Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Vi anerkender personalet på UCDNA tjenester facilitet, samt dyrs pleje facilitet personalet på University of Calgary. Vi takke Matt Workentine for hans støtte i bioinformatik og Jens Durruthy for hans teknisk support. Dette arbejde blev finansieret af et CIHR tilskud (R.M. og JB), en CIHR nye Investigator Award til J.B. og en Alberta børns sundhed Research Institute Fellowship (js).

<ol>
	<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+for+cellular+variation.">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation.</a> Nature. 510, 363-369 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161, 1202-1214 (2015).</li><li>Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+single-cell+RNA-seq+analysis+landscape+with+the+scRNA-tools+database.">Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database.</a> bioRxiv:206573. , (2018).</li><li>Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+defines+heterogeneity+and+transcriptional+dynamics+in+the+adult+neural+stem+cell+lineage.">Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage.</a> Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).</li><li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+Reveals+a+Population+of+Dormant+Neural+Stem+Cells+that+Become+Activated+upon+Brain+Injury.">Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Schwann+Cells+from+Adult+Human+Skin+and+Nerve.">Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Agilent Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135">https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135</a> (2018)</li><li>Kolodziejczyk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+RNA-Sequencing+of+Pluripotent+States+Unlocks+Modular+Transcriptional+Variation.">Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation.</a> Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex.">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).</li><li>. Sequencing Requirements for Single Cell 3' Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3</a> (2018)</li><li>. Introduction to R Available from: <a target="_blank" href="https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r">https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Creating a Reference Package with cellranger mkref Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references</a> (2018)</li><li>. System Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements</a> (2018)</li><li>. Software Downloads Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</a> (2018)</li><li>. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization</a> (2018)</li><li>. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial</a> (2018)</li><li>. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data Available from: <a target="_blank" href="https://www.scrna-tools.org/">https://www.scrna-tools.org/</a> (2018)</li><li>. Downloading conda Available from: <a target="_blank" href="https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html">https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html</a> (2018)</li><li>. r / packages / r 3.5.1 Available from: <a target="_blank" href="https://anaconda.org/r/r">https://anaconda.org/r/r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. Seurat - Guided Clustering Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html">https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>Github. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).</li><li>. GenBank Submission Portal Wizards Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/</a> (2018)</li><li>. Submitting data Available from: <a target="_blank" href="https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/">https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/</a> (2018)</li><li>Shah, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+and+Fate+Mapping+of+Ependymal+Cells+Reveals+an+Absence+of+Neural+Stem+Cell+Function.">Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function.</a> Cell. 173, 1045-1057 (2018).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11, 1 (2013).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144, 3625-3632 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96, 313-329 (2017).</li><li>Zeigenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+states+versus+single-cell+atlases+-+two+classes+of+heterogeneity+that+differ+in+meaning+and+method.">Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method.</a> Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).</li><li>Herman, J. S., Sagar, D., Gr&#252;n, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FateID+infers+cell+fate+bias+in+multipotent+progenitors+from+single-cell+RNA-seq+data.">FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data.</a> Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).</li></ol>

Ingen oplysninger

Denne protokol viser hvordan den passende forberedelse af enkelt celler kan afdække den transcriptional heterogenitet af tusindvis af enkelt celler og diskriminere funktionel stater eller unikke cellulære identiteter i et væv. Protokollen kræver ikke fluorescerende reporter proteiner eller transgene værktøjer og kan anvendes til isolering af enkelt celler fra forskellige væv af interesse herunder fra mennesker; holde i sindet hver væv er unikke og denne protokol vil kræve en vis grad af tilpasning/ændring.
De forskelligartede og yderst dynamisk transcriptional programmer inden for celler har fremhævet værdien af encellede genomforskning. Bortset fra isolere høj kvalitet RNA, en kritisk prøve præparationstrin nødvendige for høj kvalitet datasæt er at sikre at cellerne frigives helt fra væv og celler er sund og intakt. Dette er forholdsvis ligetil for indsamling celler, der er let løst, såsom cirkulerende celler eller væv celler bevares hvor løst, såsom i lymfoide væv. Men det kan være udfordrende for andre voksent væv, på grund af den højt udviklede cellulære arkitektur der strækker sig over store afstande, omkring ekstracellulære matrix og ofte stive cytoskeletal proteiner involveret i at opretholde cellestruktur. Selv med passende dissociation teknikker for fuld frigivelse af celler er der mulige at streng og ofte langvarig behandling kræves ville ændre mRNA kvalitet og celle integritet. Derudover påvirke de høje temperaturer bruges til enzym-assisteret dissociation også transcriptional signaturer29,30. Hensigten med protokollen er at præsentere kvalitetskontrol Kontroller, ved hjælp af væv som voksen myelinerede nerve og den ekstracellulære matrix-rige voksen hud, for at demonstrere, hvordan optimering kan hjælpe med at overvinde disse hindringer.
En vigtig overvejelse ved udformningen af enhver scRNA-Seq eksperiment er valget af sekventering dybde. Sekventering kan være yderst multipleksede og læse dybde kan variere fra at være meget lav, ved hjælp af Drop-Seq2 til op til 5 millioner lyder/celle14 ved hjælp af en fuld-længde RNA-Seq metode som Smart-FF. De fleste scRNA-Seq eksperimenter kan registrere moderat til høj udtryk udskrifter med sekventering så lavt som 10.000 læser/celle, som er normalt tilstrækkelig til celle type klassificering41,42. Lavvandede sekventering dybde er af værdi at spare på udgifterne til sekvensering, når de forsøger at afsløre sjældne cellepopulationer på tværs af komplekse væv hvor tusindvis af celler kan være nødvendigt at trygt tilskrive sjældne populationer. Men lavvandede dybde sekventering er ikke tilstrækkelige, når detaljerede oplysninger om genekspression og processer forbundet med subtile transcriptional signaturer er nødvendige. I øjeblikket anslås det, at det store flertal af gener i en celle er fundet med 500.000 læser/celle, men dette kan variere afhængigt af protokollen og væv Skriv43,44. Mens fuld længde udskrift sekventering omgår behovet for forsamlingen og kan derfor afsløre roman eller sjældne splice varianter, begrænse sekventering omkostningerne ofte skalering sådanne tilgange for at undersøge tusindvis af celler, der omfatter et komplekst væv system. Derimod markeret 3' én celle biblioteker som de, der er beskrevet i denne protokol typisk har lavere kompleksitet og kræver lavvandede sekvensering. Det er vigtigt at bemærke, at biblioteker genereret ved hjælp af den beskrevne protokol kan blive sekventeret på en af fem understøttede sequencere: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 hurtige Run og højkapacitet, 4) NextSeq 500/550 og 5) MiSeq.
En alternativ tilgang til enkelt celle RNA-FF., der reducerer behovet for fine vævs- og håndtering endnu bevarer nogle af fordelene ved enkelt celle RNA-FF., er analysen af RNA fra enkelt kerner45. Denne tilgang giver mulighed for hurtig behandling reducerer RNA nedbrydning, og mere ekstreme foranstaltninger for at sikre tilstrækkelig frigivelse af kerner, og dermed sandsynligvis giver mulighed for en mere sikker erobringen af de transcriptional profiler, der repræsenterer alle celler i et givet væv. Dette giver naturligvis kun en del af det transkriptionel aktivitet inden for en given celle, således alt efter hvad eksperimentel mål er af interesse denne fremgangsmåde måske eller måske ikke være passende.
Udover den fuldstændig karakterisering af cellulære identitet inden for en given væv er en af de mest værdifulde analyser for scRNA-Seq datasæt vurdering af mellemliggende transcriptional stater på tværs 'defineret' cellepopulationer. Disse mellemliggende stater kan give indsigt i lineage relationerne mellem celler inden for identificerede populationer, hvilket ikke var muligt med traditionelle bulk RNA-Seq tilgange. Flere scRNA-Seq bioinformatic værktøjer er nu blevet udviklet for at belyse dette. Sådanne værktøjer kan vurdere processer involveret i, for eksempel, kræftceller skiftes til slutbrugeren muterede/metastatisk stamceller modnes til forskellige terminal skæbner eller immunceller shuttling mellem aktiv og inaktiv stater. Subtile transkriptom forskelle i celler kan også være tegn på lineage bias, nyligt udviklede bioinformatic værktøjer som FateID, kan udlede47. Da sondringer mellem skiftes celler kan være vanskeligt at fastslå givet transcriptional forskellene kan være subtile, dybere sekventering kan være nødvendige46. Dækning af en grundt sekventeret bibliotek kan heldigvis øges, hvis du er interesseret i sondering datasæt yderligere af re-løb biblioteket på en anden flow celle.
Tilsammen giver denne protokol en nem at tilpasse arbejdsproces, der gør det muligt for brugerne at transcriptionally profil hundreder til tusinder af single-celler i et eksperiment. Den endelige kvalitet af en scRNA-Seq datasæt bygger på optimeret celle isolation, flowcytometri, cDNA bibliotek generation og fortolkning af rå gen-stregkode matricer. Med henblik herpå giver denne protokol et samlet overblik over alle vigtige skridt, som nemt kan redigeres for at aktivere undersøgelser af forskellige vævstyper.

Med udviklingen af high throughput enkelt celle teknologi1,2 og fremskridt i brugervenlige bioinformatik værktøjer over det sidste årti3opstået et nyt felt af høj opløsning gen expression analyse- encellede RNA sekventering (scRNA-Seq). Studiet af enkelt celle genekspression blev først udviklet til at identificere heterogenitet inden for definerede cellepopulationer, såsom i stamceller eller kræftceller, eller til at identificere sjældne populationer af celler4,5, som var uopnåelig ved hjælp af traditionelle bulk RNA sekventering teknikker. Bioinformatic værktøjer har aktiveret identifikation af roman delpopulationer (Seurat)2, visualisering af celler langs en psuedotime plads (Monocle)6, definition af aktiv signaling netværk inden for eller mellem populationer ( NATURSKØNNE)7, forudsigelse af forsamlingen af single-celler i en kunstig 3D space (Seurat, og mere)8. Med disse nye og spændende analyser tilgængelige til det videnskabelige samfund bliver scRNA-Seq hurtigt-den nye standard metode til gen expression analyse.
Trods det enorme potentiale i scRNA-FF., kan tekniske skillsets kræves for at producere en ren datasæt og præcist fortolke resultaterne være udfordrende for nytilkomne. En grundlæggende, men omfattende protokol, startende fra isolering af enkelt celler fra hele primære væv til visualisering og præsentation af dataene til offentliggørelse her præsenteres (figur 1). Først, isolering af sunde enkelt celler kan anses for udfordrende, som forskellige væv varierer i deres grad af følsomhed over for enzymatisk fordøjelse og efterfølgende mekanisk dissociation. Denne protokol giver vejledning i fremgangsmåden isolation og identificerer vigtige kvalitetskontrol checkpoints under hele processen. Andet forståelse kompatibilitet og krav mellem enkelt celle teknologi og næste generation sequencing kan være forvirrende. Denne protokol giver retningslinjer for at gennemføre en brugervenlig, droplet-baserede encellede stregkodesystem platform og udføre sekvensering. Endelig, computerprogrammering er en vigtig forudsætning for analysere encellede transkriptom datasæt. Denne protokol indeholder ressourcer for at komme i gang med programmeringssproget Rasmussen og giver vejledning i implementering af to populære scRNA-Seq-specifikke R pakker. Sammen, kan denne protokol guide nyankomne i udfører scRNA-Seq analyse for at opnå klare og fortolkelige resultater. Denne protokol kan tilpasses de fleste væv i musen, og vigtigere kunne ændres til brug med andre organismer, herunder humane væv. Vil være nødvendigt med korrektioner afhængig af væv og brugeren.
Der er flere overvejelser at huske mens efter denne protokol; herunder, 1) efter alle kvalitetskontrol retningslinjer i trin 1 og 2 i denne protokol er anbefales for at sikre en levedygtig fælles cellesuspension af alle celler i stikprøven af interesse samtidig sikre nøjagtige samlede celle nummer tæller (sammenfattet i figur 2 ). Når dette er opnået, og hvis alle de betingelser, der er optimeret følges, kvalitetskontrol trin kan være faldet (til at spare tid - bevare RNA kvalitet og reducere celle tab). Bekræfter vellykket isolation af høj rentabilitet enkelt celler fra vævet af interesse stærkt anbefale før nogen nedstrøms behandling. 2) da nogle celletyper er mere følsomme end andre til stress, kan overdreven dissociation teknikker uforvarende bias befolkning, derfor confounding downstream analyse. Blid dissociation uden unødvendige cellulære klipning og fordøjelsen er kritisk for at opnå høje cellulære udbytter og en nøjagtig repræsentation af vævssammensætning. Shear styrker forekomme i ændring, FACS og resuspension skridt. 3) som med enhver RNA arbejde, er det bedst at indføre som lidt ekstra RNase i stikprøven som muligt under forberedelse. Dette vil hjælpe med at opretholde høj kvalitet RNA. Bruge ribonuklease-inhibitor løsninger med skylning til ren værktøjer og udstyr, ikke der er RNase-fri, men undgå DEPC-behandlet produkter. 4) udføre præparater så hurtigt som muligt. Dette vil hjælpe opretholde høj kvalitet RNA og reducere celledød. Afhængig af væv dissektion længde og animalske nummer, overveje starter flere dissektioner/præparater samtidig. 5) forberede celler på is, når muligt at opretholde høj kvalitet RNA, reducere celledød og langsom celle signalering og transcriptional aktivitet. Omend iskold forarbejdning er ideel til de fleste celletyper, udfører visse celletyper (fx, neutrofiler) bedre når forarbejdet ved stuetemperatur. 6) undgå calcium, magnesium, EDTA og DEPC-behandlet produkter under celle forberedelse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

Analyse af enkelt celle genekspression på tværs af tusindvis af individuelle celler i et væv eller mikromiljø er et værdifuldt redskab til at identificere celle sammensætning, forskelsbehandling af funktionel stater og molekylær veje underliggende observerede væv funktioner og dyrs adfærd. Isolering af intakt, sund enkelt celler fra voksne pattedyr væv for efterfølgende downstream enkelt celle Molekylær analyse kan dog være udfordrende. Denne protokol beskriver de generelle processer og kvalitetskontrol kontrol er nødvendige for at opnå høj kvalitet voksen enkelt celle præparater fra nervesystemet eller hud der aktiveret efterfølgende upartiske enkelt celle RNA sekvensering og analyse. Retningslinjer for downstream bioinformatic analyse er også tilgængelige.

Repertoire af open source-pakker designet til at analysere scRNA-Seq datasæt er steget dramatisk40 med fleste af disse pakker brug Rasmussen-baserede sprog3. Her, repræsentative resultater ved hjælp af to af disse pakker er præsenteret: vurdering af ukontrollerede gruppering af enkelt celler baseret på genekspression, og bestilling af enkelt celler langs en bane for at løse celle heterogenitet og dekonstruere biologiske processer.
Figur 4 illustrerer brugen af Seurat for forbehandling kvalitetskontroller og downstream Bioinformatik analyse. Først, filtrering og fjernelse af afvigende celler fra analyse er afgørende for kvalitet kontrol. Dette blev gjort ved hjælp af violin (figur 4a) og scatter parceller (figur 4b) til at visualisere procentdelen af mitokondrielle gener, antallet af gener (nGene) og antallet af UMI (nUMI) at identificere celle dubletter og outliers. En celle med en klart afvigende antal gener, UMI eller procentdel af mitokondrielle gener blev fjernet ved hjælp af Seurat s FilterCells funktion. Da Seurat bruger vigtigste komponent (PC) analyse score til klynger celler, bestemmelse af statistisk signifikant pc'er til at omfatte er et kritisk skridt. Albue parceller (fig. 4 c) blev brugt til PC udvalg, i hvilke pc'er plateau standardafvigelse for PC akse blev udelukket. Opløsning af klyngedannelse blev også manipuleret viser at antallet af klynger kan ændres, lige fra 0,4 (lav opløsning fører til færre celle klynger, figur 4 d) til 4 (høj opløsning fører til højere celle klynger, figur 4e ). Med lav opløsning er det sandsynligt, at hver klynge repræsenterer et defineret celletype, hvorimod i høj opløsning kan dette også repræsentere undertyper eller midlertidige stater af en celle population. I dette tilfælde blev med lav opløsning klynge indstillinger brugt til yderligere analysere udtryk heatmaps (ved hjælp af Seurat s DoHeatmap funktion) til at identificere de højst højlig udtrykte gener i en given klynge (figur 4f). I dette tilfælde, blev de højst højlig udtrykte gener identificeret ved at vurdere differential udtryk i en given klynge kontra alle andre klynger kombineret, viser at hver klynge entydigt var repræsenteret ved definerede gener. Derudover kan individuel kandidat gener visualiseres på tSNE arealer ved hjælp af Seurat s FeaturePlot funktion (figur 4 g). Dette tilladt for afkodningen, om der var klynger, der repræsenterede makrofager. Ved hjælp af FeaturePlot, fandt vi, at begge klynge 2 og 4 udtryk for Cd68 - en pan-makrofag markør.
Pakken Monocle blev brugt til bekræfter celle klynger identificeres i Seurat og opbygning af celle baner, eller pseudotemporal bestilling, til at sammenfatte biologiske processer (figur 5). Bestilling af pseudotemporal kan bruges til prøver hvor encellede udtryk profiler forventes at følge en biologisk tidsforløb. Celler kan bestilles langs et pseudotemporal kontinuum at løse mellemliggende stater, bifurcation punkter af to alternative celle skæbner, og identificere genet signaturer underliggende erhvervelse af hver skæbne. For det første, der svarer til Seurat filtrering, dårlig kvalitet celler blev fjernet, således at fordelingen af mRNA på tværs af alle celler var log normal og faldt mellem øvre og nedre grænser, som er identificeret i figur 5a. Derefter bruger Monocle's newCellTypeHierarchy funktion, enkelt celler blev klassificeret og tælles ved hjælp af kendte afstamning markørgener (figur 5b, 5 c). For eksempel, blev celler, der udtrykker PDGF receptor alpha eller Fibroblast specifikke Protein 1 tildelt celle Type #1 til at oprette et kriterium for at definere fibroblaster. Næste, denne befolkning (celle Type #1) blev vurderet til at dechifrere fibroblast baner. For at gøre dette, blev Monokels differentieret GeneTest funktion udnyttet, som sammenlignet de celler, der repræsenterer de ekstreme stater inden for befolkningen og fundet differential gener for bestilling af de resterende celler i befolkningen (fig. 5 d). Ved at anvende mangfoldige læringsmetoder (en type af ikke-lineær dimensionalitet reduktion) på tværs af alle celler, blev et koordinat langs en pseudotemporal sti tildelt. Denne bane blev derefter visualiseres ved celle stat (figur 5e) og pseudotime (figur 5f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> Figur 1: Flow chart. Skridt fra hele dyr forberedelse til at analysere enkelt celle RNA-Seq datasæt til indgivelse af endelige datasæt til et offentligt tilgængelige repository. Gel perler i Emulsion (ædelstene) henviser til perler med barcoded oligonukleotider, som indkapsler tusindvis af enkelt celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> Figur 2: at skabe levedygtige enkelt cellesuspension fra nervevæv. (a) tegneserie oversigt over kvalitetskontroller. (b) celler og snavs med celler stadig indarbejdet i snavs (røde pile). (c) celler frigivet fra vragrester (røde pile). (d) celle isolation af FACS. P0: debris fraktion; P1: celle-lignende fraktion; P3: udelukkelse af duplets; P4: levedygtighed farvestof (Sytox Orange) negative brøkdel. (e) ingen levedygtighed farvestof kontrol. (f) billede af P0 brøkdel der repræsenterer isolerede debris. (g) billede af P4 brøkdel der repræsenterer isolerede levedygtige celler (røde pile). (b) (c) (f) og (g) havde nukleare farvestof tilføjet 20 minutter før billeddannelse. Skala barer: 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> Figur 3: lavvandede sekventering forudsiger antal gendannede celler i 10 X forarbejdede prøver. (a) et eksempel (prøve 1,6) på MiSeq-genereret csv notering celle stregkoder og dens tilsvarende UMI tæller som fastsat af trygt tilknyttede læser. b stregkode rang plot for prøven 1,6 viser et betydeligt fald i UMI tælle som en funktion af celle stregkoder. Solid og stiplede linjer repræsenterer cutoff mellem celler og baggrund som bestemt ved visuel inspektion. c celle stregkoder observeret ved hjælp af celle Ranger pipeline indlæg-HiSeq afslører lavvandede sekventering præcist tilnærmet antal celler for eksempel 1,6. (d) et eksempel på en flow-celle set-up baseret på lavvandede sekventering afledt celle skøn. For eksempel 1,6, da lavvandede sekventering forudsagt 3480 celler, 1,17 baner blev tildelt til at sikre > 100.000 læser per celle sekventering dækning i HiSeq. Bemærk: Alle baner skal føje til 100%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> Figur 4: kvalitetskontrol og bioinformatik af encellede RNA-Seq datasæt ved hjælp af Seurat R pakke. a parceller af kvalitetskontrol målinger, som omfatter antallet af gener, antallet af unikke molekylære identifikatorer ((UMIS) velkommen) og procentdelen af udskrifter tilknytning til den mitokondrielle genom. b prøve gen observationsområder afsløre celler med afvigende niveauer af mitokondrie udskrifter og (UMIS) velkommen. c prøven albue plot bruges til ad hoc-bestemmelse af statistisk signifikant pc'er. De stiplede og dot-stiplede linjer repræsenterer cutoff hvor en klar "albue" bliver synlige på grafen. PC dimensioner før denne albue er inkluderet i downstream analyse. (d, e) Graf-baseret celle klynger visualiseret på to forskellige beslutninger i en lav-dimensionelle rum ved hjælp af et tSNE plot. (f) top markørgener (gul) for hver klynge visualiseret på et udtryk heatmap Seurat s DoHeatmap funktionen. (g) visualisere markør udtryk for, for eksempel Cd68 genet repræsenterer makrofager (lilla) ved hjælp af Seurat s FeaturePlot funktion. Dette tyder på at klynge 2 og 4 (i panelet d) af dette datasæt repræsenterer makrofager. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> Figur 5: celle kategorisering og bestilling langs peudotemporal bane ved hjælp af Monocle toolkit. a inspicerer distribution af mRNA (udledes fra UMI tæller) på tværs af alle celler i en prøve. Kun celler med mRNA mellem 0 - ~ 20.000 blev brugt til downstream analyse. (b, c) Tildele og tælle celletyper baseret på kendte afstamning celle markører. For eksempel, celler, der udtrykker PDGF receptor alpha eller Fibroblast specifikke Protein 1 var tilknyttet celle Type #1 repræsenterer pan-fibroblaster Monocle's newCellTypeHierarchy funktionen. Antallet af forskellige celletyper kan visualiseres som et cirkeldiagram (b) og som en tabel (c). (d) ved hjælp af celle Type #1 (fibroblaster) som et eksempel, gener bruges til bestilling af celler kan visualiseres ved hjælp af en scatter plot, der viser gen dispersion vs gennemsnitlige udtryk. Den røde kurve viser cutoff for gener bruges til bestilling af beregnede middelværdi-afvigelse model ved hjælp af Monocle's estimateDispersions funktion. Gener, der opfylder denne cutoff blev brugt til downstream pseudotime bestilling. (e, f) Visualisering af celle baner i en reduceret to-dimensionelle rum farvet af cellens "staten" (e), og af Monocle-tildelt "Pseudotime" (f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Denne protokol beskriver de generelle processer og kvalitetskontrol kontrol nødvendig for at forberede droplet-baseret, høj overførselshastighed enkelt celle RNA-Seq præparater sunde voksne pattedyr enkelt celler. Sekventering parametre, tilbydes Læs justering og downstream encellede bioinformatic analyse også.

Droplet stregkodesystem-baserede enkelt celle Transcriptomics af voksne pattedyr væv

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for mikrobiologi, såsom at forstå genudtryksændringer på tværs af tusindvis af enkeltceller efter en skade eller en sygdom. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver os mulighed for at dissekere transkriptomer af individuelle celler i et komplekst væv, og for bedre at forstå den funktionelle dynamik i en given befolkning. Fordelen ved vores protokol er, at den giver omfattende metoder, fra isolering af enkelte celler i primære væv, til analyse og visualisering af dette datasæt.Selv om denne metode starter fra encellede suspensioner fra huden og nerven, kan de sekventeringsmetoder, som vi beskriver, anvendes til at studere pattedyrvæv. Demonstrere denne procedure vil være Elodie Labit, og Wisoo Shin, to praktikanter fra mit laboratorium. Til at begynde, dissekere iskiasnerven af en aflivet mus ved først at skære huden væk fra bagenden af bagsiden af musen.Brug en steril skalpel klinge til at foretage et snit langs længden af låret. Brug derefter fine kraftæcessiver og saks til at afsløre og fjerne iskiasnerven. At dissekere rygskind, bruge fine kraftforrædere og saks til at gøre indsnit fra skulder til skulder, på tværs af gump, og ned på bagsiden.Vævet vaskes to gange med iskold HBSS. Fjern uønsket bindevæv, fedtdepoter eller snavs under et dissekerende mikroskop. Kun til huden skæres huden i tynde skiver ved hjælp af en steril skalpelkling.For at opnå huden dermis, flyde huden skiver i dispase, i HBSS i en 10 centimeter skål, i 30 til 40 minutter ved 37 grader Celsius. Brug fine kraftafren til at skrælle og adskille epidermis fra dermis, og derefter kassere epidermis. Derefter, for hud og nerve, bruge et par sterile skalpel vinger til at hakke hver prøve i en til to millimeter stykker.Vævsstykkerne anbringes i nyoptøet, to gram pr. milliliter kold kollagen-fire enzym i et 15 milliliter konisk rør. Inkuber hver prøve i enzymet i et 37-graders Celsius-bad i 30 minutter med blid omrystning hvert 10. På 30 minutter, bruge en P1000 pipetter til at triturere vævet 20 til 30 gange, og vende tilbage til vandbadet.Gentag trituration hver 30 minutter, indtil opløsningen synes uklar, og bidder af væv er stort set dissocieret. For hud kun, i den sidste time af inkubation, tilsættes en milligram per milliliter DNAse til huden prøve. Da nogle celletyper er mere følsomme end andre for mekanisk stress, kan overdreven dissociation teknikker bias din befolkning.Generel dissociation er afgørende for at opnå høje celleudbytter, og en nøjagtig repræsentation af vævssammensætning. Derefter skal du bruge et 40 mikrometerfilter oven på det koniske 50 milliliterrør til at filtrere hver vævsprøve to gange. Skyl filteret med 1 % BSA/HBSS.Efter centrifugering af prøverne som beskrevet i manuskriptet, re-suspendere celle pellet i HBSS, der indeholder en procent BSA, ved hjælp af en bred boring spids, og sted på is. Tilføjelsen af levedygtighed farvestof vil hjælpe dig med at optimere din forberedelse. Du bør sigte mod mindst 80 procent levedygtige celler.Når optimeret, denne og andre kvalitetskontrol trin kan udelades for at fremskynde dissociation proces, som bedre vil bevare RNA-kvalitet og reducere celletab. For at isolere levedygtige og sunde celler ved hjælp af FACS, først forberede 15 milliliter smalbundsrør med otte milliliter iskold en procent BSA / HBSS for prøve samlinger. For at sikre, at grænsefladen mellem væskens overflade og indersiden af røret er fugtig, og for at forhindre statisk og overfladespænding, invertere rørene før samlinger.Umiddelbart efter FACS cellesortering, når cellerne er indsamlet i et 15 milliliterrør, skal du bruge en milliliter på en procent BSA/HBSS til at vaske og skubbe alle cellerne ned fra rørets sideoverflade. Derefter centrifuger hver prøve ved 260 g i otte minutter. Efter udsmid af supernatant, re-suspendere celle pellet i en procent BSA / HBSS, og tilsæt 33,8 mikroliter til et rør, og holde dette rør på is.Dette trin er designet til at ske ved hjælp af reagenser fremstillet af et standardiseret kit. Alle viste trin skal udføres i overensstemmelse med producentens anvisninger. For at forberede GEM generation, placere en chip i chipholderen, forberede en celle master mix på is, i henhold til producentens protokol.Der tilsættes 56,2 mikroliter af masterblandingen til et rør, der indeholder 33,8 mikroliter selvaffjedring. For at forberede chippen, først på 50 procent glycerol til brønde, der ikke vil blive brugt. Derefter tilsættes 90 mikroliter af cellemasterblandingen til godt en, 40 mikroliter gelperler til godt to og 270 mikroliter af partitioneringsolie til godt tre.Dæk chippen med en pakning. Hvis du vil indlæse chippen og køre i en encellecontroller, skal du først skubbe bakken ud. Læg chippen i bakken.Træk bakken tilbage, og tryk på afspil. Efter hele kørslen indsamles 100 mikroliter af prøven, og den anbringes i et PCR-rør. Placer PCR-rør i en forudindstillet PCR-maskine, og kør i henhold til sættet.Efter kørslen vil GEM'er omfatte stregkodet cDNA i fuld længde fra polyadenyleret mRNA. Placer rørene på minus 20 grader Celsius natten over. Fortsæt med bibliotekskonstruktion, sekvensering, justering og analyse.Når prøverne er sorteret og justeret som beskrevet i manuskriptet, skal du deponere dataene på et offentligt register, såsom NCBI's GEO. Det kan du gøre ved at tilmelde dig indsenderkontoen. Først skal du fuldføre GEO-indsendelsen ved at downloade metadataarket.Sørg for kun at medtage ét metadataark pr. projektafsendelse. Placer regnearket i mappen. For det andet skal du tilføje den rå datafil, der er genereret fra scriptet til celleområderoptælling for alle biblioteker, i mappen.Den tredje mappe behandles datafiler. Placer behandlede datafiler, der er genereret fra script til antal celleområder for alle biblioteker, i mappen. Brug GEO-senderens FTP-serverlegitimationsoplysninger til at overføre den mappe, der indeholder alle tre komponenter.Efter at have kørt Cell Ranger, analyse-ready gen stregkode matricer kan yderligere behandles ved hjælp af avancerede bioinformatik. For det første blev forbehandling mængde kontrol udført ved hjælp af Seurat R pakke, som genererede violin og scatter plots til at visualisere antallet af gener, antallet af unikke molekylære identifikatorer, og procentdelen af mitokondrielle gener til at identificere celle doublets og outliers. Ved udvælgelse af hovedkomponenter eller pc'er blev der anvendt albueområder, hvor pc'er ud over plateauet for pc-aksens standardafvigelse blev udelukket.Opløsningen af klyngedannelse blev også manipuleret. Lav opløsning førte til færre celleklynger, hvor hver klynge sandsynligvis repræsenterer en defineret celletype. Høj opløsning førte til højere cellesandsynlighed, der repræsenterer undertyper eller overgangsstater for en cellepopulation.Klyngeindstillinger med lav opløsning blev brugt til yderligere analyse af udtryksvarmekort for at identificere de mest udtrykte gener i en given klynge. Individuelle kandidatgener blev visualiseret på tSNE-plots ved hjælp af Seurats funktionsplotfunktion, der tillod dechifrering, om der var klynger, der repræsenterede f.eks. Både klynge to og fire udtrykt CD68, en pan-makrofag markør.Andre pakker giver også værktøjer til kvalitetskontrol, for eksempel Monocle, en R-pakke, der anvendes til opbygning af celle baner, fjerner dårlig kvalitet celler, og sikrer, at fordelingen af mRNA på tværs af alle celler er log normal, og faldt mellem øvre og nedre grænser. Enkelte celler blev derefter klassificeret og talt ved hjælp af kendte afstamningsmarkørgener, og celler, der udtrykker interessemarkører, blev tildelt celletype nummer et. Det blev fastslået, at celletype nummer et var fibroblaster.Denne population blev vurderet til at bygge fibroblaster udviklingsmæssige bane. Efter denne procedure, andre metoder som kvantitativ PCR, in situ hybridisering, en immunist kemi bør udføres for at validere nøjagtigheden af dit genekspression resultater. Single-celle mRNA sekventering har nu banet vejen for forskere i mange forskellige områder til at udforske celle-til-celle heterogenitet, og identificere funktionelle dynamik i forskellige væv under homøostase, og hvordan disse kan ændre sig efter skade eller i udvikling af sygdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell transkriptionel Profilering af Voksen Mouse cardiomyocytter

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse af Cell Cycle Position i pattedyrceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Måling af hæmoglobinsyntese Niveauer i pattedyrceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Effektiv pattedyrscelleekspression og Single-trins Oprensning af ekstracellulært glycoproteiner til krystallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Anaerob vækst og vedligeholdelse af pattedyr cellelinjer

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Beriger udbyttet af humane melanocytter fra voksent hudvæv

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Enkelt Myofiber Kultur Assay til vurdering af voksne muskelstamcellefunktionalitet Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...