Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Wij erkennen het ondersteunend personeel bij de faciliteit van UCDNA diensten, alsmede het personeel van de faciliteit Animal Care aan de Universiteit van Calgary. Wij danken Matt Workentine voor zijn steun van bioinformatica en Jens Durruthy voor zijn technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de CIHR (R.M. en J.B.), een CIHR nieuwe Investigator Award J.B. en een Alberta Children's Health Research Institute Fellowship (J.S.).

<ol>
	<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+for+cellular+variation.">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation.</a> Nature. 510, 363-369 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161, 1202-1214 (2015).</li><li>Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+single-cell+RNA-seq+analysis+landscape+with+the+scRNA-tools+database.">Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database.</a> bioRxiv:206573. , (2018).</li><li>Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+defines+heterogeneity+and+transcriptional+dynamics+in+the+adult+neural+stem+cell+lineage.">Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage.</a> Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).</li><li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+Reveals+a+Population+of+Dormant+Neural+Stem+Cells+that+Become+Activated+upon+Brain+Injury.">Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Schwann+Cells+from+Adult+Human+Skin+and+Nerve.">Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Agilent Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135">https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135</a> (2018)</li><li>Kolodziejczyk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+RNA-Sequencing+of+Pluripotent+States+Unlocks+Modular+Transcriptional+Variation.">Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation.</a> Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex.">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).</li><li>. Sequencing Requirements for Single Cell 3' Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3</a> (2018)</li><li>. Introduction to R Available from: <a target="_blank" href="https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r">https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Creating a Reference Package with cellranger mkref Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references</a> (2018)</li><li>. System Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements</a> (2018)</li><li>. Software Downloads Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</a> (2018)</li><li>. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization</a> (2018)</li><li>. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial</a> (2018)</li><li>. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data Available from: <a target="_blank" href="https://www.scrna-tools.org/">https://www.scrna-tools.org/</a> (2018)</li><li>. Downloading conda Available from: <a target="_blank" href="https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html">https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html</a> (2018)</li><li>. r / packages / r 3.5.1 Available from: <a target="_blank" href="https://anaconda.org/r/r">https://anaconda.org/r/r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. Seurat - Guided Clustering Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html">https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>Github. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).</li><li>. GenBank Submission Portal Wizards Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/</a> (2018)</li><li>. Submitting data Available from: <a target="_blank" href="https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/">https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/</a> (2018)</li><li>Shah, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+and+Fate+Mapping+of+Ependymal+Cells+Reveals+an+Absence+of+Neural+Stem+Cell+Function.">Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function.</a> Cell. 173, 1045-1057 (2018).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11, 1 (2013).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144, 3625-3632 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96, 313-329 (2017).</li><li>Zeigenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+states+versus+single-cell+atlases+-+two+classes+of+heterogeneity+that+differ+in+meaning+and+method.">Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method.</a> Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).</li><li>Herman, J. S., Sagar, D., Gr&#252;n, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FateID+infers+cell+fate+bias+in+multipotent+progenitors+from+single-cell+RNA-seq+data.">FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data.</a> Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).</li></ol>

Geen informatieverschaffing

Dit protocol wordt gedemonstreerd hoe de juiste voorbereiding van afzonderlijke cellen kunt ontdekken de transcriptionele heterogeniteit van duizenden afzonderlijke cellen en discrimineren van functionele Staten of unieke cellulaire identiteiten binnen een weefsel. Het protocol vereist geen fluorescerende verslaggever eiwitten of transgene tools en kan worden toegepast op de isolatie van afzonderlijke cellen van diverse weefsels van belang, met inbegrip van die van de mens; rekening houdend met elk weefsel is uniek en dit protocol vergt een zekere mate van aanpassing/wijziging.
De gevarieerde en hoogdynamische transcriptionele programma's binnen cellen hebben gewezen op de waarde van één cel genomica. Afgezien van het isoleren van kwalitatief hoogwaardige RNA, een kritische monster voorbereiding stap nodig voor hoge kwaliteit datasets is ervoor te zorgen dat cellen volledig uit weefsel vrijgelaten worden en dat cellen gezond en intact zijn. Dit is relatief ongecompliceerd voor het verzamelen van cellen die gemakkelijk zijn uitgebracht, zoals de circulerende cellen of weefsels waar cellen losjes behouden zijn, zoals lymfoïde weefsels. Maar dit kan uitdagend zijn voor andere volwassen weefsels, vanwege de hoogontwikkelde cellulaire architectuur, verspreid over grote afstanden, omringende extracellulaire matrix en de vaak-stijve cytoskeletal eiwitten die betrokken zijn bij het handhaven van de celstructuur. Zelfs met de juiste dissociatie technieken voor de volledige release van cellen is er potentieel dat de verwerking van het strenge en vaak langdurig vereist mRNA kwaliteit en cel integriteit zou veranderen. Bovendien, de hoge temperaturen gebruikt voor dissociatie van het enzym-bijgewoonde ook invloed op transcriptionele handtekeningen29,30. De bedoeling van het protocol is te presenteren van kwaliteitscontrole controles, met behulp van weefsels zoals de myelinated volwassen zenuw en de extracellulaire matrix-rijke volwassen huid, om aan te tonen hoe optimalisatie kan helpen om deze obstakels te overwinnen.
Een belangrijke overweging bij het ontwerpen van een scRNA-Seq-experiment is de keuze van sequencing diepte. Sequentie kan worden zeer multiplexed en lees diepte kan variëren van zeer lage Drop-Seq2 tot maximaal 5 miljoen leest/cel14 via een full-length RNA-Seq-methode zoals Smart-Seq. gebruikt wordt De meeste scRNA-Seq experimenten kunnen detecteren matige tot hoge expressie chat-kopieën met sequencing zo laag als 10.000 leest/cel, die is meestal voldoende voor cel type indeling41,42. Ondiepe sequencing diepte is van belang om te besparen op sequencing kosten wanneer het proberen om het detecteren van zeldzame cel populaties in complexe weefsels waar duizenden cellen nodig zijn kunnen om vol vertrouwen het toeschrijven van zeldzame populaties. Maar ondiepe diepte rangschikken is niet voldoende wanneer gedetailleerde informatie over de expressie van genen en processen gekoppeld aan subtiele transcriptionele handtekeningen nodig is. Op dit moment geschat wordt dat de grote meerderheid van de genen in een cel worden gedetecteerd met 500.000 leest/cel, maar dit afhankelijk van het protocol variëren kan en weefsel Typ43,44. Terwijl full-length transcript sequencing de noodzaak voor montage omzeilt en daarom roman of zeldzame splice varianten detecteren kan, beperken sequencing kosten vaak schalen van dergelijke benaderingen te onderzoeken van duizenden cellen bestaande uit een complex weefsel systeem. In tegenstelling, 3' gelabeld eencellige bibliotheken zoals beschreven in dit protocol meestal degenen lagere complexiteit hebben en ondieper sequencing. Het is belangrijk op te merken dat bibliotheken gegenereerd met behulp van het protocol beschreven sequenced kunnen worden op een van de vijf ondersteunde sequencers: 1) NovaSeq 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 snelle Run en hoge Output, 4) NextSeq 500/550 en 5) MiSeq.
Een alternatieve aanpak van eencellige RNA-Seq, dat vermindert de noodzaak voor delicate weefsels en cellen die behandeling nog enkele van de voordelen van eencellige RNA-Seq handhaaft, is de analyse van RNA enkele kernen €45. Deze benadering kunt een snellere verwerking vermindering van de aantasting van het RNA en meer extreme maatregelen om adequate versie van kernen te verzekeren en dus waarschijnlijk voor een zekerder vangst van de transcriptionele profielen vertegenwoordigen alle cellen binnen een bepaald weefsel. Dit zou natuurlijk bieden alleen een gedeelte van de transcriptionele activiteit aanwezig binnen een bepaalde cel, dus afhankelijk van wat de experimentele doelstellingen van belang deze aanpak kan al dan niet geschikt zijn.
Naast de volledige karakterisering van cellulaire identiteiten binnen een bepaald weefsel is een van de meest waardevolle analyses voor scRNA-Seq gegevenssets de beoordeling van tussenliggende transcriptionele Staten over 'omschreven' cel populaties. Deze intermediaire Staten kunnen geven inzicht in de bloedlijn relaties tussen cellen binnen geïdentificeerde bevolkingsgroepen, die niet kon met traditionele bulk die RNA-Seq benadert. Diverse scRNA-Seq bioinformatic hulpmiddelen zijn nu ontwikkeld om te verduidelijken dit. Dergelijke instrumenten kunnen beoordelen de processen betrokken bij bijvoorbeeld kankercellen overgang naar een oncogene/metastatische staat, stamcellen rijpen in uiteenlopende terminal lot of immuuncellen pendelen tussen actieve en rustige staten. Subtiele transcriptome verschillen in cellen kunnen ook worden indicatieve van lineage vooroordelen dat onlangs ontwikkelde bioinformatic hulpmiddelen zoals FateID,47kunnen afleiden. Aangezien het onderscheid tussen de overgang van de cellen moeilijk kunnen zijn kunnen om na te gaan gezien de transcriptionele verschillen subtiel, diepere sequencing kan nodig46. Gelukkig kan de dekking van een ondiep gesequenceerd bibliotheek worden verhoogd indien geïnteresseerd in het sonderen van de dataset verder door de bibliotheek opnieuw uit te voeren op een andere cel van de stroom.
Samen genomen, biedt dit protocol een gemakkelijk-aan-adapt workflow waarmee gebruikers transcriptionally profileren honderden tot duizenden single-cellen binnen één experiment. De uiteindelijke kwaliteit van een scRNA-Seq-dataset is afhankelijk van geoptimaliseerde cel isolatie, stroom cytometry, cDNA Bibliotheek generatie en interpretatie van de ruwe gen-barcode matrices. Te dien einde biedt dit protocol een uitgebreid overzicht van alle belangrijke stappen die moeiteloos kunnen worden gewijzigd zodat de studies van verschillende weefseltypes (HLA).

Met de ontwikkeling van hoge-doorvoer eencellige technologie1,2 en vooruitgang in de gebruiksvriendelijke bioinformatica tools over de laatste tien jaar3, is er een nieuw veld van high-resolution gen expressie analyse naar voren gekomen- eencellige RNA sequencing (scRNA-Seq). De studie van eencellige genexpressie ontstond eerst identificeren van heterogeniteit binnen de gedefinieerde cel populaties, zoals in stamcellen of kankercellen, of identificeren van zeldzame populaties van cellen4,5, die met behulp van de onbereikbare waren traditionele bulk RNA sequencing technieken. Bioinformatic hulpmiddelen hebt ingeschakeld op de identificatie van nieuwe subpopulatie (Seurat)2, visualisatie van de orde van cellen langs een psuedotime ruimte (Monocle)6, definitie van actieve signalering netwerken binnen of tussen populaties) SCHILDERACHTIGE)7, voorspelling van de vergadering van single-cellen in een kunstmatige 3D-ruimte (Seurat, en meer)8. Met deze nieuwe en opwindende analyses waarover de wetenschappelijke gemeenschap wordt scRNA-Seq fast-de nieuwe standaardbenadering voor gen expressie analyse.
Ondanks het enorme potentieel van scRNA-Seq kunnen de technische vaardigheden nodig is voor het produceren van een schone dataset en nauwkeurig om resultaten te interpreteren uitdagende aan nieuwkomers. Hier, een eenvoudige, maar uitgebreide protocol, vanaf van de isolatie van afzonderlijke cellen van de gehele primaire weefsels naar visualisatie en presentatie van gegevens voor publicatie wordt gepresenteerd (Figuur 1). Ten eerste, het isolement van gezonde enkele cellen kunt geacht uitdagende, verschillende weefsels variëren in de mate van gevoeligheid voor enzymatische spijsvertering en latere mechanische dissociatie. Dit protocol verschaft een leidraad in deze stappen van isolatie en identificeert belangrijke kwaliteitscontrole controlepunten gedurende het gehele proces. Ten tweede, inzicht in de compatibiliteit en eisen tussen eencellige technologie en de volgende generatie sequencing verwarrend kan zijn. Dit protocol biedt richtsnoeren voor de tenuitvoerlegging van een gebruiksvriendelijk, druppel gebaseerde eencellige barcoding platform en volgorde uitvoeren. Ten slotte, computerprogrammering is een belangrijke voorwaarde voor het analyseren van eencellige transcriptomic datasets. Dit protocol voorziet in middelen aan de slag met de programmeertaal R en geeft advies over de uitvoering van twee populaire scRNA-Seq-specifieke R pakketten. Samen kan dit protocol nieuwkomers bij het uitvoeren van scRNA-Seq analyse voor het verkrijgen van heldere, interpreteerbaar resultaten begeleiden. Dit protocol kan worden aangepast aan de meeste weefsels in de muis, en belangrijker kan worden aangepast voor gebruik met andere organismen, met inbegrip van menselijke weefsel. Aanpassingen afhankelijk van het weefsel en de gebruiker zal worden gevraagd.
Er zijn enkele punten waarmee u rekening moet houden terwijl het volgens dit protocol; inclusief 1) naar aanleiding van alle richtsnoeren van de kwaliteitscontrole in stappen 1 en 2 van dit protocol wordt aanbevolen om een levensvatbare interne celsuspensie van alle cellen binnen het monster van belang tegelijkertijd nauwkeurige cel Totaal aantal graven (samengevat in figuur 2 ). Zodra dit gebeurt, en als alle geoptimaliseerde voorwaarden worden gevolgd, de kwaliteitscontrole-stappen kunnen worden afgenomen (aan Bespaar tijd - behoud van RNA kwaliteit en vermindering van de cel verlies). Bevestiging van succesvolle isolatie van hoge levensvatbaarheid afzonderlijke cellen van het weefsel van belang is zeer aan te bevelen voor een stroomafwaarts verwerking. 2) Aangezien sommige celtypen gevoeliger dan anderen zijn te benadrukken, kunnen de bevolking, daarom verstorende downstream analyse per ongeluk vertekening door buitensporige dissociatie technieken. Zachte dissociatie zonder geen onnodige cellulaire schuintrekken en spijsvertering is van cruciaal belang voor het bereiken van hoge cellulaire opbrengsten en een accurate weergave van weefsel samenstelling. Schuintrekken krachten optreden tijdens de verpulvering, FACS en resuspensie stappen. 3) als met een RNA-werk, is het beste te introduceren als weinig extra RNase in het monster mogelijk tijdens de voorbereiding. Dit zal helpen handhaven van kwalitatief hoogwaardige RNA. Gebruiken ribonuclease remmer oplossingen met spoelen gereedschap reinigen en alle apparatuur die niet is RNase-gratis maar DEPC-behandelde producten vermijden. 4) voorbereidingen zo snel mogelijk uitvoeren. Dit zal helpen handhaven van kwalitatief hoogwaardige RNA en celdood te verminderen. Afhankelijk van de lengte van weefsel dissectie en dierlijke nummer, kunt u overwegen meerdere dissecties/voorbereidingen starten op hetzelfde moment. 5) bereiden cellen op ijs wanneer mogelijk te handhaven van hoge kwaliteit RNA, verminderen van celdood, en langzaam cel signalering en transcriptionele activiteit. Alhoewel, ijskoude verwerking is ideaal voor de meeste celtypes, wordt sommige celtypen (b.v., neutrofielen) beter presteren wanneer verwerkt bij kamertemperatuur. 6) Vermijd calcium, magnesium, EDTA en DEPC-behandelde producten tijdens de voorbereiding van de cel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

De analyse van genexpressie eencellige over duizenden afzonderlijke cellen binnen een weefsel of communicatie is een waardevol instrument voor identificerende cel samenstelling, discriminatie van functionele Staten, en moleculaire pathways onderliggende waargenomen weefsel functies en dierlijke gedrag. Het isolement van intact, gezonde afzonderlijke cellen van volwassen zoogdieren weefsels voor latere downstream eencellige moleculaire analyse kan echter uitdagend. Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig te verkrijgen van hoge-kwaliteit volwassen eencellige preparaten van het zenuwstelsel of huid die ingeschakeld latere onbevooroordeelde eencellige RNA sequencing en analyse. Richtsnoeren voor downstream bioinformatic analyse zijn ook beschikbaar.

Het repertoire van open source pakketten ontworpen om te analyseren scRNA-Seq datasets dramatisch gestegen40 met de meerderheid van deze pakketten gebruik R gebaseerde talen3. Hier, representatieve resultaten met behulp van twee van deze pakketten worden gepresenteerd: beoordeling van ongecontroleerde groepering van enkele cellen op basis van genexpressie en bestellen van afzonderlijke cellen langs een traject om te lossen cel heterogeniteit en deconstrueren biologische processen.
Figuur 4 illustreert het gebruik van Seurat voor voorbehandeling kwaliteitscontroles en downstream bioinformatics analyse. Ten eerste, filtratie en verwijdering van afwijkende cellen uit de analyse is noodzakelijk om de controle van de kwaliteit. Dit werd gedaan met behulp van viool (figuur 4a) en scatter percelen (figuur 4b) te visualiseren van het percentage van de mitochondriale genen, aantal genen (nGene) en aantal UMI (nUMI) om cel paren en uitschieters te identificeren. Een cel met een duidelijke uitbijter aantal genen, UMI of percentage van mitochondriale genen is verwijderd met behulp van Seurat de FilterCells functie. Aangezien Seurat gebruikt belangrijkste component (PC) analyse scores aan clusters cellen, bepalen van statistisch significante PC's op te nemen is een cruciale stap. Elleboog percelen (Figuur 4 c) werden gebruikt voor de selectie van de PC, in welke PC's buiten het plateau van de "standaarddeviatie van PC' as werden uitgesloten. De resolutie van clustering werd ook gemanipuleerd waaruit blijkt dat het aantal clusters kan worden gewijzigd, variërend van 0.4 (lage resolutie leidt tot minder cel clusters, Figuur 4 d) tot en met 4 (hoge resolutie leidt tot hogere cel clusters, figuur 4e ). Met een lage resolutie is het waarschijnlijk dat elk cluster een bepaald celtype vertegenwoordigt, overwegende dat bij hoge resolutie dit ook subtypen of tijdelijke Staten van een celpopulatie betekenen kan. In dit geval werden met een lage resolutie cluster instellingen gebruikt voor het verder analyseren expressie heatmaps (met behulp van Seurat DoHeatmap functie) om de hoogst uitgedrukte genen in een bepaald cluster (figuur 4f) te identificeren. In dit geval werden de hoogst uitgedrukte genen geïdentificeerd door het beoordelen van differentiële expressie in een bepaald cluster ten opzichte van alle andere clusters gecombineerd, waaruit blijkt dat elk cluster een unieke werd vertegenwoordigd door gedefinieerde genen. Bovendien kunnen individuele kandidaat-genen worden gevisualiseerd op percelen van de tSNE met behulp van Seurat de FeaturePlot functie (Figuur 4 g). Dit toegestaan voor ontcijferen of er clusters die macrofagen vertegenwoordigd waren. Met behulp van FeaturePlot, vonden we dat beide cluster 2 en 4 waren Cd68 - een marker van de pan-macrofaag uitdrukken.
De Monocle-pakket werd gebruikt voor ondersteunend cel clusters geïdentificeerd in Seurat, en voor het bouwen van cel trajecten, of door pseudotemporal te bestellen, te recapituleren biologische processen (Figuur 5). Bestellen van de pseudotemporal kan worden gebruikt voor monsters waar eencellige expressieprofielen verwachting te volgen van een biologische tijdsverloop. Cellen kunnen besteld worden langs een continuüm van pseudotemporal om op te lossen tussentijdse staten, bifurcatie punten van twee alternatieve cel lot, en gene handtekeningen ten grondslag liggen aan de verwerving van elk lot te identificeren. Ten eerste, vergelijkbaar met de Seurat filtratie, kwalitatief slechte cellen werden verwijderd, zodat de verdeling van mRNA over alle cellen log normaal en viel tussen de bovenste en onderste grenzen was zoals aangegeven in figuur 5a. Vervolgens met de Monocle newCellTypeHierarchy functie, afzonderlijke cellen werden ingedeeld en geteld met behulp van bekende afstamming markers (Figuur 5b, 5 c). Bijvoorbeeld, werden cellen, uiting geven aan de PDGF receptor Alfa- of Fibroblast specifieke eiwitten 1 toegewezen aan de cel Type #1 maken een criterium voor het definiëren van fibroblasten. Vervolgens werd deze populatie (cel Type #1) beoordeeld om te ontcijferen fibroblast trajecten. Om dit te doen, werd de Monocle differentiële GeneTest functie gebruikt, die ten opzichte van de cellen die de extreme lidstaten binnen de bevolking vertegenwoordigt en differentiële genen gevonden voor het bestellen van de resterende cellen onder de bevolking (Figuur 5 d). Spruitstuk leermethoden (een type van vermindering van de niet-lineaire dimensionaliteit) toe te passen op alle cellen, was een coördinaat langs een pseudotemporal pad toegewezen. Dit traject werd vervolgens gevisualiseerd door cel staat (figuur 5e) en pseudotime (figuur 5f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> Figuur 1: stroomschema. Stappen van hele dieren voorbereiding naar het analyseren van één cel RNA-Seq datasets tot het indienen van de definitieve datasets in een openbaar archief. Gel kralen in emulsie (edelstenen) verwijzen naar kralen met barcoded oligonucleotides, die weer duizenden afzonderlijke cellen inkapselen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> Figuur 2: creëren van levensvatbare interne celsuspensie van zenuwweefsel. (a) cartoon overzicht van kwaliteitscontroles. (b) cellen en puin met cellen nog steeds opgenomen in puin (rode pijlen). (c) cellen vrijgelaten uit puin (rode pijlen). (d) cel isolatie door FACS. P0: puin breuk; P1: cel-achtige breuk; P3: uitsluiting van duplets; P4: levensvatbaarheid kleurstof (Sytox Orange) negatieve breuk. (e) geen levensvatbaarheid kleurstof controle. (f) afbeelding P0 fractie vertegenwoordigen geïsoleerd puin. (g) afbeelding P4 fractie vertegenwoordigen geïsoleerd levensvatbare cellen (rode pijlen). (b) (c) (f) en (g) had nucleaire kleurstof toegevoegd 20 minuten voor de beeldvorming. Schaal Bars: 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> Figuur 3: ondiepe sequencing voorspelt het aantal herstelde cellen in 10 X verwerkte monsters. (a) een voorbeeld (monster 1.6) voor MiSeq-gegenereerd csv aanbieding cel barcodes en de bijbehorende UMI wordt geteld zoals bepaald door vertrouwen toegewezen leest. (b) Barcode rangschikking perceel voor monster 1.6 toont een aanzienlijke daling in UMI tellen als een functie van de cel barcodes. De onderbroken en ononderbroken lijnen geven de cutoff tussen cellen en achtergrond zoals bepaald door de visuele inspectie. (c) cel barcodes waargenomen met behulp van de Cell Ranger pijpleiding post-HiSeq onthult ondiepe sequencing benaderd nauwkeurig het aantal cellen voor monster 1.6. (d) een voorbeeld van een set-up van de stroom-cel op basis van ondiepe sequencing afgeleide ramingen van de cel. Monster 1.6, aangezien ondiepe sequencing voorspeld 3480 cellen, 1,17 rijstroken waren toegewezen om > 100.000 leest per cel sequencing dekking in HiSeq. Opmerking: Alle rijstroken moeten toevoegen aan 100%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> Figuur 4: kwaliteitscontrole en bio-informatica van eencellige RNA-Seq dataset met behulp van Seurat R package. (a) percelen van kwaliteitscontrole metrics, waaronder een aantal genen, aantal unieke moleculaire identificatoren (UMIs) en het percentage van afschriften toewijzen aan het mitochondriaal genoom. (b) monster gene percelen detecting cellen met afwijkende niveaus van mitochondriale afschriften en UMIs. (c) monster elleboog plot gebruikt voor ad hoc bepaling van statistisch significante PC's. De onderbroken en stip onderbroken lijnen geven de cutoff wanneer een duidelijke "elleboog" zich manifesteert in de grafiek. PC afmetingen vóór deze elleboog zijn opgenomen in de downstream-analyse. (d, e) Grafiek gebaseerde cel clusters gevisualiseerd met twee verschillende resoluties in een laag-dimensionale ruimte met behulp van een perceel van tSNE. (f) de bovenste markering genen (geel) voor elk cluster gevisualiseerd op een expressie heatmap met behulp van Seurat de DoHeatmap functie. (g) visualiseren marker expressie van, bijvoorbeeld, Cd68 gen vertegenwoordigen macrofagen (paars) met behulp van Seurat de FeaturePlot functie. Dit suggereert dat cluster 2 en 4 (in deelvenster d) van deze dataset vertegenwoordigt macrofagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> Figuur 5: cel categorisatie en bestellen langs peudotemporal traject met Monocle toolkit. (a) de verdeling van mRNA (afgeleid van de graven van de UMI) over alle cellen in een monster van de inspectie. Alleen cellen met mRNA tussen 0 - ~ 20.000 werden gebruikt voor downstream-analyse. (b, c) Toewijzen en tellen celtypes gebaseerd op bekende afstamming cel markeringen. Bijvoorbeeld, cellen, uiting geven aan de PDGF receptor Alfa- of Fibroblast specifieke eiwitten 1 werden toegewezen aan de cel Type #1 pan-fibroblasten vertegenwoordigen Monocle de newCellTypeHierarchy functie. Aantal verschillende soorten cellen kan worden gevisualiseerd, een cirkeldiagram (b) en als een tabel (c). (d) het gebruikmaken van cel Type #1 (fibroblasten) als voorbeeld, de genen voor het bestellen van cellen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een scatterplot waaruit gene dispersie vs. gemiddelde expressie gebruikt. De rode curve toont de cutoff voor genen gebruikt voor het bestellen van berekend door het gemiddelde-variantie-model met behulp van de Monocle estimateDispersions functie. Genen die voldoen aan deze cutoff werden gebruikt voor downstream pseudotime bestellen. (e, f) Visualisatie van cel trajecten in een verminderde twee-dimensionale ruimte gekleurd door de cel "staat" (e), en de Monocle-toegewezen "Pseudotime" (f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig voor gezonde volwassen één zoogdiercellen voorbereiden druppel gebaseerde, hoge doorvoer eencellige RNA-Seq preparaten. Sequencing parameters, worden Lees uitlijning en downstream eencellige bioinformatic analyse ook geleverd.

Druppel Barcoding gebaseerde eencellige Transcriptomics van volwassen zoogdieren weefsels

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van microbiologie, zoals het begrijpen van genexpressie veranderingen in duizenden enkele cellen na een blessure of een ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om transcripto's van individuele cellen binnen een complex weefsel te ontleden en de functionele dynamiek binnen een bepaalde populatie beter te waarderen. Het voordeel van ons protocol is dat het uitgebreide methoden biedt, van isolatie van enkele cellen in primaire weefsels tot analyse en visualisatie van deze gegevensset.Hoewel deze methode begint met eencellige suspensies van de huid en de zenuw, kunnen de sequencing-methoden die we beschrijven worden toegepast om elk zoogdierweefsel te bestuderen. Het aantonen van deze procedure zal Elodie Labit zijn, en Wisoo Shin, twee stagiaires van mijn laboratorium. Om te beginnen ontleedt u de heupzenuw van een geëuthanaseerde muis door eerst de huid weg te snijden van het achterste gebied van de achterkant van de muis.Gebruik een steriel scalpelblad om een incisie te maken langs de lengte van de dij. Gebruik dan fijne tang en schaar om de heupzenuw bloot te leggen en te verwijderen. Om de rughuid te ontleden, gebruik je fijne tangen en scharen om insnijdingen te maken van schouder tot schouder, over de romp en langs de rug.Was de weefsels twee keer met ijskoude HBSS. Onder een ontledenmicroscoop, verwijder ongewenste bindweefsel, vetafzettingen, of puin. Voor de huid alleen, snijd de huid in dunne plakjes, met behulp van een steriele scalpel mes.Om de huid dermis te verkrijgen, zweef de huid plakjes in dispase, in HBSS in een schaal van 10 centimeter, gedurende 30 tot 40 minuten bij 37 graden Celsius. Gebruik fijne tangen te schillen en scheiden van de opperhuid van de dermis, en gooi de opperhuid. Gebruik vervolgens voor huid en zenuw een paar steriele scalpelbladen om elk monster in stukken van één tot twee millimeter te hakken.Plaats de weefselstukken in vers ontdooide, twee gram per milliliter koude collagenase-vier enzym in een 15 milliliter conische buis. Incubeer elk monster in het enzym in een 37-graden Celsius bad gedurende 30 minuten met zachte schudden om de 10 minuten. Gebruik na 30 minuten een P1000 pipetter om het weefsel 20 tot 30 keer te tritureren en terug te keren naar het waterbad.Herhaal trituratie elke 30 minuten totdat de oplossing lijkt troebel, en brokken weefsel zijn grotendeels gescheiden. Voor de huid alleen, in het laatste uur van incubatie, voeg een milligram per milliliter DNAse aan het huidmonster. Aangezien sommige celtypes gevoeliger zijn dan anderen voor mechanische stress, kunnen overmatige dissociatietechnieken uw bevolking beïnvloeden.Algemene dissociatie is van cruciaal belang voor het bereiken van hoge celopbrengsten en een nauwkeurige weergave van de weefselsamenstelling. Gebruik daarna een filter van 40 micrometer bovenop de 50 milliliter conische buis om elk weefselmonster twee keer te filteren. Spoel het filter af met één procent BSA/HBSS.Na het centrifugeren van de monsters zoals beschreven in het manuscript, opnieuw opschorten de cel pellet in HBSS, met een procent BSA, met behulp van een breedboren tip, en plaats op ijs. De toevoeging van levensvatbaarheid kleurstof zal u helpen bij het optimaliseren van uw voorbereiding. Je moet streven naar ten minste 80 procent levensvatbare cellen.Eenmaal geoptimaliseerd, kunnen deze en andere kwaliteitscontrolestappen worden weggelaten om het dissociatieproces te bespoedigen, dat de RNA-kwaliteit beter zal behouden en celverlies zal verminderen. Om levensvatbare en gezonde cellen te isoleren met behulp van FACS, eerst 15 milliliter smalbodembuizen bereiden met acht milliliter ijskoude een procent BSA/ HBSS voor monstercollecties. Om ervoor te zorgen dat de interface tussen het oppervlak van de vloeistof en de binnenkant van de buis vochtig is en om statische en oppervlaktespanning te voorkomen, keren de buizen voor de verzamelingen om.Onmiddellijk na facs cel sorteren, zodra cellen worden verzameld in een 15 milliliter buis, gebruik maken van een milliliter van een procent BSA / HBSS te wassen en duw alle cellen naar beneden van het zijoppervlak van de buis. Centrifuge vervolgens elk monster op 260 g gedurende acht minuten. Na het weggooien van de supernatant, opnieuw opschorten de cel pellet in een procent BSA / HBSS, en voeg 33,8 microliters aan een buis, en houd die buis op ijs.Deze stap is ontworpen om te worden gedaan met behulp van reagentia verkregen uit een gestandaardiseerde kit. Alle aangetoonde stappen moeten worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Ter voorbereiding op gem generatie, plaats een chip in de chiphouder, de bereid een cel master mix op ijs, volgens het protocol van de fabrikant.Voeg 56,2 microliter van de master mix toe aan een buis met 33,8 microliter zelfsuspensie. Om de chip voor te bereiden, eerst op 50 procent glycerol aan de putten die niet zal worden gebruikt. Voeg vervolgens 90 microliters van de cel master mix goed een, 40 microliter van gel kralen tot goed twee, en 270 microliter van partitionering olie tot goed drie.Bedek de chip met een pakking. Als u de chip wilt laden en in een eencellige controller wilt uitvoeren, jectt u eerst de lade. Plaats de chip in de lade.Trek de lade in en druk op afspelen. Verzamel na de volledige run 100 microliter van het monster en plaats in een PCR-buis. Plaats PCR-buizen in een vooraf ingestelde PCR-machine en draait volgens de kit.Na de run, GEMs zal omvatten full-length, barcoded cDNA, van polyadenylated mRNA. Plaats de buizen op min 20 graden Celsius 's nachts. Ga verder met bibliotheekbouw, sequencing, uitlijning en analyse.Zodra monsters zijn gesequenced en uitgelijnd zoals beschreven in het manuscript, deponeren van de gegevens op een openbare repository, zoals NCBI's GEO. Om dit te doen, registreren voor de indiener account. Vul eerst de GEO-indiening in door het metagegevensblad te downloaden.Zorg ervoor dat u slechts één metagegevensblad per projectinzending opneemt. Plaats de spreadsheet in de map. Voeg ten tweede het ruwe gegevensbestand dat is gegenereerd uit het rapport voor het aantal cellenranger voor alle bibliotheken toe aan de map.De derde map bestaat uit verwerkte gegevensbestanden. Plaats verwerkte gegevensbestanden gegenereerd uit het count-script van de celranger voor alle bibliotheken in de map. Gebruik de FTP-serverreferenties van de GEO-indiener om de map met alle drie de componenten over te zetten.Na het uitvoeren van Cell Ranger kunnen analyseklare genbarcodematrices verder worden verwerkt met behulp van geavanceerde bioinformatica. Eerst werden voorbewerkingshoeveelheden controles uitgevoerd met behulp van het Seurat R-pakket, dat viool- en verstrooiingspercelen genereerde om het aantal genen, het aantal unieke moleculaire identificatiemiddelen en het percentage mitochondriale genen te visualiseren om cel doubletten en uitschieters te identificeren. Voor de selectie van de belangrijkste componenten of pc's werden elleboogpercelen gebruikt, waarbij pc's buiten het plateau van de standaarddeviatie van de pc-as werden uitgesloten.De resolutie van clustering werd ook gemanipuleerd. Lage resolutie leidde tot minder celclusters, waarbij elk cluster waarschijnlijk een gedefinieerd celtype vertegenwoordigt. Hoge resolutie leidde tot een hogere celkans, die subtypen of overgangstoestanden van een celpopulatie vertegenwoordigt.Clusterinstellingen met lage resolutie werden gebruikt voor verdere analyse van expressiewarmtekaarten om de meest uitgedrukte genen in een bepaald cluster te identificeren. Individuele kandidaat-genen werden gevisualiseerd op tSNE-plots, met behulp van Seurat's functieplotfunctie, die het mogelijk maakten te ontcijferen, of er clusters waren die bijvoorbeeld macrofagen vertegenwoordigden. Zowel cluster twee als vier uitgedrukte CD68, een pan-macrophage marker.Andere pakketten bieden ook tools voor kwaliteitscontrole, bijvoorbeeld Monocle, een R-pakket dat wordt gebruikt voor het bouwen van celtrajecten, verwijdert cellen van slechte kwaliteit en zorgt ervoor dat de verdeling van mRNA over alle cellen normaal is en tussen boven- en ondergrenzen valt. Enkele cellen werden vervolgens geclassificeerd en geteld, met behulp van bekende lijnmarkeringsgenen, en cellen die merkers van belang uitdrukken werden toegewezen aan celtype één. Er werd vastgesteld dat celtype nummer één fibroblasten waren.Deze populatie werd beoordeeld om fibroblasten ontwikkelingstraject te bouwen. Na deze procedure, andere methoden zoals kwantitatieve PCR, in situ hybridisatie, een immunistische chemie moet worden uitgevoerd om de nauwkeurigheid van uw genexpressie resultaten te valideren. Single-cell mRNA sequencing heeft nu de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op veel verschillende gebieden om de cel-naar-cel heterogeniteit te verkennen, en functionele dynamiek te identificeren in verschillende weefsels tijdens homeostase, en hoe deze kunnen veranderen na letsel of in ontwikkeling van de ziekte.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranucleaire micro-injectie van DNA in gedissocieerde Adult zoogdieren Neuronen

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissectie van organen van de Adult zebravis

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Meting van Heme Synthesis Levels in zoogdiercellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Anaërobe groei en het onderhoud van zoogdieren cellijnen

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 verrijkt de opbrengst van menselijke melanocyten uit volwassen huidweefsels

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Single Myofiber Culture Assay voor de beoordeling van volwassen spierstamcelfunctionaliteit Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...