Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Wir anerkennen die Support-Mitarbeiter in der UCDNA-Dienstleistungen-Anlage sowie die Animal Care Mitarbeiter der Einrichtung an der University of Calgary. Wir danken Matt Workentine für seine Unterstützung der Bioinformatik und Jens Durruthy für seine technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde finanziert durch einen CIHR Zuschuss (r.m. und j.b.), ein CIHR neue Investigator Award, j.b. und eine Alberta Kinder Health Research Institute Fellowship (j.s.).

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Keine Angaben

Dieses Protokoll zeigt, wie die angemessene Vorbereitung einzelner Zellen entdecken die transkriptionelle Heterogenität aus Tausenden von einzelnen Zellen und Funktionszustände oder einzigartige zelluläre Identitäten innerhalb eines Gewebes zu unterscheiden kann. Das Protokoll erfordert keine Reporter fluoreszierende Proteine oder transgenen Werkzeuge und kann auch auf die Isolierung einzelner Zellen aus verschiedenen Geweben von Interesse, die auch von Menschen; unter Berücksichtigung jedes Gewebe ist einzigartig und dieses Protokoll erfordert ein gewisses Maß an Anpassung/Änderung.
Die vielfältigen und höchst dynamischen transkriptionelle Programme innerhalb von Zellen betonten den Wert der einzelligen Genomics. Neben qualitativ hochwertigen RNA zu isolieren, ist eine kritische Probe Vorbereitungsschritt für qualitativ hochwertige Datensätze notwendig sicherzustellen, dass Zellen vollständig aus Gewebe freigesetzt werden und Zellen gesund und intakt sind. Dies ist relativ geradlinig für Sammeln von Zellen, die leicht sind veröffentlichte z. B. zirkulierenden Zellen oder Geweben, wo Lose Zellen beibehalten werden, z. B. in lymphatischen Geweben. Dies kann jedoch eine Herausforderung für andere adulten Geweben aufgrund der hoch entwickelten zellulären Architektur über große Entfernungen, umgebenden extrazellulären Matrix und die oft starren Zellskelett Proteine, die bei der Aufrechterhaltung der Zellstruktur. Auch mit entsprechenden Dissoziation Techniken für die Vollversion von Zellen gibt es Potenzial, dass die strenge und oft langwierige Verarbeitung erforderlich mRNA Qualität und Zelle Integrität verändern würde. Darüber hinaus wirken sich die hohen Temperaturen verwendet für Enzym-gestützte Dissoziation auch transkriptionelle Signaturen29,30. Die Absicht des Protokolls ist vorzulegen Qualitätskontrolle prüft mit Geweben wie Markhaltige Erwachsenen Nerven und der extrazellulären Matrix-reiche Erwachsene Haut, um zu demonstrieren wie Optimierung kann helfen, um diese Hindernisse zu überwinden.
Ein wichtiger Aspekt bei der Gestaltung jedes ScRNA-Seq-Experiment ist die Wahl der Sequenzierung Tiefe. Sequenzierung hoch gemultiplext und gelesen werden kann Tiefe kann variieren von sehr niedrigen mit Drop-Seq2 auf bis zu 5 Millionen Mal gelesen/Zelle14 mit einer Full-length RNA-Seq-Methode wie Smart-seq. Die meisten ScRNA-Seq Experimente erkennt mäßigen bis hohen Ausdruck Protokolle mit Sequenzierung so niedrig wie 10.000 mal gelesen/Zelle, was für Zelle Art Klassifikation41,42in der Regel ausreichend ist. Flache Sequenzierung Tiefe ist der Wert bei Sequenzierung Kosten sparen, wenn Sie versuchen, seltene Zellpopulationen über komplexe Gewebe erkennen, wo Tausende von Zellen erforderlich ist, um selbstbewusst seltenere Populationen zuschreiben. Aber geringer Tiefe Sequenzierung ist nicht ausreichend, wenn detaillierte Informationen über Genexpression und Prozesse im Zusammenhang mit subtilen transkriptionelle Unterschriften notwendig ist. Derzeit wird geschätzt, dass die große Mehrheit der Gene in einer Zelle mit 500.000 mal gelesen/Zelle, erkannt werden, aber dies je nach Protokoll variieren kann und Gewebe Typ43,44. Während in voller Länge Abschrift Sequenzierung die Notwendigkeit für die Montage umgeht und daher, Roman oder seltene Splice-Varianten erkennen kann, begrenzt Sequenzierung Kosten oft Skalierung solche Ansätze um Tausende von Zellen bestehend aus einem komplexe Gewebe-System zu untersuchen. Im Gegensatz dazu getaggt 3' einzellige Bibliotheken wie beschrieben in diesem Protokoll in der Regel geringeren Komplexität haben und flacheren Sequenzierung erforderlich. Es ist wichtig zu beachten, dass Bibliotheken generiert mit dem beschriebenen Protokoll auf einem der fünf unterstützten Sequenzer sequenziert werden können: (1) NovaSeq, (2) Leseweite 3000/4000 (3) Leseweite 2500 schnellen Lauf und hohe Leistung, (4) NextSeq 500/550 und (5) MiSeq.
Ein alternativer Ansatz zur einzelnen Zelle RNA-Seq, der reduziert die Notwendigkeit für empfindliche Gewebe und Zellen, die Handhabung noch einige der Vorteile der einzelnen Zelle RNA-Seq unterhält, ist die Analyse der RNA aus einzelnen Kernen45. Dieser Ansatz ermöglicht eine schnellere Verarbeitung Verringerung der RNA-Abbau und mehr extreme Maßnahmen zur Gewährleistung der angemessenen Veröffentlichung von Kernen und somit wahrscheinlich ein selbstbewusster Erfassung der transcriptional Profile repräsentieren alle Zellen in einem bestimmten Gewebe ermöglicht. Dies würde, natürlich, bieten nur einen Teil der transkriptionelle Aktivität in einer bestimmten Zelle, also je nach was experimentelle Ziele von Interesse sind, dieser Ansatz möglicherweise oder möglicherweise nicht geeignet.
Neben der vollständigen Charakterisierung der zellulären Identitäten innerhalb eines bestimmten Gewebes ist eines der wertvollsten Analysen für ScRNA-Seq-Datasets die Beurteilung der transkriptionellen Zwischenzustände in "definierten" Zell-Populationen. Diese vermittelnden Staaten können vermitteln Einblicke in die Linie Beziehungen zwischen Zellen in bestimmten Bevölkerungsgruppen, die nicht mit traditionellen Masse möglich war, die RNA-Seq nähert. Mehrere ScRNA-Seq bioinformatische Werkzeuge wurden jetzt entwickelt, um dies aufzuklären. Solche Tools können die Prozesse beteiligt, zum Beispiel Krebszellen Übergang zu einem onkogenen/metastasierten Zustand, Stammzellen, die Reifen zu vielfältigen terminal Schicksale oder Immunzellen pendelt zwischen aktiven und ruhenden Zustand beurteilen. Subtile Transkriptom Unterschiede in den Zellen möglicherweise auch bezeichnend für Linie Vorurteile, dass neu entwickelte Bioinformatic Hilfsmittel wie FateID,47ableiten können. Da die Unterschiede zwischen den Zellen den Übergang schwierig sein können angesichts der transkriptionellen Unterschiede feststellen kann subtil sein, tiefer Sequenzierung möglicherweise notwendigen46. Glücklicherweise werden Abdeckung einer flach sequenzierten Bibliothek erhöht, wenn das Dataset weiter durch erneutes Ausführen der Bibliothek auf einem anderen Durchflusszelle Sondieren Sie interessieren.
Zusammen genommen, bietet dieses Protokoll einen leicht anzupassen Workflow, der Benutzern ermöglicht, Hunderte bis Tausende von Einzel-Zellen innerhalb eines Experiments transcriptionally Profil. Die endgültige Qualität eines ScRNA-Seq-Datasets stützt sich auf optimierte Zelle Isolation, Durchflusszytometrie, cDNA Bibliothek Generierung und Interpretation der Roh-gen-Barcode-Matrizen. Zu diesem Zweck bietet dieses Protokoll einen umfassenden Überblick über alle wichtigen Schritte, die leicht geändert werden können, um Studien von verschiedenen Gewebearten zu ermöglichen.

Mit der Entwicklung der hohen Durchsatz Einzelzelle Technologie1,2 und Fortschritte in der benutzerfreundlichen Bioinformatik über das letzte Jahrzehnt3entstand ein neues Feld der hochauflösenden Ausdruck Genanalyse – einzelne Zelle RNA Sequenzierung (ScRNA-Seq). Das Studium der einzelnen Zelle Genexpression wurde ursprünglich entwickelt, um Heterogenität innerhalb definierter Zellpopulationen, wie z. B. in Stammzellen und Krebszellen, zu identifizieren oder um seltene Populationen von Zellen4,5, zu identifizieren, die unerreichbar waren traditionelle Masse RNA Sequenzierung Techniken. Bioinformatische Werkzeuge ermöglichten die Identifizierung von neuen Sub-Populationen (Seurat)2, Visualisierung des Ordens Zellen entlang einer Psuedotime Raum (Monokel)6, Definition der aktive Signalisierung Netzwerke innerhalb oder zwischen Populationen ( MALERISCHE)7, Vorhersage der Versammlung der einzelnen Zellen in eine künstliche 3D-Raum (Seurat und vieles mehr)8. Diese neue und spannende Analysen der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung ScRNA-Seq schnell-die neue Standardtherapie für Genanalyse Ausdruck gewinnt.
Trotz des großen Potenzials des ScRNA-Seq kann die technischen Fachkenntnisse erforderlich, um eine saubere Dataset zu produzieren und präzise Ergebnisse interpretieren die Neuankömmlinge herausfordernd sein. Hier ist eine einfache, aber umfassende Protokoll, ausgehend von der Isolation einzelner Zellen aus dem gesamten primären Gewebe zur Visualisierung und Präsentation von Daten für die Veröffentlichung (Abbildung 1) präsentiert. Erstens kann die Isolierung der einzelnen Krebszellen anspruchsvoll, als verschiedene Gewebe in ihrem Grad der Empfindlichkeit gegenüber enzymatischen Verdauung und anschließende mechanische Dissoziation variieren. Dieses Protokoll enthält Anleitungen in den folgenden Schritten isoliert und identifiziert wichtige Qualitätskontrolle Checkpoints während des Prozesses. Zweitens kann es verwirrend sein, Verständnis für die Kompatibilität und Anforderungen zwischen einzelnen Zellentechnologie und Sequenzierung der nächsten Generation. Dieses Protokoll enthält Richtlinien zur Umsetzung einer benutzerfreundliche, Tropfen-basierte einzellige Barcoding-Plattform und Sequenzierung durchführen. Computer-Programmierung ist schließlich eine wichtige Voraussetzung für die Analyse von einzelligen transkriptomischen Datensätze. Dieses Protokoll stellt Ressourcen für erste Schritte mit der Programmiersprache R und Anleitungen für die Umsetzung der beiden beliebten ScRNA-Seq-spezifische R-Pakete. Dieses Protokoll kann zusammen, Newcomer im ScRNA-Seq-Analyse für klare, interpretierbare Ergebnisse führen. Dieses Protokoll kann auf den meisten Geweben in der Maus eingestellt werden und vor allem für die Verwendung mit anderen Organismen, einschließlich menschliches Gewebe geändert werden könnte. Anpassungen je nach Gewebe und Benutzer werden benötigt.
Es gibt mehrere Überlegungen im Auge zu behalten, während im Anschluss an dieses Protokolls; darunter 1) im Anschluss an alle Richtlinien der Qualitätskontrolle in der Schritte 1 und 2 dieses Protokolls wird empfohlen, eine tragfähige Einzelzelle Aussetzung aller Zellen in der Probe von Interesse zu gewährleisten und gleichzeitig präzise Ergebniszelle zählt (zusammengefasst in Abbildung 2 ). Sobald dies erreicht ist, und wenn die optimierte Bedingungen befolgt werden, die Qualitätskontrolle Schritte fallen gelassen werden können (zu sparen Zeit - Erhaltung RNA Qualität und Reduzierung der Zell-Verlust). Bestätigung erfolgreich isoliert hohe Rentabilität einzelner Zellen aus dem Gewebe von Interesse ist hoch empfehlen vor allen nachgelagerten Verarbeitung. (2) da einige Zelltypen empfindlicher als andere sind zu betonen, können übermäßige Dissoziation Techniken versehentlich die Bevölkerung daher Störfaktoren nachgelagerte Analyse beeinflussen. Sanfte Dissoziation ohne unnötige zellulären Scheren und Verdauung ist entscheidend für die zelluläre ertragreich und eine genaue Darstellung der Zusammensetzung des Gewebes zu erreichen. Scherkräfte auftreten, während der Verreibung, FACS und Wiederfreisetzung Schritte. (3) als mit RNA arbeiten, ist es am besten als kleine zusätzliche RNase in die Probe möglichst während der Zubereitung einzuführen. Dies wird helfen, qualitativ hochwertige RNA zu pflegen. Ribonuklease Inhibitor Lösungen mit Spülung, saubere Werkzeuge und Geräte, die nicht verwenden RNase-freie, aber vermeiden Sie DEPC-behandeltem Produkte. (4) durchführen Sie die Vorbereitungen so schnell wie möglich. Damit erhalten Sie qualitativ hochwertige RNA und Zelltod zu reduzieren. Je nach Gewebe Dissektion Länge und Tier eine solche Gruppe Gründen mehrere Sektionen/Vorbereitungen zur gleichen Zeit. (5) bereiten Sie Zellen auf Eis vor, wenn möglich zu pflegen hochwertige RNA, Zelltod reduzieren und langsam Zelle Signalisierung und transkriptionelle Aktivität. Wenn auch eiskalte Verarbeitung ideal für die meisten Zelltypen ist, Leistung einige Zelltypen (z.B. Neutrophile) bessere bei der Verarbeitung bei Raumtemperatur. (6) vermeiden Sie Calcium, Magnesium, EDTA und DEPC-behandeltem Produkte während der Vorbereitung der Zelle.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

Die Analyse der einzelnen Zelle Genexpression über Tausende von einzelnen Zellen innerhalb eines Gewebes oder einer Mikroumgebung ist ein wertvolles Instrument zur Identifizierung Zelle Komposition, Diskriminierung der Funktionszustände und molekulare Signalwege, die zugrunde liegenden beobachteten Gewebe Funktionen und tierische Verhaltensweisen. Die Isolation der intakten, gesunden einzelne Zellen von Erwachsenen Säugetier-Gewebe für spätere nachgelagerte Einzelzelle molekulare Analyse kann jedoch schwierig sein. Dieses Protokoll beschreibt die allgemeine Prozesse und Qualitätskontrollen, dass unbedingt erhalten Erwachsene Einzelzelle qualitativ hochwertige Präparate aus dem Nervensystem oder Haut, die anschließende unvoreingenommene Einzelzelle RNA Sequenzierung und Analyse aktiviert. Richtlinien für die nachgelagerten bioinformatische Analyse sind ebenfalls vorhanden.

Das Repertoire des open-Source-Pakete entwickelt, um ScRNA-Seq-Datasets analysieren40 mit der Mehrheit der diese Pakete verwenden R-basierten Sprachen3sprunghaft angestiegen. Hier werden repräsentative Ergebnisse mit zwei dieser Pakete präsentiert: Bewertung unbeaufsichtigt Gruppierung von einzelne Zellen basierend auf Genexpression und Zell-Heterogenität und dekonstruieren biologische Bestellung einzelne Zellen entlang einer Flugbahn um zu lösen Prozesse.
Abbildung 4 zeigt die Verwendung von Seurat für Vorverarbeitung Qualitäts-Checks und nachgelagerten Bioinformatik-Analyse. Erstens ist Filtration und Entfernung von abweichenden Zellen aus Analyse essentiell für die Qualitätsprüfung. Dies geschah mit Violine (Abb. 4a) und streuen Grundstücke (Abbildung 4 b), um den Prozentsatz der mitochondrialen Genen, Anzahl der Gene (nGene) und Anzahl der UMI (nUMI), Zelle Dubletten und Ausreißer zu identifizieren zu visualisieren. Jede Zelle mit einer klaren Ausreißer Anzahl von Genen, UMI oder Prozentsatz der mitochondriale Gene war mit Seurat FilterCells Funktion entfernt. Da Seurat Hauptkomponente (PC) nutzt Analyse Scores zu Clustern Zellen, Bestimmung der statistisch signifikanten PCs enthalten ist ein entscheidender Schritt. Ellenbogen Grundstücke (Abb. 4 c) dienten für die PC-Auswahl, welche PCs über das Plateau der "Standardabweichung des PC" Achse wurden ausgeschlossen. Die Auflösung der Cluster wurde auch manipuliert, zeigen, dass die Anzahl der Cluster geändert werden kann, angefangen bei 0,4 (niedrige Auflösung führt zu weniger Zellcluster, Abbildung 4 d) bis 4 (hohe Auflösung führt zu höheren Zellcluster, Abbildung 4e ). Mit niedriger Auflösung ist es wahrscheinlich, dass jedem Cluster einen definierte Zelltyp darstellt, während bei hoher Auflösung dies auch Subtypen oder vorübergehende Zustände einer Zellpopulation darstellen kann. In diesem Fall wurden mit niedriger Auflösung Clustereinstellungen für die weitere Analyse Ausdruck Heatmaps (mit Seurat DoHeatmap Funktion) verwendet, um die höchst exprimierten Gene in einem bestimmten Cluster (Abb. 4f) identifizieren. In diesem Fall wurden die höchst exprimierten Gene identifiziert, durch die Beurteilung differentielle Expression in einem bestimmten Cluster im Vergleich zu allen anderen Cluster kombiniert, zeigt, dass jeder Cluster eindeutig durch definierte Gene vertreten war. Darüber hinaus können einzelne Kandidaten-Gene auf tSNE Grundstücke mit Seurat FeaturePlot Funktion (Abb. 4 g) visualisiert werden. Dies ermöglichte Entzifferung ob gab es Cluster, die Makrophagen zu vertreten. Mit FeaturePlot, fanden wir, dass beide-2 Cluster und 4 wurden Cd68 - Pfanne-Makrophagen Marker zum Ausdruck bringt.
Das Monokel-Paket wurde für erhärten Zellcluster in Seurat identifiziert und für den Aufbau der Zelle Trajektorien oder pseudotemporal bestellen, zur biologische Prozesse (Abbildung 5) zu rekapitulieren. Pseudotemporal Bestellung kann für Proben verwendet werden, wo sollen einzellige Expressionsprofile einen biologischen zeitlichen Verlauf folgen. Zellen pseudotemporal Kontinuum aufzulösenden Zwischenzustände, Gabelung Punkte von zwei alternative Zelle Schicksale bestellbar und gen Unterschriften zugrunde liegenden Erwerb von jedem Schicksal zu identifizieren. Erstens, ähnlich wie Seurat Filtration, minderwertige Zellen wurden entfernt, so dass die Verteilung der mRNA über alle Zellen Log normal und fiel zwischen oberen und unteren Grenzen wie in Abbildung 5aidentifiziert wurde. Dann mit Monokel NewCellTypeHierarchy Funktion Einzelzellen eingestuft wurden und mit bekannter Abstammung Markergene (Abbildung 5 b, 5 c) gezählt. Beispielsweise wurden Zellen PDGF-Rezeptor Alpha oder Fibroblasten spezifische Protein 1 auszudrücken Zelle Typ #1 zugewiesen, erstelle ich ein Kriterium für die Definition von Fibroblasten. Als nächstes wurde dieser Population (Zelle Typ #1) bewertet, um Fibroblasten Trajektorien zu entschlüsseln. Um dies zu tun, war Monokel Differenzial-GeneTest-Funktion genutzt, die im Vergleich der Zellen, die extreme Zustände innerhalb der Bevölkerung darstellt und differenzielle Gene für die Bestellung der übrigen Zellen in der Bevölkerung (Abb. 5D). Durch die Anwendung vielfältige Lernmethoden (eine Art von nicht-linearen Dimensionalität Reduktion) über alle Zellen, wurde eine Koordinate auf einem pseudotemporal Weg zugewiesen. Diese Bahn wurde dann durch Zellstatus (Abb. 5e) und Pseudotime (Abb. 5f) visualisiert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm. Wenige Schritte vom ganze Tier Vorbereitung zu analysieren einzelne Zelle RNA-Seq-Datensätze für die Übermittlung der endgültigen Datasets zu einem öffentlich zugänglichen Repository. Gel-Perlen in Emulsion (GEMs) beziehen sich auf Perlen mit Barcode-Oligonukleotide, die Tausende von Einzelzellen zu Kapseln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> Abbildung 2: tragfähige einheitliche Zellsuspension aus Nervengewebe erstellen. (a) Cartoon Überblick über Qualitätskontrollen. (b) Zellen und Trümmer mit Zellen aufgenommen noch in Trümmern (rote Pfeile). (c) Zellen aus dem Schutt (rote Pfeile) entlassen. (d) Zellen isoliert durch FACS. P0: Schutt Bruchteil; P1: zellähnliche Bruchteil; P3: Ausschluß von Duplets; P4: Lebensfähigkeit Farbstoff (Sytox Orange) negative Bruchteil. (e) keine Lebensfähigkeit Farbstoff Kontrolle. (f) Bild P0 Bruchteil vertreten isoliert Schutt. (g) Bild der P4-Fraktion vertritt isolierende lebensfähige Zellen (rote Pfeile). (b) (c) (f) und (g) hatte nuklearen Farbstoff hinzugefügt 20 Minuten vor Bildgebung. Maßstabsleisten: 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> Abbildung 3: flache Sequenzierung prognostiziert die Anzahl der wiederhergestellten Zellen in 10 X Proben. (a) ein Beispiel (Beispiel 1.6) für MiSeq generiert Csv Inserat Zelle Barcodes und seine entsprechenden UMI gilt als selbstbewusst zugeordneten liest bestimmt. (b) Barcode Rang Plot für Probe 1.6 zeigt einen deutlichen Rückgang im UMI Graf als Funktion der Zelle Barcodes. Die solide und gestrichelte Linien repräsentieren die Cutoff zwischen Zellen und Hintergrund durch Sichtkontrolle ermittelt. (c) Zelle Barcodes beobachtet, mit der Zelle Ranger Pipeline Post-Leseweite offenbart, dass flache Sequenzierung genau die Anzahl der Zellen für Probe 1.6 angenähert. (d) ein Beispiel für eine-Durchflusszelle Setup basierend auf flachen Sequenzierung abgeleitet Zelle Schätzungen. Für Probe 1.6, da flache Sequenzierung 3480 Zellen vorausgesagt 1,17 Bahnen wurden zugewiesen, um sicherzustellen > 100.000 Mal pro Zelle Sequenzierung Berichterstattung in Leseweite gelesen. Hinweis: Alle Bahnen müssen 100 % hinzufügen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> Abbildung 4: Qualitätskontrolle und Bioinformatik der einzelligen RNA-Seq Dataset mithilfe Seurat R Paket. (a) Grundstücke Qualitätskontrolle Metriken, die Anzahl der Gene, Anzahl der eindeutigen molekularen Kennungen (UMIs) und der Prozentsatz der Transkripte, die Zuordnung zu den mitochondrialen Genom enthalten. (b) Probe gen Grundstücke Nachweis von Zellen mit abweichenden mitochondrialer Transkripte und UMIs. (c) Probe Ellenbogen Grundstück für ad-hoc-Bestimmung der statistisch signifikanten PCs verwendet. Die gestrichelte und Dot-gestrichelte Linien repräsentieren die Cutoff, wo eine klare "Ellenbogen" in der Grafik ersichtlich. PC Abmessungen vor diesem Bogen werden in nachgeschalteten Analyse einbezogen. (d, e) Graph-basierte Zellcluster visualisiert in zwei verschiedenen Auflösungen in einem niedrig-dimensionalen Raum mit einem tSNE Grundstück. (f) top Markergene (gelb) für jeden Cluster auf einem Ausdruck Heatmap mit Seurat DoHeatmap Funktion visualisiert. (g) Visualisierung Marker Ausdruck, z. B. Cd68 gen, Makrophagen (lila) mit Seurat FeaturePlot Funktion darstellt. Dies deutet darauf hin, dass diese Cluster 2 und 4 (im Panel d) dieses Datensatzes Makrophagen darstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> Abbildung 5: Zell-Kategorisierung und entlang Peudotemporal Flugbahn mit Monokel Toolkit bestellen. (a) Prüfung der Verteilung der mRNA (abgeleitet von UMI zählt) auf alle Zellen in einer Probe. Nur Zellen mit mRNA zwischen 0 - ~ 20.000 für nachgelagerte Analyse verwendet wurden. (b, C) Zuweisen und Zelltypen basierend auf bekannten Linie Zelle Marken zählen. Z. B. Zellen PDGF-Rezeptor Alpha oder Fibroblasten spezifische Protein 1 zum Ausdruck bringen waren Zelle Typ #1 zugewiesen, Pan-Fibroblasten darstellt mit Monokel NewCellTypeHierarchy Funktion. Anzahl der verschiedenen Zelltypen kann als Kreisdiagramm (b) und als Tabelle (c) visualisiert werden. (d) Verwendung von Zelle Art #1 (Fibroblasten) als Beispiel, die Gene, die für die Bestellung von Zellen können mit einem Streudiagramm, das Gen Streuung vs. mittlere Ausdruck zeigt visualisiert werden verwendet. Die rote Kurve zeigt die Cutoff für Gene, die für die Bestellung berechnet den Mittelwert-Varianz-Modell mit Monokel EstimateDispersions-Funktion verwendet. Gene, die diese Cut-off Treffen dienten für die nachgeschaltete pseudotime Bestellung. (e, f) Visualisierung der Zelle Trajektorien in einem reduzierten zweidimensionalen Raum farbige Zelle "Staat" (e) und von Monocle zugewiesen "Pseudotime" (f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Dieses Protokoll beschreibt die allgemeine Prozesse und Qualitätskontrollen für die Zubereitung von gesunder Erwachsenen einziger Säugerzellen Droplet-basierte, hohen Durchsatz Einzelzelle RNA-Seq Vorbereitungen notwendig. Sequenzierung Parameter, lesen Sie Ausrichtung und nachgelagerten einzellige bioinformatische Analyse sind ebenfalls vorhanden.

Droplet Barcode-basierte Einzelzelle Transkriptom des adulten Säugetier-Geweben

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu beantworten, wie das Verständnis von Genexpressionsänderungen über Tausende von einzelnen Zellen nach einer Verletzung oder einer Krankheit. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es uns ermöglicht, Transkriptome einzelner Zellen innerhalb eines komplexen Gewebes zu sezieren und die funktionelle Dynamik innerhalb einer bestimmten Population besser zu schätzen. Der Vorteil unseres Protokolls besteht darin, dass es umfassende Methoden bietet, von der Isolierung einzelner Zellen im Primärgewebe bis hin zur Analyse und Visualisierung dieses Datensatzes.Obwohl diese Methode von einzelligen Suspensionen von der Haut und dem Nerv ausgeht, können die Sequenzierungsmethoden, die wir beschreiben, angewendet werden, um jedes Säugetiergewebe zu untersuchen. Demonstriert wird dieses Verfahren von Elodie Labit und Wisoo Shin, zwei Auszubildenden aus meinem Labor. Um zu beginnen, sezieren Sie den Ischiasnerv einer eingeschläferten Maus, indem Sie zuerst die Haut vom Hinterteil der Rückseite der Maus wegschneiden.Verwenden Sie eine sterile Skalpellklinge, um einen Schnitt entlang der Länge des Oberschenkels zu machen. Verwenden Sie dann feine Zangen und Scheren, um den Ischiasnerv zu belichten und zu entfernen. Um die dorsale Rückenhaut zu sezieren, verwenden Sie feine Zangen und Scheren, um Schnitte von Schulter zu Schulter, über den Rumpf und den Rücken hinunter zu machen.Waschen Sie das Gewebe zweimal mit eiskaltem HBSS. Entfernen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop unerwünschtes Bindegewebe, Fettablagerungen oder Schmutz. Nur für die Haut, schneiden Sie die Haut in dünne Scheiben, mit einem sterilen SkalpellKlinge.Um die Hautdermis zu erhalten, schweben die Hautscheiben in Dispase, in HBSS in einer 10-Zentimeter-Schale, für 30 bis 40 Minuten bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie feine Zangen, um die Epidermis zu schälen und von der Dermis zu trennen, und entsorgen Sie dann die Epidermis. Dann, für Haut und Nerven, verwenden Sie ein Paar sterile Skalpellklingen, um jede Probe in ein bis zwei Millimeter Stücke zerkleinern.Legen Sie die Gewebestücke in frisch getunte, zwei Gramm pro Milliliter kalte Kollagennase-vier Enzym in einem 15 Milliliter konischen Rohr. Jede Probe im Enzym in einem 37-Grad-Celsius-Bad 30 Minuten lang mit sanftem Schütteln alle 10 Minuten inkubieren. Nach 30 Minuten verwenden Sie einen P1000 Pipetter, um das Gewebe 20 bis 30 Mal zu trituieren und ins Wasserbad zurückzukehren.Wiederholen Sie die Trituration alle 30 Minuten, bis die Lösung trüb erscheint und Gewebebrocken weitgehend voneinander getrennt sind. Nur für die Haut, in der letzten Stunde der Inkubation, fügen Sie ein Milligramm pro Milliliter DNAse auf die Hautprobe. Da einige Zelltypen empfindlicher als andere auf mechanische Beanspruchung reagieren, können übermäßige Dissoziationstechniken Ihre Bevölkerung verzerrt.Die allgemeine Dissoziation ist entscheidend für die Erreichung hoher Zellausbeute und eine genaue Darstellung der Gewebezusammensetzung. Danach verwenden Sie einen 40-Mikrometer-Filter auf der Oberseite des 50 Milliliter konischen Rohrs, um jede Gewebeprobe zweimal zu filtern. Spülen Sie den Filter mit einem Prozent BSA/HBSS.Nach zentrifugieren der Proben, wie im Manuskript beschrieben, setzen Sie das Zellpellet in HBSS, das ein Prozent BSA enthält, mit einer Breitbohrspitze wieder auf, und legen Sie es auf Eis. Die Zugabe von Lebensfähigkeitfarbstoff wird Ihnen helfen, Ihre Vorbereitung zu optimieren. Sie sollten mindestens 80 Prozent lebensfähige Zellen anvisieren.Einmal optimiert, können diese und andere Qualitätskontrollschritte weggelassen werden, um den Dissoziationsprozess zu beschleunigen, der die RNA-Qualität besser erhalten und den Zellverlust reduzieren wird. Um lebensfähige und gesunde Zellen mit FACS zu isolieren, bereiten Sie zunächst 15 Milliliter Schmalbodenröhren mit acht Millilitern eiskaltem BSA/HBSS für Probensammlungen vor. Um sicherzustellen, dass die Schnittstelle zwischen der Oberfläche der Flüssigkeit und der Innenseite des Rohres feucht ist, und um statische und Oberflächenspannung zu verhindern, invertieren Sie die Rohre vor den Sammlungen.Unmittelbar nach der FACS-Zellsortierung, sobald Zellen in einem 15 Milliliter-Rohr gesammelt werden, verwenden Sie einen Milliliter von einem Prozent BSA/HBSS, um alle Zellen von der Seitenoberfläche des Rohres zu waschen und nach unten zu schieben. Dann Zentrifugieren Sie jede Probe bei 260 g für acht Minuten. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, setzen Sie das Zellpellet in einem Prozent BSA/HBSS wieder auf, und fügen Sie 33,8 Mikroliter zu einer Röhre hinzu, und halten Sie diese Röhre auf Eis.Dieser Schritt ist für die Verwendung von Reagenzien aus einem standardisierten Kit konzipiert. Alle vorgezeigten Schritte sollten gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden. Zur Vorbereitung auf die GEM-Generierung, legen Sie einen Chip in den Chiphalter, die bereiten Sie eine Zell-Master-Mix auf Eis, nach Herstellerprotokoll.Fügen Sie 56,2 Mikroliter der Master-Mischung in ein Rohr mit 33,8 Mikroliter Selbstsuspension. Um den Chip vorzubereiten, zuerst bei 50 Prozent Glycerin zu den Brunnen, die nicht verwendet werden. Dann fügen Sie 90 Mikroliter der Zellmaster-Mischung zu gut ein, 40 Mikroliter Gelperlen zu gut zwei, und 270 Mikroliter Trennöl zu gut drei.Bedecken Sie den Chip mit einer Dichtung. Um den Chip zu laden und in einem Einzelzellencontroller auszuführen, werfen Sie zuerst das Fach aus. Legen Sie den Chip in das Fach.Ziehen Sie das Fach zurück, und drücken Sie die Wiedergabe. Nach dem vollständigen Lauf 100 Mikroliter der Probe sammeln und in ein PCR-Rohr legen. Platzieren Sie PCR-Rohre in einer voreingestellten PCR-Maschine und laufen Sie entsprechend dem Kit.Im Anschluss an den Lauf werden GEMs in voller Länge, barcoded cDNA, aus polyadenylierter mRNA enthalten sein. Die Rohre über Nacht bei minus 20 Grad Celsius aufstellen. Fahren Sie mit dem Erstellen, der Sequenzierung, Ausrichtung und Analyse der Bibliothek fort.Sobald Proben sequenziert und ausgerichtet sind, wie im Manuskript beschrieben, hinterlegen Sie die Daten in einem öffentlichen Repository, wie z. B. NCBi es GEO. Registrieren Sie sich dazu für das Einsenderkonto. Schließen Sie zunächst die GEO-Übermittlung ab, indem Sie das Metadatenblatt herunterladen.Stellen Sie sicher, dass Sie nur ein Metadatenblatt pro Projektübermittlung einschließen. Platzieren Sie die Kalkulationstabelle im Verzeichnis. Fügen Sie zweitens die Rohdatendatei hinzu, die aus dem Skript für die Anzahl der Zellen ranger für alle Bibliotheken generiert wurde, zum Verzeichnis.Der dritte Ordner ist verarbeitete Datendateien. Platzieren Sie verarbeitete Datendateien, die aus dem Skript für die Anzahl der Zellen ranger für alle Bibliotheken generiert wurden, in das Verzeichnis. Verwenden Sie die FTP-Serveranmeldeinformationen des GEO-Absenders, um das Verzeichnis mit allen drei Komponenten zu übertragen.Nach dem Ausführen von Cell Ranger können analysefähige Gen-Barcode-Matrizen mit fortschrittlicher Bioinformatik weiterverarbeitet werden. Zunächst wurden Vorverarbeitungsmengenprüfungen mit dem Seurat R-Paket durchgeführt, das Geigen- und Streudiagramme generierte, um die Anzahl der Gene, die Anzahl der eindeutigen molekularen Identifikatoren und den Prozentsatz der mitochondrialen Gene zu visualisieren, um Zelldoublets und Ausreißer zu identifizieren. Für die Auswahl von Hauptkomponenten oder PCs wurden Ellenbogendiagramme verwendet, bei denen PCs jenseits des Plateaus der Standardabweichung der PC-Achse ausgeschlossen wurden.Die Auflösung des Clusterings wurde ebenfalls manipuliert. Niedrige Auflösung führte zu weniger Zellclustern, wobei jeder Cluster wahrscheinlich einen definierten Zelltyp darstellt. Hohe Auflösung führte zu einer höheren Zellwahrscheinlichkeit, die Untertypen oder Übergangszustände einer Zellpopulation darstellt.Clustereinstellungen mit niedriger Auflösung wurden für die weitere Analyse von Expression-Heatmaps verwendet, um die am höchsten exprimierten Gene in einem bestimmten Cluster zu identifizieren. Einzelne Kandidatengene wurden auf tSNE-Plots visualisiert, mit Hilfe von Seustos Feature-Plot-Funktion, die die Entschlüsselung ermöglichte, ob es Cluster gab, die beispielsweise Makrophagen darstellten. Sowohl Cluster zwei als auch vier ausgedrückte CD68, ein Pan-Makrophagen-Marker.Andere Pakete bieten auch Werkzeuge für die Qualitätskontrolle, z. B. Monocle, ein R-Paket, das zum Erstellen von Zellbahnen verwendet wird, entfernt Zellen von schlechter Qualität und stellt sicher, dass die Verteilung von mRNA auf alle Zellen log normal ist und zwischen oberen und unteren Grenzen fällt. Einzelne Zellen wurden dann klassifiziert und gezählt, unter Verwendung bekannter Linienmarkergene, und Zellen, die Marker von Interesse ausdrücken, wurden dem Zelltyp Nummer eins zugeordnet. Es wurde festgestellt, dass Zelltyp Nummer eins Fibroblasten waren.Diese Population wurde bewertet, um Fibroblasten Entwicklungspfad zu bauen. Nach diesem Verfahren sollten andere Methoden wie quantitative PCR, In-situ-Hybridisierung, eine immunistische Chemie durchgeführt werden, um die Genauigkeit Ihrer Genexpressionsergebnisse zu validieren. Die einzellige mRNA-Sequenzierung hat forschern in vielen verschiedenen Bereichen nun den Weg geebnet, um die Zell-zu-Zell-Heterogenität zu erforschen und die funktionelle Dynamik in verschiedenen Geweben während der Homöostase zu identifizieren und wie sich diese nach Einer Verletzung oder bei der Entwicklung von Krankheiten ändern können.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranukleäre Mikroinjektion von DNA in Dissoziierte Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Forschung

Biologie

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Anaerobe Wachstum und Erhalt von Säugetieren Zelllinien

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...