Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
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Nous reconnaissons que le personnel de soutien à l’installation de Services de UCDNA, ainsi que le personnel de l’établissement animalier à l’Université de Calgary. Nous remercions Matt Workentine pour son soutien de bio-informatique et Jens Durruthy pour son soutien technique. Ce travail a été financé par une subvention des IRSC (R.M. et J.B.), une bourse de nouveau chercheur des IRSC à J.B. et l’Alberta Children Health Research Institute Fellowship (J.S.).

<ol>
	<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+for+cellular+variation.">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation.</a> Nature. 510, 363-369 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161, 1202-1214 (2015).</li><li>Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+single-cell+RNA-seq+analysis+landscape+with+the+scRNA-tools+database.">Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database.</a> bioRxiv:206573. , (2018).</li><li>Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+defines+heterogeneity+and+transcriptional+dynamics+in+the+adult+neural+stem+cell+lineage.">Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage.</a> Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).</li><li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+Reveals+a+Population+of+Dormant+Neural+Stem+Cells+that+Become+Activated+upon+Brain+Injury.">Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Schwann+Cells+from+Adult+Human+Skin+and+Nerve.">Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Agilent Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135">https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135</a> (2018)</li><li>Kolodziejczyk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+RNA-Sequencing+of+Pluripotent+States+Unlocks+Modular+Transcriptional+Variation.">Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation.</a> Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex.">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).</li><li>. Sequencing Requirements for Single Cell 3' Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3</a> (2018)</li><li>. Introduction to R Available from: <a target="_blank" href="https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r">https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Creating a Reference Package with cellranger mkref Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references</a> (2018)</li><li>. System Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements</a> (2018)</li><li>. Software Downloads Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</a> (2018)</li><li>. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization</a> (2018)</li><li>. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial</a> (2018)</li><li>. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data Available from: <a target="_blank" href="https://www.scrna-tools.org/">https://www.scrna-tools.org/</a> (2018)</li><li>. Downloading conda Available from: <a target="_blank" href="https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html">https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html</a> (2018)</li><li>. r / packages / r 3.5.1 Available from: <a target="_blank" href="https://anaconda.org/r/r">https://anaconda.org/r/r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. Seurat - Guided Clustering Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html">https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>Github. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).</li><li>. GenBank Submission Portal Wizards Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/</a> (2018)</li><li>. Submitting data Available from: <a target="_blank" href="https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/">https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/</a> (2018)</li><li>Shah, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+and+Fate+Mapping+of+Ependymal+Cells+Reveals+an+Absence+of+Neural+Stem+Cell+Function.">Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function.</a> Cell. 173, 1045-1057 (2018).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11, 1 (2013).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144, 3625-3632 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96, 313-329 (2017).</li><li>Zeigenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+states+versus+single-cell+atlases+-+two+classes+of+heterogeneity+that+differ+in+meaning+and+method.">Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method.</a> Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).</li><li>Herman, J. S., Sagar, D., Gr&#252;n, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FateID+infers+cell+fate+bias+in+multipotent+progenitors+from+single-cell+RNA-seq+data.">FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data.</a> Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).</li></ol>

Aucune divulgation

Ce protocole montre comment la préparation adéquate des cellules simples peut découvrir l’hétérogénéité transcriptionnelle de milliers de cellules individuelles et discriminer les États fonctionnels ou identités cellulaires uniques au sein d’un tissu. Le protocole n’exige pas de protéines fluorescentes journaliste ou outils transgéniques et peut être appliqué à l’isolement de cellules isolées de divers tissus d’intérêt, y compris ceux de l’homme ; gardant à l’esprit de chaque tissu est unique et ce protocole exigera une certaine adaptation ou la modification.
Les programmes de transcriptional diversifiés et très dynamiques au sein de cellules ont souligné la valeur de la cellule unique génomique. En dehors d’isoler l’ARN de haute qualité, une étape de préparation d’échantillon critique nécessaire pour les ensembles de données de haute qualité est de s’assurer que les cellules sont complètement libérés du tissu et que les cellules sont sains et intacts. C’est relativement simple pour prélever des cellules qui sont facilement mises, comme les cellules circulantes ou dans les tissus où les cellules sont plus ou moins conservés, comme dans les tissus lymphoïdes. Mais cela peut être difficile pour les autres tissus adultes, en raison de l’architecture cellulaire hautement développée, s’étendant sur grandes distances, entourant la matrice extracellulaire et les protéines du cytosquelette souvent rigides impliqués dans le maintien de la structure cellulaire. Même avec des techniques de dissociation appropriées pour la libération totale des cellules, il est possible que le traitement souvent long et rigoureux nécessaire modifierait intégrité de qualité et de la cellule de mRNA. En outre, les hautes températures utilisées pour la dissociation assistée par enzyme affectent également la transcription signatures29,30. Le but du protocole est de présenter le contrôle de la qualité vérifie, à l’aide de tissus tels que le nerf adult myélinisée et la peau adulte riches en matrice extracellulaire pour démontrer comment l’optimisation peut aider à surmonter ces obstacles.
Une considération importante lors de la conception de toute expérience de scRNA-Seq est le choix de la profondeur de séquençage. Séquençage peut être hautement multiplexé et lu profondeur peut varier d’une très faible à l’aide de Drop-Seq2 et jusqu'à 5 millions de lectures/cellule14 en utilisant une méthode de RNA-Seq longue tels que Smart-suiv. Plupart des expériences de scRNA-Seq peuvent détecter des transcriptions de modérée à forte expression avec le séquençage aussi bas que 10 000 lectures/cellule, qui est généralement suffisant pour cellule type classification41,,42. Profondeur de séquençage peu profonde est précieux pour économiser sur les coûts de séquençage en essayant de détecter des populations cellulaires rares à travers les tissus complexes où des milliers de cellules peuvent être nécessaire d’attribuer avec certitude les populations rares. Mais le séquençage de faible profondeur n’est pas suffisant lorsque des informations détaillées sur l’expression des gènes et des processus associées aux signatures de transcriptionnelles subtiles sont nécessaires. Actuellement, on estime que la grande majorité des gènes dans une cellule est détectée avec 500 000 lectures/cellule, mais cela peut varier selon le protocole et le tissu type43,44. Tandis que la transcription du séquençage contourne la nécessité pour l’Assemblée et peut, par conséquent, détecter roman ou épissure rares variantes, coûts de séquençage limitent souvent mise à l’échelle de telles approches afin d’examiner des milliers de cellules comprenant un système complexe de tissus. En revanche, 3' tag libraries unicellulaires tels que ceux décrits dans le présent protocole en général ont plus faible complexité et requièrent moins profond séquencement. Il est important de noter que bibliothèques générés à l’aide du protocole décrit peuvent être séquencés sur l’un des cinq séquenceurs supportés : 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 course rapide et High Output, 4) NextSeq 500/550 et MiSeq 5).
Une approche alternative à cellule unique RNA-Seq, qui réduit la nécessité pour les tissus délicats et cellule gère encore conserve certains des avantages d’une seule cellule RNA-Seq, est l’analyse de l’ARN de noyaux unique45. Cette approche permet un traitement plus rapid, réduire la dégradation de l’ARN et plus des mesures extrêmes pour assurer une diffusion adéquate des noyaux et donc probablement permet une capture plus confiante des profils transcriptionnels qui représente toutes les cellules dans un tissu donné. Ceci, bien sûr, seulement fournirait une partie de l’activité transcriptionnelle présente dans une cellule donnée, donc selon quels objectifs expérimentaux sont d’intérêt de cette approche peut ou peut ne pas convenir.
Sans compter que la caractérisation complète des identités cellulaires au sein d’un tissu donné, une des analyses plus précieux pour les ensembles de données scRNA-Seq est l’évaluation des États intermédiaires de transcriptional parmi les populations cellulaires « définie ». Ces États intermédiaires peuvent donner un aperçu des relations de lignée entre cellules au sein de populations identifiées, ce qui n’était pas possible avec la traditionnelle en vrac que RNA-Seq s’approche. Plusieurs outils bioinformatiques de scRNA-Seq ont maintenant été développés afin d’élucider ce. Ces outils peuvent évaluer les processus impliqués dans, par exemple, les cellules cancéreuses la transition vers un état oncogènes ou métastatique, venant à échéance dans divers destins terminales ou navette entre États quiescentes et actives les cellules immunitaires des cellules souches. Transcriptome de subtiles différences dans les cellules peuvent également être indicatives des biais de lignage, bioinformatique récemment mis au point des outils tels que FateID, peut déduire47. Étant donné que les distinctions entre les cellules de transition peuvent être difficiles à déterminer compte tenu des différences de transcriptionnelles peut être subtile, séquençage plus profond peut être nécessaire de46. Heureusement, la couverture d’une bibliothèque très superficiellement séquencée peut être augmentée si vous êtes intéressé dans la détection de l’ensemble de données plus loin en exécutant à nouveau la bibliothèque sur une autre cellule de flux.
Globalement, ce protocole prévoit un flux de travail facile-à-adaptation qui permet aux utilisateurs de profil transcriptionnellement des centaines de milliers de cellules au sein d’une expérience unique. La qualité finale d’un dataset scRNA-Seq repose sur l’isolement cellulaire optimisée, la cytométrie en flux, cDNA bibliothèque génération et interprétation des matrices de gène-code à barres brutes. À cette fin, le présent protocole donne un aperçu détaillé de toutes les étapes clés qui peuvent être facilement modifiées pour permettre des études de types de tissus différents.

Avec le développement du haut débit unicellulaire technologie1,2 et les avancements dans les outils de bio-informatique conviviale au cours de la dernière décennie3, un nouveau champ d’analyse de l’expression génique à haute résolution est apparu – séquençage de RNA unicellulaires (scRNA-Seq). L’étude de l’expression génique cellulaire unique est d’abord développée pour identifier l’hétérogénéité au sein de populations de cellules définis, tels que dans les cellules souches ou cellules cancéreuses, ou pour identifier les rares populations de cellules4,5, qui étaient inaccessibles à l’aide techniques de séquençage de RNA traditionnelles en vrac. Outils bioinformatiques ont permis l’identification de nouveaux sous-groupes (Seurat)2, visualisation de l’ordre de cellules le long d’un psuedotime espace (Monocle)6, définition des réseaux de signalisation actifs au sein ou entre populations ( SCENIC)7, prédiction de l’Assemblée de cellules unique dans un espace 3D artificiel (Seurat, etc.)8. Avec ces analyses nouvelles et passionnantes dont dispose la communauté scientifique, scRNA-Seq rapide-devient la nouvelle approche standard pour l’analyse de l’expression génique.
Malgré l’énorme potentiel de scRNA-Seq, les niveaux de compétences techniques nécessaire pour produire un ensemble de données propre à interpréter correctement les résultats peut être difficile aux nouveaux arrivants. Ici, un protocole de base, mais complet, à partir de l’isolement des cellules individuelles de tissus ensemble primaires à la visualisation et la présentation des données pour publication est présenté (Figure 1). Tout d’abord, l’isolement de cellules individuelles en bonne santé peut être réputé difficile, puisque les différents tissus varient dans leur degré de sensibilité à la digestion enzymatique et dissociation mécanique ultérieure. Ce protocole donne des indications à ces mesures d’isolement et identifie les points de contrôle importants de contrôle de qualité tout au long du processus. En second lieu, il peut être déroutant de comprendre la compatibilité et les exigences entre la technologie de cellule unique et séquençage de prochaine génération. Ce protocole fournit des directives pour mettre en œuvre une plate-forme conviviale, axée sur les gouttelettes barcoding unicellulaires et effectuez le séquençage. Enfin, la programmation informatique est une condition préalable importante pour l’analyse des ensembles de données transcriptomiques unicellulaires. Ce protocole fournit des ressources pour débuter avec le langage de programmation R et fournit des conseils sur la mise en œuvre de deux paquets de R scRNA-Seq-specific populaires. Ensemble, ce protocole peut guider les nouveaux arrivants en analyse scRNA-Seq pour obtenir des résultats clairs et interprétables. Ce protocole peut être ajusté à la plupart des tissus chez la souris et ce qui est important, pourrait être modifié pour être utilisé avec d’autres organismes, y compris les tissus humains. Ajustements selon le tissu et l’utilisateur sera nécessaires.
Il y a plusieurs considérations à garder à l’esprit tout en suivant ce protocole ; y compris, 1) à la suite toutes les directives de contrôle de la qualité aux étapes 1 et 2 du présent protocole est recommandée pour assurer une suspension monocellulaire viable de toutes les cellules de l’échantillon d’intérêt tout en assurant la précision totale numéros globules (résumées dans Figure 2 ). Une fois que cela est possible, et si toutes les conditions optimisées sont suivies, les mesures de contrôle de la qualité peuvent être déposés (pour gagner du temps - préserver la qualité de RNA réduisant cellulaires et perte). Confirmant la réussite de l’isolement de cellules uniques de grande viabilité des tissus d’intérêt est hautement recommander avant tout en aval de traitement. 2) étant donné que certains types de cellules sont plus sensibles que d’autres au stress, techniques de dissociation excessive peuvent biaiser par inadvertance de la population, donc confusion analyse en aval. Dissociation douce sans cisaillement cellulaires inutiles et la digestion est essentielle pour atteindre des rendements élevés de cellulaires et une représentation exacte de la composition du tissu. Forces de cisaillement se produisent au cours des étapes de trituration, FACS et la remise en suspension. 3) comme avec n’importe quel travail d’ARN, est-il préférable d’introduire comme peu RNase supplémentaire dans l’échantillon que possible au cours de la préparation. Cela aidera à maintenir la qualité RNA. Utiliser des solutions d’inhibiteur de la ribonucléase avec rinçage à nettoyer l’outillage et tout matériel qui n’est pas exempte de RNase mais éviter les produits traités DEPC. 4) effectuer des préparations aussi rapidement que possible. Cela aidera à maintenir la qualité RNA et réduire la mort cellulaire. Selon la longueur de la dissection des tissus et plusieurs animaux, considère la création de multiples dissections/préparations en même temps. 5) préparer les cellules sur la glace si possible de maintenir la haute qualité RNA, réduire la mort cellulaire et ralentir l’activité transcriptionnelle et de signalisation de cellules. Quoique, traitement glacée est idéal pour la plupart des types de cellules, certains types de cellules (par exemple, neutrophiles) performants lors du traitement à température ambiante. 6) éviter le calcium, magnésium, EDTA et les produits traités DEPC au cours de la préparation de cellules.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

L’analyse de l’expression génique cellulaire unique sur des milliers de différentes cellules dans un tissu ou un micro-environnement est un outil précieux pour identifier la composition cellulaire, la discrimination des États fonctionnels et les voies moléculaires qui sous-tendent les tissus observés fonctions et les comportements animaux. Toutefois, l’isolement des monocellules intacts, sains provenant de tissus de mammifères adultes pour l’analyse moléculaire ultérieures unicellulaire en aval peut être difficile. Ce protocole décrit les processus générales et contrôle qualité vérifie nécessaires pour obtenir des préparations de qualité adult unicellulaire du système nerveux ou de la peau qui activé l’analyse et le séquençage d’ultérieures unicellulaire impartiale RNA. Lignes directrices pour l’analyse bioinformatique en aval sont également fournis.

Le répertoire des paquets open source conçu pour analyser des ensembles de données scRNA-Seq a considérablement augmenté40 avec la majorité de ces utilisation de paquets langages basés sur R3. Ici, les résultats représentatifs à l’aide de deux de ces paquets sont présentés : évaluer groupement sans surveillance de simple basés sur l’expression des gènes des cellules et ordonnant des cellules isolées le long d’une trajectoire afin de résoudre l’hétérogénéité de cellules et déconstruire biologique processus.
La figure 4 illustre l’utilisation de Seurat pour pré-traitement des contrôles de qualité et analyse bioinformatique en aval. Tout d’abord, filtration et élimination des cellules déviantes de l’analyse est essentielle pour le contrôle de la qualité. Cela a été fait à l’aide de violon (Figure 4 a) et nuages de points XY complote (Figure 4 b) pour visualiser le pourcentage de gènes mitochondriaux, nombre de gènes (nGene) et nombre de UMI (nUMI) pour identifier les doublets de cellule et de valeurs aberrantes. N’importe quelle cellule avec un nombre de claire aberrantes de gènes, UMI ou le pourcentage de gènes mitochondriaux a été supprimé à l’aide de la fonction FilterCells de Seurat. Depuis Seurat utilise des composantes principales (PC) analyse scores aux cellules de grappes, déterminer PCs statistiquement significatifs à inclure est une étape cruciale. Parcelles de coude (Figure 4C) ont été utilisés pour la sélection de PC, dans lequel PCs au-delà du plateau de le « écart-type de PC » axe ont été exclus. La résolution de clustering a été également manipulée ce qui démontre que le nombre de clusters peut être modifié, allant de 0,4 (basse résolution conduisant à moins agrégats cellulaires, Figure 4D) à 4 (haute résolution conduisant à la plus élevées agrégats cellulaires, Figure 4e ). À basse résolution, il est probable que chaque cluster représente un type de cellule définie, tandis qu’à haute résolution, cela peut aussi représenter sous-types ou États transitoires d’une population de cellules. Dans ce cas, des paramètres de cluster basse résolution ont été utilisés pour analyser les heatmaps expression (à l’aide de la fonction DoHeatmap Seurat) pour identifier les gènes exprimés plus fortement dans un cluster donné (Figure 4f). Dans ce cas, les gènes plus fortement exprimés ont été identifiés en évaluant l’expression différentielle dans un cluster donné par rapport à tous les autres groupes combinés, démontrant que chaque grappe était particulièrement bien représenté par gènes définis. En outre, les gènes candidats individuels peuvent être visualisées tSNE parcelles à l’aide de la fonction FeaturePlot de Seurat (Figure 4 g). Ceci permettait à déchiffrer s’il existait des clusters qui représentaient des macrophages. À l’aide de FeaturePlot, nous avons constaté que les deux cluster 2 et 4 exprimaient Cd68 - un marqueur de pan-macrophage.
Le paquet de Monocle servait pour corroborer des agrégats cellulaires identifiés à Seurat et créer des trajectoires de la cellule, ou une commande pseudotemporal, à récapituler les processus biologiques (Figure 5). Commande pseudotemporal peut être utilisé pour les échantillons où les profils d’expression unicellulaires sont censées suivre une évolution biologique. Les cellules peuvent être commandés selon un continuum pseudotemporal pour résoudre les États intermédiaires, des points de bifurcation des deux destins cellulaires alternatifs et identifient les signatures de gène qui sous-tendent l’acquisition de chaque sort. Tout d’abord, semblable à la filtration de Seurat, cellules de mauvaise qualité ont été retirés de telle sorte que la répartition des ARNm entre toutes les cellules était log normale et est tombé entre les limites supérieures et inférieures, tel qu’indiqué dans la Figure 5 a. Ensuite, les cellules individuelles en utilisant la fonction newCellTypeHierarchy de Monocle, ont été classés et compté à l’aide de gènes marqueurs de la lignée connue (Figure 5 b, 5C). Par exemple, les cellules exprimant le PDGF récepteurs alpha ou fibroblastes spécifiques Protein 1 ont été assignés à cellule Type #1 pour créer un critère de définition des fibroblastes. Ensuite, cette population (cellule Type #1) a été évaluée pour déchiffrer les trajectoires des fibroblastes. Pour ce faire, fonction de GeneTest différentielle de Monocle a été utilisée, qui comparé les cellules représentant les États extrêmes au sein de la population et trouvé les gènes différentiels pour commander les cellules restantes dans la population (Figure 5 d). En appliquant des méthodes d’apprentissage multiples (un type de réduction dimensionnelle non-linéaire) dans l’ensemble de toutes les cellules, une coordonnée le long d’un chemin de pseudotemporal a été affectée. Cette trajectoire a été visualisée ensuite par la cellule état (Figure 5e) et pseudotime (Figure 5f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> Figure 1 : organigramme. Étapes de préparation animale à analyser seule cellule RNA-Seq datasets à la présentation finale datasets vers un référentiel accessible au public. Billes de gel en émulsion (GEMs) se référer aux billes avec des oligonucléotides avec code à barres qui encapsulent des milliers de cellules individuelles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> Figure 2 : création de suspension monocellulaire viable du tissu nerveux. (a) dessin animé vue d’ensemble des contrôles de qualité. (b) les cellules et les débris de cellules encore incorporés dans les débris (flèches rouges). (c) cellules libérés de débris (flèches rouges). d cellule isolation par FACS. P0 : fraction de débris ; P1 : fraction de cellules ; P3 : exclusion des duolets ; P4 : fraction de négatif viabilité colorant (Sytox Orange). e aucun contrôle de colorant de viabilité. (f) image de P0 fraction représentant isolé des débris. (g) l’image de P4 fraction représentant isolé des cellules viables (flèches rouges). (b) (c) (f) et (g) avait nucléaire colorant ajouté 20 minutes avant l’imagerie. Barreaux de l’échelle : 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> Figure 3 : séquençage peu profond prédit le nombre de cellules récupérées dans 10 X les échantillons traités. un exemple (échantillon 1.6) du csv générés par MiSeq liste cellule codes-barres et ses correspondant UMI compte tel que déterminé par lectures mappés en toute confiance. (b) code à barres rang tracé pour échantillon 1.6 montre une baisse significative au comte UMI en fonction de la cellule des codes à barres. Les lignes en pointillés et solides représentent le niveau de la coupure entre les cellules et fond tel que déterminé par inspection visuelle. (c) codes à barres cellules observées à l’aide de la cellule Ranger pipeline post-HiSeq révèle peu profond séquencement approximée avec précision le nombre de cellules pour échantillon 1.6. (d) un exemple d’une mise en place de flux-cellule basée sur le séquençage peu profond dérivé estimations de la cellule. Pour échantillon 1.6, car peu profond séquencement prédit 3480 cellules, 1,17 voies ont été assignés pour assurer > 100 000 lectures par la couverture de séquençage de cellule en HiSeq. Remarque : Toutes les voies doivent ajouter à 100 %. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> Figure 4 : contrôle de la qualité et de la bioinformatique des unicellulaires RNA-Seq dataset à l’aide de progiciel Seurat R. b les parcelles de paramètres de contrôle de la qualité incluent le nombre de gènes, nombre d’identificateurs moléculaires uniques (UMIs) et le pourcentage des transcriptions mappage sur le génome mitochondrial. b gène de l’échantillon parcelles detecter des cellules avec des niveaux déviants des transcriptions mitochondriales et UMIs. (c) coude placette utilisé pour ad hoc détermination du PCs statistiquement significatives. Les lignes en pointillés et discontinue dot représentent le seuil où un « coude » net apparaît dans le graphique. Dimensions de PC avant ce coude sont incluses dans l’analyse en aval. (d, e) Amas de cellule basée sur les graphiques visualisés à deux résolutions différentes dans un espace de faibles dimensions à l’aide d’un tracé tSNE. (f) top gènes marqueurs (jaunes) pour chaque cluster visualisées sur un heatmap d’expression à l’aide de la fonction DoHeatmap de Seurat. (g) visualiser l’expression du marqueur de, par exemple, les gènes Cd68 représentant des macrophages (violets) à l’aide de la fonction FeaturePlot de Seurat. Ceci suggère que ce cluster 2 et 4 (en panneau d) de ce groupe de données représente des macrophages. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> Figure 5 : cellule de catégorisation et ordonnant le long de la trajectoire de peudotemporal à l’aide de Monocle toolkit. b inspecter la distribution de l’ARNm (déduite des comtes UMI) dans l’ensemble de toutes les cellules dans un échantillon. Seulement les cellules avec l’ARNm entre 0 - ~ 20 000 ont été utilisées pour l’analyse en aval. (b, c) L’assignation et comptage des types cellulaires issus des marqueurs de cellules de lignée connue. Par exemple, les cellules exprimant le PDGF récepteurs alpha ou fibroblastes spécifiques Protein 1 ont été assignés à la cellule Type #1 représentant pan-fibroblastes en utilisant la fonction newCellTypeHierarchy de Monocle. Nombre de différents types de cellules peut être visualisée sous forme de diagramme circulaire (b) et sous forme de tableau (c). (d) à l’aide de cellules Type #1 (fibroblastes) à titre d’exemple, les gènes utilisés pour commander les cellules peuvent être visualisées à l’aide d’un diagramme de dispersion qui montre la dispersion des gènes vs expression moyenne. La courbe rouge montre la coupure pour gènes utilisées pour le classement calculé par le modèle moyenne-variance à l’aide de la fonction estimateDispersions de Monocle. Les gènes qui répondent à ce seuil de décision ont été utilisés pour la commande pseudotime en aval. (e, f) Visualisation des trajectoires de cellule dans un espace réduit bidimensionnel colorée par « État » de la cellule (e) et attribué Monocle « Pseudotime » (f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Ce protocole décrit les processus générales et contrôle qualité vérifie nécessaire pour la préparation de cellules unique chez les mammifères adultes saines pour les préparations de RNA-Seq cellule unique axée sur la gouttelette, haut débit. Séquençage des paramètres, l’alignement de lecture et l’analyse bioinformatique de cellule unique en aval sont également fournis.

Transcriptomique cellule unique axée sur le codage à barres de gouttelettes de tissus de mammifères adultes

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que la compréhension des changements d’expression génétique à travers des milliers de cellules individuelles après une blessure ou une maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de disséquer les transcriptomes des cellules individuelles dans un tissu complexe, et de mieux apprécier la dynamique fonctionnelle au sein d’une population donnée. L’avantage de notre protocole est qu’il fournit des méthodes complètes, de l’isolement des cellules individuelles dans les tissus primaires, à l’analyse et la visualisation de cet ensemble de données.Bien que cette méthode commence à partir de suspensions unicelluliques de la peau et du nerf, les méthodes de séquençage que nous décrivons peuvent être appliquées pour étudier n’importe quel tissu mammifère. Elodie Labit et Wisoo Shin, deux stagiaires de mon laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Pour commencer, disséquer le nerf sciatique d’une souris euthanasiée en coupant d’abord la peau loin de la région postérieure de l’arrière de la souris.Utilisez une lame stérile de scalpel pour faire une incision le long de la longueur de la cuisse. Ensuite, utilisez des forceps fins et des ciseaux pour exposer et enlever le nerf sciatique. Pour disséquer la peau dorsale du dos, utilisez des forceps fins et des ciseaux pour faire des incisions d’épaule en épaule, à travers la croupe, et dans le dos.Lavez les tissus deux fois avec du HBSS glacé. Sous un microscope disséquant, enlever les tissus conjonctifs indésirables, les dépôts graisseux ou les débris. Pour la peau seulement, couper la peau en fines tranches, à l’aide d’une lame de scalpel stérile.Pour obtenir le derme cutané, faire flotter les tranches de peau dans le dispase, dans HBSS dans un plat de 10 centimètres, pendant 30 à 40 minutes à 37 degrés Celsius. Utilisez des forceps fins pour peler et séparer l’épiderme du derme, puis jetez l’épiderme. Ensuite, pour la peau et les nerfs, utilisez une paire de lames de scalpel de stérilisation pour hacher chaque échantillon en un à deux millimètres.Placez les morceaux de tissu en enzyme collagène froide fraîchement décongelée, deux grammes par millilitre de collagène froid-quatre dans un tube conique de 15 millilitres. Incuber chaque échantillon dans l’enzyme dans un bain de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec des secousses douces toutes les 10 minutes. À 30 minutes, utiliser un pipetter P1000 pour triturer le tissu 20 à 30 fois, et retourner au bain d’eau.Répétez la trituration toutes les 30 minutes jusqu’à ce que la solution semble trouble et que des morceaux de tissu soient en grande partie dissociés. Pour la peau seulement, dans la dernière heure d’incubation, ajouter un milligramme par millilitre DNAse à l’échantillon de peau. Puisque certains types de cellules sont plus sensibles que d’autres au stress mécanique, les techniques de dissociation excessive peuvent biaiser votre population.La dissociation générale est essentielle pour atteindre des rendements cellulaires élevés, et une représentation précise de la composition des tissus. Après cela, utilisez un filtre de 40 micromètres sur le dessus du tube conique de 50 millilitres pour filtrer chaque échantillon de tissu deux fois. Rincez le filtre avec un pour cent de BSA/HBSS.Après avoir centrifugé les échantillons tels que décrits dans le manuscrit, suspendez à nouveau la pastille cellulaire dans HBSS, contenant un pour cent de BSA, à l’aide d’une pointe à alésage large, et placez-la sur la glace. L’ajout d’un colorant de viabilité vous aidera à optimiser votre préparation. Vous devez viser au moins 80 pour cent de cellules viables.Une fois optimisées, cette étape et d’autres étapes de contrôle de la qualité peuvent être omises afin d’accélérer le processus de dissociation, ce qui permettra de mieux préserver la qualité de l’ARN et de réduire la perte cellulaire. Pour isoler les cellules viables et saines à l’aide du FACS, préparez d’abord des tubes à fond étroit de 15 millilitres avec huit millilitres de BSA/HBSS glacé pour les collections d’échantillons. Pour s’assurer que l’interface entre la surface du liquide et l’intérieur du tube est humide, et pour éviter la tension statique et de surface, inverser les tubes avant les collections.Immédiatement après le tri cellulaire facs, une fois que les cellules sont recueillies dans un tube de 15 millilitres, utilisez un millilitre de un pour cent BSA / HBSS pour laver et pousser toutes les cellules vers le bas de la surface latérale du tube. Ensuite, centrifugeuse chaque échantillon à 260 g pendant huit minutes. Après avoir jeté le supernatant, suspendez la pastille cellulaire en un pour cent BSA/HBSS, et ajoutez 33,8 microlitres à un tube, et gardez ce tube sur la glace.Cette étape est conçue pour être effectuée à l’aide de reagents obtenus à partir d’un kit normalisé. Toutes les étapes démontrées doivent être effectuées selon les instructions du fabricant. Pour se préparer à la génération GEM, placez une puce dans le porte-puce, préparez un mélange maître cellulaire sur la glace, selon le protocole du fabricant.Ajouter 56,2 microlitres du mélange principal à un tube contenant 33,8 microlitres d’auto-suspension. Pour préparer la puce, d’abord à 50 pour cent de glycérol pour les puits qui ne seront pas utilisés. Ajouter ensuite 90 microlitres du mélange maître cellulaire au puits un, 40 microlitres de perles de gel au puits deux, et 270 microlitres d’huile de partitionnement au puits trois.Couvrir la puce d’un joint. Pour charger la puce et exécuter dans un contrôleur à cellule unique, éjectez d’abord le plateau. Placez la puce dans le plateau.Rétractez le plateau et appuyez sur jouer. Après la course complète, recueillir 100 microlitres de l’échantillon, et placer dans un tube PCR. Placez les tubes PCR dans une machine PCR prédéfinise, et exécutez selon le kit.Après la course, les GEM incluront l’ADND à code à barres pleine longueur, provenant de l’ARNm polyadéthylé. Placez les tubes à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Procédez à la construction, au séquençage, à l’alignement et à l’analyse de la bibliothèque.Une fois que les échantillons sont séquencés et alignés comme décrit dans le manuscrit, déposez les données sur un référentiel public, tel que GEO de NCBI. Pour ce faire, inscrivez-vous au compte de soumission. Tout d’abord, remplissez la soumission GEO en téléchargeant la feuille de métadonnées.Assurez-vous d’inclure une seule feuille de métadonnées par soumission de projet. Placez la feuille de calcul dans l’annuaire. Deuxièmement, ajoutez le fichier de données brutes généré à partir du script de compte de garde-cellule pour toutes les bibliothèques dans l’annuaire.Le troisième dossier est traité fichiers de données. Placez les fichiers de données traités générés à partir du script de compter des gardes cellulaires pour toutes les bibliothèques dans l’annuaire. Utilisez les informations d’identification du serveur FTP de l’auteur geo pour transférer l’annuaire contenant les trois composants.Après l’exécution de Cell Ranger, les matrices de codes à barres génétiques prêtes à l’analyse peuvent être traitées à l’aide de bioinformatiques avancées. Premièrement, des vérifications quantitatives préalables au traitement ont été effectuées à l’aide de l’emballage Seurat R, qui a généré des parcelles de violon et de dispersion pour visualiser le nombre de gènes, le nombre d’identificateurs moléculaires uniques et le pourcentage de gènes mitochondriaux pour identifier les doublets cellulaires et les valeurs aberrantes. Pour la sélection des composants principaux, ou PC, des parcelles de coude ont été utilisées, dans lesquelles des PC au-delà du plateau de l’écart type de l’axe de PC, ont été exclus.La résolution du regroupement a également été manipulée. La faible résolution a conduit à moins de clusters cellulaires, chaque cluster représentant probablement un type de cellule défini. La haute résolution a conduit à une probabilité cellulaire plus élevée, représentant des sous-types, ou états transitoires, d’une population cellulaire.Les paramètres des grappes à basse résolution ont été utilisés pour une analyse plus approfondie des cartes thermiques d’expression afin d’identifier les gènes les plus fortement exprimés dans un cluster donné. Les gènes candidats individuels ont été visualisés sur des parcelles tSNE, à l’aide de la fonction d’intrigue caractéristique de Seurat, qui permettait de déchiffrer, s’il y avait des clusters qui représentaient, par exemple, des macrophages. Les deux groupes deux et quatre ont exprimé CD68, un marqueur pan-macrophage.D’autres paquets fournissent également des outils pour le contrôle de la qualité, par exemple, Monocle, un ensemble R utilisé pour la construction de trajectoires cellulaires, élimine les cellules de mauvaise qualité, et assure que la distribution de l’ARNm dans toutes les cellules est normale, et est tombé entre les limites supérieure et inférieure. Des cellules simples ont ensuite été classifiées et comptées, utilisant des gènes connus de marqueur de lignée, et des cellules exprimant des marqueurs d’intérêt ont été assignées au type de cellule numéro un. Il a été déterminé que le type de cellule numéro un étaient des fibroblastes.Cette population a été évaluée pour construire la trajectoire développementale des fibroblastes. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la PCR quantitative, l’hybridation in situ, une chimie immuniste devraient être effectuées pour valider l’exactitude des résultats de votre expression génétique. Le séquençage de l’ARNm à cellules simples a maintenant ouvert la voie à des chercheurs dans de nombreux domaines différents afin d’explorer l’hétérogénéité cellule à cellule et d’identifier la dynamique fonctionnelle dans différents tissus pendant l’homéostasie, et comment ceux-ci peuvent changer après une blessure ou dans le développement d’une maladie.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Microinjection d&#39;ADN dans intranucléaires Dissocié neurones de mammifères adultes

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Recherche

Biologie

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

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EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

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Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Profilage Single Cell transcriptionnelle des cardiomyocytes de souris adultes

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Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

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Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation

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