد المدى، سوف تشمل GEMs كامل الطول، cDNA الباركود، من الحمض النووي الريبي متعدد الدنا. ضع الأنابيب عند درجة حرارة 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تابع عملية إنشاء المكتبة وتسلسلها ومحاذاتها وتحليلها.وبمجرد أن يتم ترتيب العينات وتواؤمها كما هو موضح في المخطوطة، قم بإيداع البيانات في مستودع عام، مثل توقعات البيئة العالمية لـ NCBI. للقيام بذلك، قم بالتسجيل لحساب مقدم. أولاً، أكمل تقديم تقرير توقعات البيئة العالمية عن طريق تنزيل ورقة البيانات الوصفية.تأكد من تضمين ورقة بيانات تعريف واحدة فقط لكل مشروع إرسال. ضع جدول البيانات في الدليل. ثانياً، إضافة ملف البيانات الخام التي تم إنشاؤها من البرنامج النصي عدد الحارس الخلية لكافة المكتبات في الدليل.المجلد الثالث هو ملفات البيانات التي تمت معالجتها. وضع ملفات البيانات المعالجة التي تم إنشاؤها من برنامج نصي عدد خلية الحارس لكافة المكتبات في الدليل. استخدام بيانات اعتماد خادم FTP الخاص بـ GEO الخاص بـ GEO لنقل الدليل الذي يحتوي على كافة المكونات الثلاثة.بعد تشغيل الخلية الحارس، يمكن معالجة المصفوفات الباركود الجينات جاهزة التحليل باستخدام المعلوماتية الحيوية المتقدمة. أولاً، تم إجراء عمليات فحص كمية ما قبل المعالجة باستخدام حزمة Seurat R، التي ولدت قطع الكمان والمبعثرة لتصور عدد الجينات، وعدد المعرفات الجزيئية الفريدة، والنسبة المئوية للجينات الميتوكوندريا لتحديد مزدوجة الخلايا و القيم المتطرفة. لاختيار المكونات الرئيسية، أو أجهزة الكمبيوتر، تم استخدام مخططات الكوع، التي تم استبعاد أجهزة الكمبيوتر خارج هضبة الانحراف المعياري لمحور الكمبيوتر.كما تم التلاعب بحل التكتلات. أدى دقة منخفضة إلى عدد أقل من مجموعات الخلايا، مع كل كتلة تمثل على الأرجح نوع خلية معرّفة. أدى الدقة العالية إلى احتمال أعلى للخلية، تمثل الأنواع الفرعية، أو الحالات الانتقالية، من مجموعة الخلايا.واستُخدمت إعدادات الكتلة ذات الدقة المنخفضة لإجراء مزيد من التحليل للخرائط الحرارية للتعبير لتحديد الجينات الأكثر تعبيراً عنها في مجموعة معينة. تم تصور الجينات المرشحة الفردية على المؤامرات tSNE ، وذلك باستخدام وظيفة مؤامرة ميزة سورات ، التي سمحت فك ، ما إذا كانت هناك مجموعات التي تمثل ، على سبيل المثال ، الضامة. وأعرب كل من الكتلة الثانية وأربعة CD68، علامة عموم الضامة.كما توفر حزم أخرى أدوات لمراقبة الجودة، على سبيل المثال، Monocle، وهي حزمة R تستخدم لبناء مسارات الخلايا، وتزيل الخلايا ذات النوعية الرديئة، وتضمن أن توزيع مرنا عبر جميع الخلايا طبيعي، وسقط بين الحدود العليا والسفلى. ثم تم تصنيف الخلايا الفردية وإحصاءها، باستخدام جينات علامات النسب المعروفة، وتم تعيين الخلايا التي تعبر عن علامات الاهتمام إلى نوع الخلية رقم واحد. تم تحديد أن نوع الخلية رقم واحد كانت الخلايا الليفية.تم تقييم هذه الفئة من السكان لبناء المسار التنموي للخلايا الليفية. بعد هذا الإجراء، وينبغي تنفيذ أساليب أخرى مثل PCR الكمية، والتهجين في الموقع، والكيمياء immunist للتحقق من صحة نتائج التعبير الجيني الخاص بك. وقد مهد تسلسل مرنا أحادي الخلية الآن الطريق للباحثين في العديد من المجالات المختلفة لاستكشاف عدم التجانس من خلية إلى خلية ، وتحديد الديناميات الوظيفية داخل الأنسجة المختلفة أثناء التوازن ، وكيف يمكن أن تتغير هذه بعد الإصابة أو في تطور المرض.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranuclear Microinjection من الحمض النووي في الخلايا العصبية فصل الثدييات الكبار

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

تشريح هيئات من اسماك الزرد الكبار

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

التنميط واحدة من الخلايا العضلية الترانسكربتي ماوس الكبار

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

كفاءة الثدييات التعبير خلية وخطوة واحدة خارج الخلية تنقية البروتينات السكرية لبلورة

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

نمو اللاهوائية وصيانة خطوط خلايا الثدييات

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 يثري العائد من الخلايا الصباغية البشرية من أنسجة الجلد الكبار

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

واحد Myofiber الثقافة المقايسة لتقييم وظائف الخلايا الجذعية العضلات الكبار Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...