Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

אנו להכיר את צוות התמיכה במתקן שירותי UCDNA, כמו גם צוות המתקן חיה טיפול מאוניברסיטת קלגרי. אנו מודים מאט Workentine בשל תמיכתו ביואינפורמטיקה, ג'נס Durruthy לתמיכה טכנית שלו. עבודה זו היה ממומן על ידי מענק CIHR (חומרי גלם, ג'יי-בי), פרס חוקר חדש CIHR מאד, בריאות מחקר מכון אחווה (י. ס אלברטה לילדים).

<ol>
	<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+for+cellular+variation.">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation.</a> Nature. 510, 363-369 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161, 1202-1214 (2015).</li><li>Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+single-cell+RNA-seq+analysis+landscape+with+the+scRNA-tools+database.">Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database.</a> bioRxiv:206573. , (2018).</li><li>Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+defines+heterogeneity+and+transcriptional+dynamics+in+the+adult+neural+stem+cell+lineage.">Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage.</a> Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).</li><li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+Reveals+a+Population+of+Dormant+Neural+Stem+Cells+that+Become+Activated+upon+Brain+Injury.">Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Schwann+Cells+from+Adult+Human+Skin+and+Nerve.">Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Agilent Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135">https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135</a> (2018)</li><li>Kolodziejczyk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+RNA-Sequencing+of+Pluripotent+States+Unlocks+Modular+Transcriptional+Variation.">Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation.</a> Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex.">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).</li><li>. Sequencing Requirements for Single Cell 3' Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3</a> (2018)</li><li>. Introduction to R Available from: <a target="_blank" href="https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r">https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Creating a Reference Package with cellranger mkref Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references</a> (2018)</li><li>. System Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements</a> (2018)</li><li>. Software Downloads Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</a> (2018)</li><li>. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization</a> (2018)</li><li>. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial</a> (2018)</li><li>. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data Available from: <a target="_blank" href="https://www.scrna-tools.org/">https://www.scrna-tools.org/</a> (2018)</li><li>. Downloading conda Available from: <a target="_blank" href="https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html">https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html</a> (2018)</li><li>. r / packages / r 3.5.1 Available from: <a target="_blank" href="https://anaconda.org/r/r">https://anaconda.org/r/r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. Seurat - Guided Clustering Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html">https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>Github. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).</li><li>. GenBank Submission Portal Wizards Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/</a> (2018)</li><li>. Submitting data Available from: <a target="_blank" href="https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/">https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/</a> (2018)</li><li>Shah, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+and+Fate+Mapping+of+Ependymal+Cells+Reveals+an+Absence+of+Neural+Stem+Cell+Function.">Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function.</a> Cell. 173, 1045-1057 (2018).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11, 1 (2013).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144, 3625-3632 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96, 313-329 (2017).</li><li>Zeigenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+states+versus+single-cell+atlases+-+two+classes+of+heterogeneity+that+differ+in+meaning+and+method.">Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method.</a> Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).</li><li>Herman, J. S., Sagar, D., Gr&#252;n, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FateID+infers+cell+fate+bias+in+multipotent+progenitors+from+single-cell+RNA-seq+data.">FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data.</a> Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).</li></ol>

אין גילויים

פרוטוקול זה מדגים איך ההכנה המתאימה של תאים בודדים אפשר לחשוף את הטרוגניות תעתיק של אלפי תאים בודדים ולא להפלות הברית תפקודית או זהויות ייחודיות סלולר בתוך רקמה. הפרוטוקול אינה דורשת כתב פלורסנט חלבונים או כלים מהונדס, ניתן להחיל את בידודה של תאים בודדים של רקמות שונות כולל אלה של בני אדם; במחשבה כל הרקמה הוא ייחודי, פרוטוקול זה דורש מידה מסוימת של התאמה/שינוי.
התוכניות תעתיק מגוונים ודינאמיים מאוד בתוך התאים הדגישו את הערך של תא בודד גנומיקה. מלבד בידוד איכותי RNA, צעד הכנת דגימה קריטית הדרושות datasets באיכות גבוהה זה להבטיח כי התאים משתחררות לחלוטין מרקמות וכי התאים הם בריאה ושלמה. זה יחסית ישר קדימה עבור איסוף תאים שנמצאים בקלות שוחרר, כגון מחזורי תאים או ברקמות שבו תאים נשמרים באופן רופף, כגון רקמות הלימפה. אבל זה יכול להיות מאתגר בשביל לרקמות אחרות למבוגרים, עקב מפותחים הארכיטקטורה הסלולר המתפרסות על-פני מרחקים גדולים, סביב מטריצה חוץ-תאית, לעיתים קרובות נוקשה cytoskeletal החלבונים המעורבים שמירה על מבנה התא. אפילו עם דיסוציאציה המתאים טכניקות לשחרור מלא של תאים, יש פוטנציאל עיבוד קפדני וממושך לעתים קרובות נדרש לשנות את איכות ה-mRNA ותקינות תא. בנוסף, בטמפרטורות גבוהות המשמש בסיוע אנזימים דיסוציאציה להשפיע גם על חתימות תעתיק29,30. הכוונה של הפרוטוקול היא להציג את בקרת איכות בודק, באמצעות רקמות כגון העצב למבוגרים סיבי העצב ואת העור למבוגרים עשיר מטריצה חוץ-תאית, כדי להדגים איך אופטימיזציה יכול לעזור להתגבר על מכשולים אלה.
שיקול מרכזי בעת עיצוב כל ניסוי scRNA-Seq הוא הבחירה של רצף עומק. רצף ניתן מאוד מרובב ולקרוא לעומק יכול לנוע בין היותו נמוך מאוד באמצעות שחרור-Seq2 עד 5 מיליון קריאות תא14 באמצעות שיטת ה-RNA-Seq באורך מלא כגון Smart-תת סעיף. רוב הניסויים scRNA-Seq יכול לזהות ביטוי בינונית-גבוהה תעתיקים עם רצף המתחילים 10,000 קריאות תא, אשר מספיקה בדרך כלל עבור תא סוג סיווג41,42. רצף רדוד עומק יהיה ערך כדי לחסוך בעלויות רצף כאשר מנסים לגלות אוכלוסיות תאים נדיר מעבר רקמות מורכבות שבו אלפי תאים עשוי להיות נחוץ כדי לייחס בביטחון אוכלוסיות נדיר. אבל עומק רדוד רצף אינה נאותה כאשר מידע מפורט על ביטוי גנים ותהליכים הקשורים חתימות תעתיק עדין הוא הכרחי. נכון לעכשיו, ההערכה היא כי רובם המכריע של הגנים בתא מזוהים עם 500,000 reads/תא, אבל זה יכול להשתנות בהתאם לפרוטוקול, רקמות הקלד43,44. ואילו רצף באורך מלא התעתיק עוקף את הצורך הרכבה יכול, לפיכך, לזהות הרומן או גרסאות splice נדיר, עלויות רצף מגבילים לעתים קרובות שינוי גודל כזה גישות לבחון אלפי תאים הכוללת מערכת רקמות מורכבות. לעומת זאת, 3' מתויג תא בודד ספריות כמו אלו המתוארים פרוטוקול זה בדרך כלל יש המורכבות נמוך יותר ודורשים רצף רדודים. חשוב לציין כי היה לסדרם ספריות שנוצר באמצעות פרוטוקול המתואר באחד חמש סקוונסרים הנתמכים: 1) NovaSeq, HiSeq 2) 3000/4000, 3) HiSeq 2500 ריצה מהירה, תפוקה גבוהה, 4) NextSeq 500/550 ו 5) MiSeq.
גישה חלופית לתא בודד RNA-Seq, אשר מפחית את הצורך רקמה עדינה ותא טיפול עדיין שומר על חלק מהיתרונות של תא בודד RNA-Seq, הניתוח של RNA מן הגרעינים יחיד45. גישה זו מאפשרת עיבוד מהירה יותר השפלה RNA, ובמידה יותר באמצעים קיצוניים. כדי להבטיח שחרור נאותה של גרעינים, ומאפשר לפיכך סביר לכידה בטוח יותר מהפרופילים תעתיק המייצגים כל התאים בתוך רקמות נתון. זה, כמובן, רק יספק חלק הפעילות תעתיק מתנה בתוך תא נתון, ולכן תלוי מה מטרות הניסוי הן עניין גישה זו עשויה או לא עשויה להיות המתאים.
מלבד להשלים אפיון זהויות סלולר בתוך רקמות נתון, אחד הניתוחים החשובים ביותר עבור scRNA-Seq datasets הוא ההערכה של הברית תעתיק ביניים על פני אוכלוסיות תא 'מוגדרת'. מדינות אלה מתווך להקנות תובנות הגומלין שושלת היוחסין בין תאים בתוך אוכלוסיות מזוהה, דבר שלא היה אפשרי עם מסורתיים בצובר ש-RNA-Seq מתקרב. מספר כלים bioinformatic scRNA-Seq עכשיו פותחו כדי להבהיר את זה. כלים כאלה יכולים להעריך את התהליכים המעורבים, לדוגמה, תאים סרטניים מעבר למצב oncogenic גרורתי, תאי גזע הופך מגוונות הגורלות מסוף או תאים חיסוניים בין מדינות השבתה הדרגתית האקטיביות. ההבדלים העדינים transcriptome בתאים יכול להיות גם מעידה על שושלת היוחסין הטיות, כלים שפותחו לאחרונה bioinformatic כמו FateID, ניתן להסיק47. מאז ההבחנות בין העושים מעבר מיגדרי תאים יכול להיות קשה לאמת נתון ההבדלים תעתיק עשויה להיות עדינים, רצף עמוק עשוי להיות נחוץ46. למרבה המזל, ניתן להגדיל את הכיסוי של ספרייה רדודות ברצף אם מעוניינת חיטוט נוסף את ערכת הנתונים על-ידי הפעלה מחדש של הספרייה על תא אחר זרימת.
יחדיו, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה קל להסתגל ומאפשר למשתמשים transcriptionally פרופיל מאות עד אלפי חד-תאים בתוך ניסוי אחד. האיכות הסופית של מבנה נתונים scRNA-Seq מסתמך על בידוד תא ממוטבת, cytometry זרימה, דור ספריית cDNA פרשנות של ג'ין raw-ברקוד מטריצות. לשם כך, פרוטוקול זה מספק סקירה מקיפה של כל השלבים החשובים שניתן לשנותו בקלות כדי לאפשר לימודי סוגי רקמות מגוונות.

עם התפתחות תפוקה גבוהה תא בודד הטכנולוגיה1,2 והתפתחויות ושפור ידידותי למשתמש על פני העשור האחרון3, התפתחה שדה חדש של הביטוי מפענוח ברזולוציה גבוהה – רצפי RNA בתא יחיד (scRNA-Seq). המחקר של ביטוי גנים תא בודד פותחה לראשונה כדי לזהות הטרוגניות בתוך אוכלוסיות תאים מוגדרים, כגון תאי גזע או תאים סרטניים, או כדי לזהות אוכלוסיות נדיר של תאים4,5, אשר היו בלתי ניתנת להשגה באמצעות בתפזורת מסורתי RNA רצף טכניקות. כלים Bioinformatic הפעלת הזיהוי של הרומן תת אוכלוסיות (סרה)2, ויזואליזציה מסדר תאים לאורך psuedotime שטח (המשקף)6, ההגדרה של רשתות איתות פעיל בתוך או בין אוכלוסיות ( נופי)7, חיזוי של ההרכבה של תאי-יחיד בחלל תלת-ממד מלאכותי (סרה ועוד)8. עם אלה חדש ומרגש ניתוחים לרשות הקהילה המדעית, scRNA-Seq הוא מהיר להפוך הגישה החדשה סטנדרטיים לניתוח ביטוי גנים.
למרות הפוטנציאל העצום של scRNA-Seq, טכני מיומנויות הנדרשות כדי לייצר dataset נקי וכדי במדויק לפרש תוצאות יכול להיות מאתגר לחדשים. כאן, פרוטוקול בסיסי, אך מקיף, החל בידודו של תאים בודדים רקמות כל ראשי כדי ויזואליזציה והצגת נתונים לפרסום מוצג (איור 1). ראשית, בידודו של תאים בודדים בריא יכול להיחשב מאתגר, כמו ברקמות שונות להשתנות ב מידת הרגישות עיכול אנזימטי, דיסוציאציה מכני עוקבות. פרוטוקול זה מספק הדרכה בשלבים אלה בידוד ומזהה בקרת איכות חשוב מחסומים לכל אורך התהליך. שנית, הבנת את תאימות ודרישות בין הדור הבא רצפי וטכנולוגיה של תא בודד יכול להיות מבלבל. פרוטוקול זה מספק קווים מנחים כדי ליישם פלטפורמה ידידותי למשתמש, מבוסס-droplet barcoding תא בודד ולבצע רצף. לבסוף, תכנות מחשבים היא תנאי מוקדם חשוב לניתוח נתונים (datasets) transcriptomic תא בודד. פרוטוקול זה מספק מקורות תחילת העבודה עם שפת התיכנות R ומספק הדרכה על יישום שתי חבילות R הפופולרי של scRNA-Seq-ספציפיות. יחד, פרוטוקול זה יכול מדריך במורשתם ביצוע ניתוח scRNA-Seq להשגת תוצאות ברורות, interpretable. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לרקמות רוב העכבר, חשוב יכול להיות שונה לשימוש עם אורגניזמים אחרים, כולל רקמה אנושית. התאמות בהתאם רקמת המשתמש יידרש.
קיימים מספר שיקולים שיש לזכור בעת בעקבות פרוטוקול זה; כולל, 1) בעקבות הנחיות בקרת איכות כל שלבים 1 ו- 2 של פרוטוקול זה מומלץ להבטיח השעיה קיימא תא בודד של כל התאים בתוך המדגם עניין תוך הקפדה על ספירת מספר בתא סכום מדויק (מסוכם ב איור 2 ). פעם זו מושגת, אם כל התנאים ממוטבת עוקבים, אפשר לרדת במדרגות בקרת איכות (כדי לחסוך זמן - שמירה על איכות ה-RNA והפחתת התא הפסד). המאשרת לבידוד מוצלח של תאים בודדים הכדאיות גבוהה מן הרקמה עניין מאוד להמליץ לפני כל במורד הזרם מעבד. 2) מאז כמה סוגי תאים רגישים יותר מאחרים להדגיש, טכניקות דיסוציאציה מופרז יכול בטעות הטיה האוכלוסייה, ולכן משתנה מתערב ניתוח במורד הזרם. דיסוציאציה עדין ללא הטיה הסלולר מיותרים ועיכול חיוני להשגת תפוקה גבוהה הסלולר, ייצוג מדויק של רקמת חיבור. כוחות גזירה להתרחש במהלך השלבים trituration, FACS, resuspension. 3) כמו עם כל עבודה RNA, רצוי להציג בתור RNase נוספים קטן לתוך הדגימה ככל האפשר במהלך ההכנה. זה יעזור לשמור על ה-RNA באיכות גבוהה. להשתמש בפתרונות מעכב ribonuclease עם שטיפה כלים נקיים, כל ציוד שאינו נטול RNase אך להימנע המוצרים שטופלו DEPC. 4) לבצע את ההכנות מהר ככל האפשר. זה יעזור לשמור על ה-RNA באיכות גבוהה ולהפחית את מות תאים. בהתאם אורך חיתוך רקמה חיה מספר, שקול החל והניתוחים/הכנות מרובות בו-זמנית. 5) להכין את התאים על הקרח כאשר אפשרי כדי לשמור על איכות גבוהה RNA, להפחית את מות תאים איטי התא איתות ופעילות גנים ברמת השעתוק. אף על פי, עיבוד קר כקרח הינו אידיאלי עבור רוב סוגי תאים, כמה סוגי תאים (למשל, נויטרופילים) לבצע טוב יותר כאשר מעובד בטמפרטורת החדר. 6) להימנע במהלך ההכנה תא סידן, מגנזיום, EDTA ומוצרים שטופלו DEPC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

הניתוח של ביטוי גנים תא בודד לאורך אלפי תאים בודדים בתוך רקמות או microenvironment הוא כלי רב ערך עבור מזהה תא הלחנה, אפליה של הברית פונקציונלי, מסלולים מולקולריים שבבסיס נצפתה רקמה פונקציות ואופני בבעלי חיים. עם זאת, בידודו של תאים בודדים שלם, בריא רקמות יונקים בוגרים לבדיקה מולקולרית עוקבות במורד הזרם תא בודד יכול להיות מאתגר. פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללית ובדיקה בקרת איכות הדרושים כדי להשיג תכשירים איכותיים למבוגרים ותא ממערכת העצבים או עור זה זמין הבאים לתא בודד לא משוחד RNA רצף וניתוח. הנחיות ניתוח bioinformatic במורד הזרם הינם גם מסופקים.

הרפרטואר של קוד פתוח חבילות נועד לנתח את scRNA-Seq datasets גדל באופן דרמטי40 עם רוב השימוש האלה חבילות שפות מבוססות-R3. כאן, נציג תוצאות באמצעות שתי חבילות אלה מוצגים: הערכת קיבוץ ללא השגחה של יחיד המבוססת על ביטוי גנים בתאים ואת הזמנת תאים בודדים לאורך מסלול כדי לפתור תא הטרוגניות לפרק ביולוגית תהליכים.
איור 4 מדגימה את השימוש סרה לעיבוד מראש בדיקות איכות וניתוח ביואינפורמטיקה במורד הזרם. ראשית, סינון והסרה של תאים סוטה מן ניתוח הכרחי לבדיקת איכות. הדבר נעשה באמצעות כינור (איור 4a) ופיזור מגרשים (איור 4b) כדי להמחיש את האחוז של גנים מיטוכונדריאלי, מספר גנים (nGene) ומספר אומי (nUMI) כדי לזהות תא doublets ליניאריים. תא כלשהו עם מספר חריג חשוד טעות ברורה של גנים, UMI או אחוזים של גנים מיטוכונדריאלי הוסר בעזרת פונקציה FilterCells של סרה. מאז סרה משתמשת גורמים ראשיים (PC) ניתוח תוצאות לתאים אשכולות, קביעת מחשבים סטטיסטית כדי לכלול הוא שלב קריטי. מגרשים המרפק (איור 4 c) שימשו לבחירה PC, ב אשר מחשבים מעבר הרמה של 'סטיית התקן של PC' ציר שוחררנו. הרזולוציה של קיבוץ באשכולות תומרנה גם הוכחת כי מספר אשכולות יכול להשתנות, החל 0.4 (ברזולוציה נמוכה שמוביל פחות תא אשכולות, איור 4 d) 4 (ברזולוציה גבוהה שמוביל גבוה תא אשכולות, דמות 4e ). ברזולוציה נמוכה, סביר כי כל אשכול מייצגת את סוג התא מוגדר, ואילו ברזולוציה גבוהה זה עשוי גם לייצג יחוברו או מדינות המעבר של אוכלוסיה התא. במקרה זה, הגדרות אשכול ברזולוציה נמוכה שימשו לניתוח נוסף ביטוי heatmaps (באמצעות הפונקציה DoHeatmap של סרה) כדי לזהות את הגנים ביותר ביטוי באשכול נתון (איור 4f). במקרה זה, הגנים ביותר ביטוי אותרו על-ידי הערכת ביטוי דיפרנציאלי באשכול נתון לעומת כל שאר האשכולות משולב, הוכחת כל אשכול ייצגו באופן ייחודי גנים מוגדרים. בנוסף, ניתן לאבחן מועמד בודדים גנים על חלקות tSNE באמצעות פונקציית FeaturePlot של סרה (איור 4 g). פעולה זו מותרת עבור פענוח אם היו קבוצות שייצג מקרופאגים. שימוש FeaturePlot, מצאנו כי שניהם שכונה 2 ו- 4. הבעת Cd68 - פאן-מקרופאג סמן.
החבילה מונוקל שימש בעדות אשכולות תא שזוהתה סרה ועל בניית מסלולים התא, או הזמנת pseudotemporal, כדי לסכם תהליכים ביולוגיים (איור 5). הזמנת pseudotemporal יכול לשמש עבור דגימות איפה פרופילי ביטוי תא בודד צפויים לבצע קורס לזמן הביולוגי. התאים ניתן להזמין לאורך רצף pseudotemporal לפתרון ביניים הברית, נגע הסתעפות נקודות של שני תא חלופי הגורלות, ולזהות חתימות ג'ין שבבסיס רכישת כל הגורל. ראשית, דומה הסינון של סרה, תאים באיכות ירודה הוסרו כזה כי ההתפלגות של mRNA על פני כל התאים היה יומן רגילה ונפל בין חסם שתוארו בעלון איור 5a. לאחר מכן, באמצעות הפונקציה newCellTypeHierarchy של המשקף, תאים בודדים סווגו וספרתי באמצעות גנים סמן היוחסין הידועה (איור 5b, ג 5). לדוגמה, תאים המבטאים PDGF הקולטן אלפא או 1 חלבון ספציפי פיברובלסט הוקצת תא סוג #1 לשם יצירת קריטריון להגדרת fibroblasts. בשלב הבא, אוכלוסייה זו (תא סוג #1) נאמד לפענח פיברובלסט מסלולים. כדי לעשות זאת, הפונקציה GeneTest דיפרנציאלית של המשקף היה מנוצל, אשר לעומת התאים פדרטיביות קיצוניים בתוך האוכלוסייה ומצא גנים דיפרנציאלי עבור הזמנת את התאים הנותרים באוכלוסייה (איור 5-d). על ידי יישום שיטות למידה סעפת (סוג של הפחתת dimensionality שאינו ליניארי) על פני כל התאים, הוצב קואורדינטה גדולה לאורך נתיב pseudotemporal. מסלול זה היה אז דמיינו ידי תא המדינה (איור 5e) ואת pseudotime (איור 5f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> איור 1: תרשים זרימה- השלבים של כל בעל חיים הכנה לניתוח יחיד תא RNA-Seq datasets ועד להגשת datasets הסופי ולמאגר זמין לציבור. חרוזי ג'ל בתחליב (אבני חן) מתייחסים חרוזים עם oligonucleotides לבר-קוד אשר לתמצת אלפי תאים בודדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> איור 2: יצירת תא בודד קיימא ההשעיה מרקמות עצב. (א) קריקטורה סקירה של בדיקות בקרת איכות. תאים (ב'), פסולת עם תאים עדיין שולבו פסולת (חצים אדומים). (ג) תאים שוחרר מפני פסולת (חצים אדומים). (ד) תא בידוד מאת FACS. P0: פסולת שבר; P1: תאים דמויי שבר; P3: הדרה של duplets; P4: הכדאיות צבען (Sytox כתום) שבר שלילי. (ה) אין שליטה לצבוע הכדאיות. (ו) תמונה של שבר P0 המייצג פסולת מבודד. (ז) תמונה של שבר P4 המייצג מבודד התאים קיימא (חצים אדומים). (b) (ג) (ו) והיה (גרם) גרעיני צבע הוסיף 20 דקות לפני הדמיה. סרגלי קנה מידה: 80 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> איור 3: רצף רדוד מנבאת את מספר התאים התאושש ב 10 X דגימות מעובד. (א) הוא דוגמה (לדוגמה 1.6) שנוצר על-ידי MiSeq csv רישום תא ברקודים ו- UMI המקביל שלו סופרת כפי שנקבע על ידי קריאות בביטחון ממופה. (ב) העלילה דרגה ברקוד מדגם 1.6 מראה טיפה אחת משמעותית בספירת UMI כפונקציה של התא ברקודים. הקווים מוצק ואיתן מקווקווים מייצגים החיתוך בין תאים לבין הרקע כפי שנקבע על ידי בדיקה ויזואלית. (ג) תא ברקודים נצפתה באמצעות הפקחים תא צינור הפוסט-HiSeq מגלה רצף רדוד במדויק לקרב את ערכיהן מספר התאים עבור מדגם 1.6. (ד) דוגמה של מלכודת זרימה-התא המבוסס על רצף רדוד נגזר תא הערכות. עבור מדגם 1.6, מאז רצף רדוד חזה 3480 תאים, מסלולים 1.17 שהוזמנו כדי להבטיח > קריאות 100,000 לכל רצף הקליטה ב- HiSeq. הערה: כל הנתיבים עליך להוסיף ל- 100%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> איור 4: בקרת איכות, ביואינפורמטיקה של תא בודד RNA-Seq dataset שימוש בחבילת סרה R. (א) חלקות מדדים בקרת איכות הכוללים מספר גנים, מספר מזהים ייחודיים מולקולרית (UMIs), ואת האחוז של תעתיקים מיפוי הגנום מיטוכונדריאלי. (ב) דוגמת ג'ין חלקות גילוי תאים עם רמות חריגה של תעתיקים מיטוכונדריאלי UMIs. (ג) מדגם מגרש המרפק משמש נחישות אד הוק של מחשבים אישיים משמעותיים מבחינה סטטיסטית. הקווים מקווקו והשמדת על-ידי נקודה מייצגים החיתוך בה "מרפק" ברור הופך לעין בגרף. PC מידות לפני זה המרפק כלולים בניתוח במורד הזרם. (ד, ה) אשכולות מבוססי גרף תא דמיינו ברזולוציות שונות שני ברווח נמוך-ממדי באמצעות מגרש tSNE. (f) סמן העליון גנים (צהוב) עבור כל אשכול דמיינו על heatmap ביטוי באמצעות פונקציית DoHeatmap של סרה. (ז) להמחיש סמן ביטוי, לדוגמה, ג'ין Cd68 המייצג מקרופאגים (סגול) באמצעות פונקציית FeaturePlot של סרה. הדבר מצביע על שהאשכול הזה 2 ו- 4 (ברה החלונית) של ערכת נתונים זה מייצג מקרופאגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> איור 5: תא חלוקה לקטגוריות וסידור לאורך מסלול peudotemporal באמצעות ערכת מונוקל. (א) בוחן את ההפצה של mRNA (להסיק מן UMI ספירות) על פני כל התאים במדגם. רק תאים עם ה-mRNA בין 0 - ~ 20,000 שימשו לצורך ניתוח במורד הזרם. (b, c) הקצאת וספירת סוגי תאים בהתבסס על שושלת היוחסין הידועה תא סמנים. לדוגמה, תאים המבטאים PDGF הקולטן אלפא או 1 חלבון ספציפי פיברובלסט הוקצת תא סוג #1 המייצג פאן-fibroblasts באמצעות פונקציית newCellTypeHierarchy של המשקף. מספר סוגי תאים שונים, ניתן לאבחן תרשים עוגה (b) וכן טבלה (c). (ד) באמצעות תאים מסוג #1 (fibroblasts) כדוגמה, הגנים המשמש עבור הזמנת תאים ניתן לאבחן באמצעות מגרש פיזור המדגים ג'ין נפיצה לעומת הביטוי מרושע. העקומה אדום מראה החיתוך עבור גנים המשמש עבור הזמנת מחושב לפי מודל אומר-השונות באמצעות הפונקציה estimateDispersions של המשקף. גנים העונים על הפסקת זו שימשו עבור הזמנת pseudotime במורד הזרם. (e, f) ויזואליזציה של התא מסלולים במרחב דו-ממדי מופחתת בצבע "המדינה של התא" (e), וכן מוקצה מונוקל "Pseudotime" (f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללי, בקרת איכות בודק הדרושים להכנת בריאים למבוגרים תאים בודדים בתרבית של תפוקה גבוהה, מבוסס-droplet תא בודד RNA-Seq ההכנות. קביעת רצף פרמטרים, יישור קריאה וניתוח bioinformatic תא בודד במורד הזרם הינם גם מסופקים.

רביב Transcriptomics מבוססי Barcoding תא בודד של רקמות בוגרות יונקים

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון הבנת שינויים בביטוי גנים על פני אלפי תאים בודדים לאחר פציעה או מחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לנתח תמלילים של תאים בודדים בתוך רקמה מורכבת, ולהעריך טוב יותר את הדינמיקה התפקודית בתוך אוכלוסייה נתונה. היתרון של הפרוטוקול שלנו הוא שהוא מספק שיטות מקיפות, מבידוד של תאים בודדים ברקמות ראשוניות, לניתוח והדמיה של ערכת נתונים זו.למרות שיטה זו מתחילה מתלים חד-תאיים מהעור ומהעצב, ניתן ליישם את שיטות רצף שאנו מתארים כדי לחקור כל רקמת יונקים. הדגמת הליך זה יהיה אלודי Labit, ו Wisoo שין, שני חניכים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לנתח את העצב הסיאטי של עכבר המתת חום על ידי תחילה חיתוך העור הרחק מהאזור האחורי של החלק האחורי של העכבר.השתמש בלהב אזמל סטרילי לעשות חתך לאורך הירך. לאחר מכן השתמש מלקעות ומספריים עדין כדי לחשוף ולהסיר את העצב הסיאטי. כדי לנתח את העור האחורי הגבי, השתמש במקלפים וב מספריים עדין כדי לבצע חתכים מכתף לכתף, על פני העכוז, ולמטה מאחור.לשטוף את הרקמות פעמיים עם HBSS קר כקרח. תחת מיקרוסקופ ניתוח, הסר רקמת חיבור לא רצויה, מרבצי שומן או פסולת. לעור בלבד, חותכים את העור לפרוסות דקות, באמצעות להב אזמל סטרילי.כדי להשיג את עור הדרמיס, לצוף את פרוסות העור ב dispase, ב HBSS בצלחת 10 ס"מ, במשך 30 עד 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש מדפים עדין לקלף ולהפריד את האפידרמיס מן הדרמיס, ולאחר מכן להשליך את האפידרמיס. לאחר מכן, לעור ולעצבים, השתמשו בזוג להבי אזמל סטריליים כדי לטחון כל דגימה לחתיכות של מילימטר אחד עד שניים.מניחים את חתיכות הרקמה לתוך מופשר טרי, שני גרם לכל מיליליטר קולגנס קר ארבע אנזים בצינור חרוט 15 מיליליטר. דגירה כל מדגם באנזים באמבטיה 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם רעידות עדינות כל 10 דקות. ב 30 דקות, להשתמש pipetter P1000 כדי triturate הרקמה 20 עד 30 פעמים, ולחזור לאמבט המים.חזור על טריטורציה כל 30 דקות עד שהפתרון נראה מעונן, וגושים של רקמה הם ניתו במידה רבה. לעור בלבד, בשעה האחרונה של הדגירה, מוסיפים מיליגרם אחד למיליליטר DNAse לדגימה של העור. מאז כמה סוגי תאים רגישים יותר מאחרים ללחץ מכני, טכניקות דיסוציאציה מוגזמת יכול להטות את האוכלוסייה שלך.דיסוציאציה כללית היא קריטית להשגת תשואות תאים גבוהות, וייצוג מדויק של הרכב רקמות. לאחר מכן, השתמש במסנן 40 מיקרומטר על גבי צינור חרוט 50 מיליליטר כדי לסנן כל דגימת רקמה פעמיים. שטפו את המסנן באחוז אחד של BSA/HBSS.לאחר צנטריפוגה הדגימות כמתואר בכתב היד, להשעות מחדש את גלולת התא ב HBSS, המכיל אחוז אחד BSA, באמצעות קצה רחב נשא, ומקום על קרח. תוספת של צבע הכדאיות יעזור לך לייעל את ההכנה שלך. אתה צריך לכוון לפחות 80 אחוז תאים קיימא.לאחר אופטימיזציה, זה וצעדים אחרים בקרת איכות ניתן להשמיט על מנת לזרז את תהליך הדיסוציאציה, אשר ישמור טוב יותר על איכות RNA ולהפחית את אובדן התא. כדי לבודד תאים בני קיימא ובריאים באמצעות FACS, הכינו תחילה צינורות צרים-תחתונים ב-15 מיליליטר עם שמונה מיליליטר של קר כקרח באחוז אחד של BSA/HBSS לאוספים לדוגמה. כדי להבטיח כי הממשק בין פני השטח של הנוזל ואת החלק הפנימי של הצינור הוא לח, כדי למנוע מתח סטטי פני השטח, להפוך את הצינורות לפני אוספים.מיד לאחר מיון התאים FACS, לאחר התאים נאספים בצינור 15 מיליליטר, להשתמש מיליליטר אחד של אחוז אחד BSA / HBSS לשטוף ולדחוף את כל התאים למטה מפני השטח הצדדיים של הצינור. ואז צנטריפוגה כל מדגם ב 260 גרם במשך שמונה דקות. לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את גלולת התא באחוז אחד BSA / HBSS, ולהוסיף 33.8 microliters לצינור, ולשמור את הצינור על קרח.שלב זה נועד להיעשות באמצעות רייגנטים המתקבלים מערכת מתוקקנת. יש לבצע את כל השלבים שהוכחו בהתאם להוראות היצרן. כדי להתכונן לדור GEM, מניחים שבב במחזיק השבב, להכין תערובת אב תא על קרח, על פי פרוטוקול היצרן.הוסף 56.2 microliters של תערובת האב לצינור המכיל 33.8 microliters של השעיה עצמית. כדי להכין את השבב, תחילה ב 50 אחוז גליצרול ל בארות שלא ישמשו. לאחר מכן להוסיף 90 microliters של תערובת אב התא גם אחד, 40 microliters של חרוזי ג'ל גם שתיים, ו 270 microliters של שמן חלוקה לגם שלוש.כסו את השבב עם אטם. כדי לטעון את השבב ולהפעיל בבקר תא יחיד, להוציא תחילה את המגש. שים את השבב במגש.משוך את המגש ולחץ על הפעל. לאחר הריצה המלאה, לאסוף 100 microliters של המדגם, ולמקום בצינור PCR. מקם צינורות PCR במכונת PCR מוגדרת מראש, ופעל בהתאם להערכה.לאחר הריצה, GEMs יכלול באורך מלא, cDNA ברקוד, מ mRNA polyadenylated. מניחים את הצינורות במינוס 20 מעלות צלזיוס לילה. המשך בבניית ספריה, רצף, יישור וניתוח.לאחר שהדגימות רצף מיושר כמתואר בכתב היד, להפקיד את הנתונים על מאגר ציבורי, כגון GEO של NCBI. לשם כך, הירשם לחשבון השולח. תחילה, השלם את שליחת GEO על-ידי הורדת גליון המטה-נתונים.הקפד לכלול גליון מטה-נתונים אחד בלבד לכל שליחה של פרוייקט. מקם את הגיליון האלקטרוני בספריה. שנית, הוסף את קובץ הנתונים הגולמי שנוצר מקובץ ה- Script של ספירת טווחי התאים עבור כל הספריות לספריה.התיקיה השלישית היא קבצי נתונים מעובדים. מקם קבצי נתונים מעובדים שנוצרו מקובץ Script של ספירת טווחי תאים עבור כל הספריות בספריה. השתמש באישורי שרת FTP של שולח GEO כדי להעביר את הספריה המכילה את כל שלושת הרכיבים.לאחר הפעלת Cell Ranger, ניתן לעבד עוד יותר מטריסות ברקוד גנים מוכנות לניתוח באמצעות ביואינפורמטיקה מתקדמת. ראשית, בדיקות כמות טרום עיבוד נעשו באמצעות חבילת Seurat R, שיצרה חלקות כינור ופזר כדי לדמיין את מספר הגנים, מספר המזהים המולקולריים הייחודיים ואחוז הגנים המיטוכונדריים לזיהוי מכפילי תאים וחריגים. לבחירת הרכיבים העיקריים, או המחשבים, נעשה שימוש בחלקות מרפק, שבהן לא נכללו מחשבים מעבר לרמה של סטיית התקן של ציר המחשב.גם ההחלטה על קיבוץ באשכולות הייתה מניפולציה. רזולוציה נמוכה הובילה לפחות אשכולות תאים, כאשר סביר להניח שכל אשכול מייצג סוג תא מוגדר. רזולוציה גבוהה הובילה להסתברות תאים גבוהה יותר, המייצגת סוגי משנה, או מצבי מעבר, של אוכלוסיית תאים.הגדרות אשכול ברזולוציה נמוכה שימשו לניתוח נוסף של מפות חום ביטוי כדי לזהות את הגנים המובעים ביותר באשכול נתון. גנים של מועמדים בודדים הוצגו על חלקות tSNE, תוך שימוש בפונקציית העלילה התכונתית של Seurat, שאיפשרה פענוח, בין אם היו אשכולות שייצגו, למשל, מקרופאגים. הן אשכול 2 והן ארבעה מבוטא CD68, סמן pan-macrophage.חבילות אחרות מספקות גם כלים לבקרת איכות, לדוגמה, Monocle, חבילת R המשמשת לבניית מסלולי תאים, מסירה תאים באיכות ירודה ומבטיחה שהתפלגות ה- mRNA בכל התאים תיווך כרגיל, ותפול בין הגבול העליון והתחתון. תאים בודדים סווגו ונספרו אז, תוך שימוש בגנים ידועים של סמן שושלת, ותאים המבטאים סמנים מעניינים הוקצו לסוג התא מספר אחד. נקבע כי סוג תא מספר אחד היו פיברובלסטים.אוכלוסייה זו הוערכה לבנות מסלול התפתחותי fibroblasts. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו PCR כמותי, בהכלאה situ, כימיה חיסונית צריכה להתבצע כדי לאמת את הדיוק של תוצאות ביטוי הגנים שלך. רצף mRNA חד-תאי סלל כעת את הדרך לחוקרים בתחומים רבים ושונים לחקור את ההטרוגניות של התא לתא, ולזהות דינמיקה תפקודית בתוך רקמות שונות במהלך הונוסטזיס, וכיצד אלה עשויים להשתנות לאחר פציעה או בהתפתחות המחלה.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Microinjection Intranuclear של דנ&quot;א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

צמיחה אנאירובית ותחזוקה של שורות תאים בתרבית

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 מעשיר את התשואה של מלנוציטים אנושיים מרקמות עור למבוגרים

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...