Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
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Riconosciamo che il personale di supporto presso l'impianto di servizi UCDNA, così come il personale della struttura Animal Care presso l'Università di Calgary. Grazie a Matt Workentine per il suo sostegno di bioinformatica e Jens Durruthy per il suo supporto tecnico. Quest'opera è stata finanziata da una sovvenzione CIHR (R.M. e J.B.), un CIHR nuovo Investigator Award a J.B. e Health Research Institute Fellowship (J.S. bambini all'Alberta).

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Nessun informazioni integrative

Questo protocollo dimostra come la corretta preparazione delle singole cellule possa scoprire l'eterogeneità trascrizionale di migliaia di singole cellule e discriminare gli stati funzionali o identità univoche cellulare all'interno di un tessuto. Il protocollo non richiede proteine reporter fluorescenti o strumenti transgenici e può essere applicato per l'isolamento di singole cellule da vari tessuti di interesse compresi quelli dagli esseri umani; tenendo in considerazione ogni tessuto è unico e questo protocollo richiederà un certo grado di regolazione/modifica.
I programmi trascrizionali vari e altamente dinamici all'interno delle cellule hanno sottolineato il valore della cella singola genomica. Oltre a isolamento di RNA di alta qualità, una fase di preparazione del campione critici necessaria per i set di dati di alta qualità è garantire che le cellule sono completamente liberate dal tessuto e che le cellule sono sane e intatte. Questo è relativamente semplice per raccolta di cellule che sono facilmente rilasciato, come cellule circolanti o nei tessuti dove le cellule senza bloccare vengono mantenute, come nei tessuti linfoidi. Ma questo può essere difficile per altri tessuti dell'adulto, a causa dell'architettura cellulare altamente sviluppata che coprono grandi distanze, matrice extracellulare e le proteine citoscheletriche rigida spesso coinvolti nel mantenimento della struttura delle cellule circostanti. Anche con tecniche di dissociazione appropriato per la versione completa di cellule, esiste la possibilità che l'elaborazione rigorosa e spesso lunga richiesta avrebbe alterato l'integrità delle cellule e di qualità di mRNA. Inoltre, le temperature elevate utilizzate per dissociazione enzima-assistita anche sui transcriptional firme29,30. L'intento del protocollo è di presentare il controllo di qualità controlla, usando tessuti quali il nervo myelinated adulto e pelle adulta ricchi di matrice extracellulare, per dimostrare come ottimizzazione può aiutare a superare questi ostacoli.
Una considerazione importante quando si progetta qualsiasi esperimento scRNA-Seq è la scelta della profondità di sequenziamento. L'ordinamento può essere altamente multiplexato e leggere profondità può variare da essere molto basso facendo uso di goccia-Seq2 a fino a 5 milioni di letture/cella14 utilizzando un metodo di RNA-Seq full-length come Smart-Seq. Maggior parte degli esperimenti di scRNA-Seq può rilevare trascrizioni moderata-alta espressione con sequenziamento à partir 10.000 letture/cella, che è solitamente sufficiente per cella tipo classificazione41,42. Profondità poco profonda sequenziamento è di valore per risparmiare sui costi di sequenziamento in quando si cerca di rilevare popolazioni di cellule rare attraverso tessuti complessi dove migliaia di cellule può essere necessario attribuire con fiducia popolazioni rare. Ma sequenziamento di profondità non è adeguata quando informazioni dettagliate sull'espressione genica e processi associati con sottile transcriptional firme sono necessari. Attualmente, si stima che la grande maggioranza dei geni in una cella vengono rilevata con 500.000 letture/cella, ma questo può variare a seconda del protocollo e tessuto tipo43,44. Mentre trascrizione integrale sequenziamento aggira la necessità per l'assemblaggio e può, pertanto, rilevare romanzo o varianti di splicing rara, costi di sequenziamento spesso limitano tali approcci per esaminare migliaia di cellule che compongono un sistema complesso tessuto di ridimensionamento. Al contrario, 3' etichetta singola cellula librerie come quelli descritti nel presente protocollo in genere hanno una minore complessità e richiedono meno profonda sequenziamento. È importante notare che le librerie generate utilizzando il protocollo descritto possono essere sequenziate su uno dei cinque sequencer supportati: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 esecuzione rapida e ad alto rendimento, 4) NextSeq 500/550 e 5) MiSeq.
Un approccio alternativo a singola cella RNA-Seq, che riduce la necessità di tessuti delicati e manipolazione ancora celle mantiene alcuni dei vantaggi della singola cella RNA-Seq, è l'analisi del RNA da singoli nuclei45. Questo approccio permette l'elaborazione più rapida, riducendo la degradazione di RNA e altre misure estreme per garantire adeguata rilascio dei nuclei e così probabilmente consente un'acquisizione più sicura dei profili trascrizionali che rappresenta tutte le celle all'interno di un dato tessuto. Questo sarebbe, naturalmente, fornire solo una parte dell'attività trascrizionale presente all'interno di una cella specificata, quindi a seconda di quali sono gli obiettivi sperimentali di interesse questo approccio potrebbe o potrebbe non essere appropriato.
Oltre alla caratterizzazione completa delle identità cellulare all'interno di un dato tessuto, una delle analisi più preziosi per i DataSet scRNA-Seq è la valutazione di stati intermedi trascrizionale attraverso le popolazioni 'definito' delle cellule. Questi stati intermedi possono impartire le relazioni di discendenza tra le celle all'interno di popolazioni identificati, che non era possibile con tradizionale alla rinfusa che si avvicina a RNA-Seq: intuizioni. Diversi strumenti di bioinformatic scRNA-Seq ora sono stati sviluppati per delucidare questo. Tali strumenti possono valutare i processi coinvolti in, ad esempio, le cellule tumorali transizione a uno stato di oncogeni e/o metastatico, cellule staminali, maturando in diversi destini terminali o cellule immunitarie spola tra Stati attivi e quiescenti. Transcriptome sottili differenze nelle cellule possono anche essere indicative delle polarizzazioni di lignaggio che, strumenti bioinformatici sviluppati di recente come FateID, in grado di dedurre47. Poiché le distinzioni tra cellule di transizione possono essere difficile accertare dato le differenze trascrizionale possono essere sottili, sequenziamento più profonda può essere necessario46. Fortunatamente, copertura di una libreria che digrada dolcemente in sequenza può essere aumentata se siete interessati a sondare il dataset ulteriormente rieseguendo la libreria su un'altra cella di flusso.
Presi insieme, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro facile adattare che consente agli utenti di profilo trascrizionalmente centinaia o migliaia di single-celle all'interno di un esperimento. La qualità finale di un dataset scRNA-Seq si basa sull'isolamento delle cellule ottimizzato, citometria a flusso, generazione della libreria di cDNA e interpretazione del codice a barre-gene crudo matrici. A tal fine, questo protocollo fornisce una panoramica completa di tutti i passaggi chiave che possono essere facilmente modificati per attivare studi di tipi di tessuti diversi.

Con lo sviluppo di elevato throughput unicellulare tecnologia1,2 e gli avanzamenti in strumenti di bioinformatica user-friendly nel corso degli ultimi dieci anni3, è emerso un nuovo campo di analisi di espressione genica ad alta risoluzione – sequenziamento di RNA di singola cellula (scRNA-Seq). Lo studio dell'espressione genica singola cella è stato sviluppato per identificare eterogeneità all'interno di popolazioni di cellule definito, come in cellule staminali o cellule tumorali, o per identificare rare popolazioni di cellule4,5, che erano irraggiungibili utilizzando tecniche di sequenziamento di RNA tradizionale alla rinfusa. Strumenti di Bioinformatic hanno permesso l'identificazione di sub-popolazioni romanzo (Seurat)2, visualizzazione dell'ordine di cellule lungo un psuedotime spazio (monocolo)6, definizione delle reti di segnalazione attive all'interno o tra popolazioni ( SCENIC)7, la previsione dell'Assemblea del singolo-cellule in uno spazio 3D artificiale (Seurat e più)8. Con queste nuove e interessanti analisi disponibili alla comunità scientifica, scRNA-Seq è rapidamente diventando il nuovo approccio standard per l'analisi dell'espressione genica.
Nonostante il vasto potenziale della scRNA-Seq, la skillsets tecnica necessaria per produrre un set di dati puliti e interpretare con precisione i risultati può essere difficile per i nuovi arrivati. Qui, un protocollo semplice, ma completo, a partire dall'isolamento di singole cellule da tessuti intero primari per visualizzazione e presentazione dei dati per la pubblicazione è presentato (Figura 1). In primo luogo, l'isolamento di singole cellule sane possa essere considerato impegnativo, come tessuti differenti variano nel loro grado di sensibilità alla digestione enzimatica e successiva dissociazione meccanica. Questo protocollo fornisce una guida nella procedura di isolamento e identifica i checkpoint importante controllo di qualità durante tutto il processo. In secondo luogo, comprendere la compatibilità e requisiti tra tecnologia single cell e sequenziamento di nuova generazione può essere confusa. Questo protocollo fornisce linee guida per implementare una piattaforma facile da usare, basato su goccia unicellulare codici a barre ed eseguire l'ordinamento. Infine, programmazione di computer è un presupposto importante per l'analisi unicellulare Transcrittomica DataSet. Questo protocollo fornisce risorse per iniziare a utilizzare il linguaggio di programmazione R e fornisce indicazioni sull'implementazione di due popolari pacchetti di R scRNA-Seq-specifici. Insieme, questo protocollo può guidare i nuovi arrivati in esecuzione di analisi scRNA-Seq per l'ottenimento di risultati chiari e interpretabili. Questo protocollo può essere registrato alla maggior parte dei tessuti nel topo e cosa importante potrebbe essere modificato per l'utilizzo con altri organismi, compresi tessuti umani. Regolazioni a seconda del tessuto e l'utente sarà richieste.
Esistono alcune considerazioni da tenere a mente mentre a seguito di questo protocollo; compreso, 1) a seguito di tutte le linee guida di controllo di qualità nei passaggi 1 e 2 del presente protocollo è consigliato per garantire una sospensione di cellule singole vitali di tutte le cellule all'interno del campione di interesse assicurando numero conta accurata e totale delle cellule (riassunti in Figura 2 ). Una volta che questo è realizzato, e se vengono rispettate tutte le condizioni ottimizzate, la procedura di controllo di qualità può essere eliminata (per risparmiare tempo - preservando la qualità di RNA e riducendo cella perdita). Confermando il successo isolamento di singole cellule di alta redditività dal tessuto di interesse è altamente consigliato a valle prima di qualsiasi elaborazione. 2) dato che alcuni tipi di cellule sono più sensibili di altre allo stress, tecniche di dissociazione eccessivo possono inavvertitamente pregiudizi la popolazione, quindi confusione dell'analisi a valle. Dissociazione dolce senza inutili tosatura cellulare e digestione è fondamentale per il raggiungimento di alti rendimenti cellulari e una rappresentazione accurata della composizione del tessuto. Le forze di taglio si verificano durante le operazioni di triturazione, FACS e risospensione. 3) come con qualsiasi altra attività di RNA, è meglio introdurre come little RNasi aggiuntiva nel campione come possibile durante la preparazione. Questo aiuterà a mantenere alta qualità RNA. Utilizzare soluzioni di inibitore della ribonucleasi con risciacquo per attrezzi puliti e qualsiasi apparecchiatura che non sia RNAsi-libera ma evitare prodotti trattati con DEPC. 4) eseguire preparazioni più rapidamente possibile. Questo vi aiuterà a mantenere alta qualità RNA e ridurre la morte delle cellule. A seconda della lunghezza di dissezione dei tessuti e numero degli animali, è consigliabile iniziare dissezioni/preparazioni multiple allo stesso tempo. 5) preparare cellule su ghiaccio quando possibile per mantenere alta qualità RNA, ridurre la morte delle cellule e lento attività trascrizionale e segnalazione delle cellule. Seppur, elaborazione ghiacciata è ideale per la maggior parte delle cellule, alcuni tipi di cellule (per esempio, neutrofili) siano migliori quando trattati a temperatura ambiente. 6) evitare di calcio, magnesio, EDTA e prodotti trattati con DEPC durante la preparazione delle cellule.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

L'analisi dell'espressione genica di singola cellula attraverso migliaia di singole celle all'interno di un tessuto o un microambiente è un prezioso strumento per l'identificazione delle cellule composizione, discriminazione degli stati funzionali e vie molecolari che sono alla base del tessuto osservato funzioni e comportamenti degli animali. Tuttavia, l'isolamento di cellule singole intatte, sane da tessuti di mammiferi adulti per l'analisi molecolare successiva cella singola a valle può essere impegnativo. Questo protocollo descrive le procedure generali e controlli di qualità necessario per ottenere preparazioni di cellule singole adulto di alta qualità dal sistema nervoso o della pelle che è stato attivato analisi e sequenziamento di successive imparziale singola cella RNA. A vostra disposizione anche linee guida per l'analisi bioinformatica e a valle.

Il repertorio di pacchetti open source progettato per analizzare DataSet scRNA-Seq è aumentato drammaticamente40 con la maggior parte di questi uso di pacchetti di linguaggi basati su R3. Qui, vengono presentati risultati rappresentativi utilizzando due di questi pacchetti: valutando raggruppamento senza supervisione di basato sull'espressione genica di cellule singole e singole cellule lungo una traiettoria di ordinazione al fine di risolvere delle cellule di eterogeneità e decostruire biologico processi.
La figura 4 illustra l'uso di Seurat per controlli di qualità e l'analisi bioinformatica a valle di pre-elaborazione. In primo luogo, filtrazione e rimozione delle cellule devianti dall'analisi è essenziale per il controllo qualità. Questo è stato fatto utilizzando violino (Figura 4a) e dispersione trame (Figura 4b) per visualizzare la percentuale di geni mitocondriali, numero di geni (cuore) e numero di UMI (nUMI) per identificare la cella doppietti e outlier. Ogni cella con un numero di chiaro valore erratico dei geni, UMI o percentuale di geni mitocondriali è stato rimosso utilizzando la funzione FilterCells di Seurat. Dal momento che Seurat utilizza componenti principali (PC) gol di analisi alle cellule di cluster, determinare statisticamente significativa pz da includere è un passo fondamentale. Trame di gomito (Figura 4c) sono stati utilizzati per la selezione di PC, in quali PC oltre l'altopiano della 'deviazione standard del PC' asse sono stati esclusi. La risoluzione di clustering è stata maneggiata anche dimostrando che è possibile modificare il numero di cluster, che vanno da 0.4 (bassa risoluzione che conduce a meno mazzi delle cellule, Figura 4D) a 4 (alta risoluzione che porta maggiore mazzi delle cellule, Figura 4e ). A bassa risoluzione, è probabile che ogni cluster rappresenta un tipo di cella definita, mentre ad alta risoluzione questo può rappresentare anche sottotipi o stati transitori di una popolazione delle cellule. In questo caso, le impostazioni del cluster a bassa risoluzione sono state utilizzate per analizzare ulteriormente espressione heatmaps (utilizzando la funzione DoHeatmap di Seurat) per identificare i geni più altamente espressi in un determinato cluster (Figura 4f). In questo caso, sono stati identificati i geni più altamente espressi valutando l'espressione differenziale in un determinato cluster contro tutti gli altri gruppi combinati, dimostrando che ogni cluster è stato rappresentato in modo univoco dai geni definiti. Inoltre, i geni candidati individuali possono essere fruiti su tSNE trame utilizzando la funzione di FeaturePlot di Seurat (Figura 4 g). Questo ha permesso per decifrare se c'erano i cluster che rappresentato i macrofagi. Usando FeaturePlot, abbiamo trovato che entrambi cluster 2 e 4 sono state esprimendo Cd68 - un marcatore pan-macrofago.
Il pacchetto di Monocle è stato utilizzato per corroborare la mazzi delle cellule identificate in Seurat e per la costruzione di traiettorie delle cellule, o ordinare pseudotemporal, ricapitolare i processi biologici (Figura 5). Ordinazione pseudotemporal può essere utilizzato per gli esempi dove i profili di espressione di singole cellule sono tenuti a seguire un corso di tempo biologico. Le cellule possono essere ordinate lungo un continuum pseudotemporal per risolvere stati intermedi, punti di biforcazione di due destini cellulari alternativi e identificano firme di gene alla base di acquisizione di ogni destino. In primo luogo, simile a filtrazione di Seurat, scarsa qualità celle sono state rimosse tali che la distribuzione di mRNA attraverso tutte le cellule è stato registro normale ed è caduto tra i limiti superiore e inferiore come indicato in Figura 5a. Quindi, utilizzando la funzione newCellTypeHierarchy di Monocle, singole cellule sono state classificate e contati usando geni marcatori noti lignaggio (Figura 5b, 5C). Ad esempio, le cellule che esprimono PDGF recettore alfa o del fibroblasto specifico della proteina 1 sono state assegnate a Cell tipo #1 per creare un criterio per la definizione di fibroblasti. Successivamente, questa popolazione (Cell tipo #1) è stata valutata per decifrare le traiettorie del fibroblasto. Per effettuare questa operazione, è stata utilizzata la funzione GeneTest differenziale di Monocle, che rispetto le cellule che rappresentano gli stati estremi all'interno della popolazione e trovati geni differenziale per ordinare le celle rimanenti nella popolazione (Figura 5 d). Applicando i metodi di apprendimento collettore (un tipo di riduzione della dimensionalità non lineare) su tutte le celle, è stata assegnata una coordinata lungo un percorso di pseudotemporal. Questa traiettoria quindi è stata visualizzata da stato della cellula (Figura 5e) e pseudotime (Figura 5f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> Figura 1: diagramma di flusso. Passi dall'animale intero preparazione all'analisi di singole cellule RNA-Seq DataSet alla presentazione finale di set di dati in un repository pubblicamente disponibile. Perline di gel in emulsione (gemme) riferiscono a perline con oligonucleotidi con codice a barre che racchiudono migliaia di singole cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> Figura 2: creazione di sospensione unicellulare praticabile da tessuto nervoso. (a) del fumetto Panoramica dei controlli di qualità. (b) cellule e detriti con cellule ancora incorporato in detriti (frecce rosse). (c) cellule rilasciate da detriti (frecce rosse). (d) isolamento delle cellule di FACS. P0: frazione detriti; P1: cellula-come frazione; P3: esclusione di Duine; P4: frazione negativo colorante (Sytox Orange) di attuabilità. (e) nessun controllo di tintura di attuabilità. (f) immagine di P0 frazione rappresentare isolato detriti. (g) immagine di P4 frazione rappresentare isolato cellule vitali (frecce rosse). (b) (c) (f) e (g) aveva nucleare colorante aggiunto 20 minuti prima di formazione immagine. Barre della scala: 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> Figura 3: sequenziamento superficiale predice il numero delle cellule recuperate in campioni trattati: 10x. (a) un esempio (esempio 1.6) di csv generati MiSeq Inserzione cellulare i codici a barre e suo corrispondente UMI conta come determinato da letture con fiducia mappate. (b) codice a barre trama rango per esempio 1.6 Mostra un calo significativo nel conteggio UMI in funzione del cellulare i codici a barre. Le linee tratteggiate e solide rappresentano il cut-off tra cellule e sfondo come determinato mediante ispezione visiva. (c) codici a barre delle cellule osservate utilizzando la cella Ranger pipeline post-HiSeq rivela superficiale sequenziamento approssimata con precisione il numero di cellule per esempio 1.6. (d) un esempio di un set-up di cella di flusso basato sul sequenziamento poco profonda derivate stime delle cellule. Per esempio 1.6, poiché poco profonda sequenziamento predetto 3480 cellule, 1,17 corsie sono state assegnate per garantire > 100.000 letture per copertura di sequenziamento di cella in HiSeq. Nota: Tutte le corsie devono aggiungere al 100%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> Figura 4: controllo di qualità e bioinformatica di singola cellula RNA-Seq dataset utilizzando pacchetto Seurat R. (un) trame di metriche di controllo di qualità che includono il numero di geni, numero di identificatori univoci molecolari (UNMIS) e la percentuale di trascrizioni mappatura al genoma mitocondriale. (b) gene campione tracciate individuare celle con livelli deviante di trascrizioni mitocondriali e UNMIS. (c) trama di gomito campione utilizzato per la determinazione ad hoc di PC statisticamente significativa. Le linee tratteggiate e dot-tratteggiata rappresentano il taglio dove un chiaro "gomito" diventa evidente nel grafico. Dimensioni PC prima questo gomito sono inclusi nell'analisi a valle. (d, e) Aggregati di cellule basato su grafico visualizzati in due diverse risoluzioni in uno spazio basso-dimensionale utilizzando una trama tSNE. (f) top geni marcatori (gialli) per ogni cluster visualizzati su un'espressione heatmap utilizzando la funzione DoHeatmap di Seurat. (g) visualizzazione dell'espressione dei marker di, ad esempio, Cd68 gene che rappresenta i macrofagi (viola) utilizzando la funzione FeaturePlot di Seurat. Ciò suggerisce che quel cluster 2 e 4 (in pannello d) di questo dataset rappresenta i macrofagi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> Figura 5: cellulare categorizzazione e ordinazione lungo la traiettoria di peudotemporal utilizzando il toolkit di Monocle. (a) controllare la distribuzione di mRNA (derivata dal conteggi UMI) su tutte le celle in un campione. Solo le celle con mRNA tra 0 - ~ 20.000 sono stati usati per l'analisi a valle. (b, c) Assegnazione e contando tipi cellulari basati su indicatori delle cellule lignaggio noto. Ad esempio, le cellule che esprimono PDGF recettore alfa o del fibroblasto specifico della proteina 1 erano assegnate a Cell tipo #1 che rappresentano pan-fibroblasti utilizzando la funzione newCellTypeHierarchy di Monocle. Numero di diversi tipi di cellule possa essere visualizzato come un grafico a torta (b) e come una tabella (c). (d) mediante cella tipo n. 1 (fibroblasti) ad esempio, i geni per ordinare le celle possono essere visualizzate utilizzando un grafico a dispersione che illustra la dispersione del gene vs espressione media. La curva rossa mostra il taglio per geni utilizzati per l'ordinamento calcolato dal modello media-varianza mediante la funzione estimateDispersions di Monocle. Geni che soddisfano questa frequenza di taglio sono stati utilizzati per l'ordinazione pseudotime a valle. (e, f) Visualizzazione delle traiettorie di cella in un ridotto spazio bidimensionale colorata della cella "stato" (e) e di Monocle-assegnato "Pseudotime" (f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Questo protocollo descrive le procedure generali e controlli di qualità necessari per la preparazione di cellule singole mammifera adulte sane per le preparazioni di RNA-Seq unicellulare gocciolina-based, alta velocità di trasmissione. Parametri di sequenziazione, leggi l'allineamento e l'analisi bioinformatica di cella singola a valle sono inoltre forniti.

Gocciolina basati su codici a barre singola cella trascrittomica dei tessuti dei mammiferi adulti

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come la comprensione dei cambiamenti di espressione genica in migliaia di singole cellule dopo una lesione o una malattia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che ci permette di sezionare trascrizioni di singole cellule all'interno di un tessuto complesso e di apprezzare meglio le dinamiche funzionali all'interno di una data popolazione. Il vantaggio del nostro protocollo è che fornisce metodi completi, dall'isolamento di singole cellule nei tessuti primari, all'analisi e alla visualizzazione di questo set di dati.Sebbene questo metodo inizi da sospensioni uni-cellula dalla pelle e dal nervo, i metodi di sequenziamento che descriviamo possono essere applicati per studiare qualsiasi tessuto di mammiferi. A dimostrare questa procedura saranno Elodie Labit e Wisoo Shin, due tirocinanti del mio laboratorio. Per iniziare, sezionare il nervo sciatico di un topo eutanasiato tagliando prima la pelle dalla regione posteriore della parte posteriore del topo.Utilizzare una lama di bisturi sterile per fare un'incisione lungo la lunghezza della coscia. Quindi utilizzare forcep e forbici fini per esporre e rimuovere il nervo sciatico. Per sezionare la pelle dorsale posteriore, usa forcette e forbici fini per fare incisioni da spalla a spalla, attraverso la groppa e lungo la schiena.Lavare i tessuti due volte con HBSS ghiacciato. Al microscopio sezionato, rimuovere il tessuto connettivo indesiderato, i depositi di grasso o i detriti. Solo per la pelle, tagliare la pelle a fette sottili, usando una lama di bisturi sterile.Per ottenere il derma cutaneo, galleggiare le fette della pelle in dispasi, in HBSS in un piatto di 10 centimetri, per 30-40 minuti a 37 gradi Celsius. Utilizzare le forcep fini per sbucciare e separare l'epidermide dal derma, quindi scartare l'epidermide. Quindi, per la pelle e il nervo, utilizzare un paio di lame di bisturi steril per tritare ogni campione in pezzi da uno a due millimetri.Posizionare i pezzi di tessuto in un enzima collagenasi-quattro fredda appena scongelato, due grammi per millilitro in un tubo conico da 15 millilitri. Incubare ogni campione nell'enzima in un bagno Celsius di 37 gradi per 30 minuti con tremori delicati ogni 10 minuti. A 30 minuti, utilizzare un pipetter P1000 per triturare il tessuto da 20 a 30 volte e tornare al bagno d'acqua.Ripetere la triturazione ogni 30 minuti fino a quando la soluzione appare torbide e pezzi di tessuto sono in gran parte dissociati. Solo per la pelle, nell'ultima ora di incubazione, aggiungere un milligrammi per millilitro DNAsi al campione di pelle. Poiché alcuni tipi di cellule sono più sensibili di altri allo stress meccanico, tecniche di dissociazione eccessive possono biasime la popolazione.La dissociazione generale è fondamentale per ottenere elevate rese cellulari e una rappresentazione accurata della composizione tissutale. Successivamente, utilizzare un filtro da 40 micrometri sopra il tubo conico da 50 millilitri per filtrare due volte ogni campione di tessuto. Risciacquare il filtro con l'uno per cento di BSA/HBSS.Dopo aver centrifugato i campioni come descritto nel manoscritto, sospendere di nuovo il pellet cellulare in HBSS, contenente l'uno per cento di BSA, utilizzando una punta a foro largo, e posizionare sul ghiaccio. L'aggiunta di colorante di vitalità ti aiuterà a ottimizzare la tua preparazione. Dovresti mirare ad almeno l'80% di cellule vitali.Una volta ottimizzato, questo e altri passaggi di controllo qualità possono essere omessi al fine di accelerare il processo di dissociazione, che conserverà meglio la qualità dell'RNA e ridurrà la perdita cellulare. Per isolare le cellule vitali e sane utilizzando FACS, preparare prima tubi a fondo stretto da 15 millilitri con otto millilitri di BSA/HBSS per l'uno per cento ghiacciato per la raccolta dei campioni. Per garantire che l'interfaccia tra la superficie del liquido e l'interno del tubo sia umida e per prevenire la tensione statica e superficiale, invertire i tubi prima delle raccolte.Immediatamente dopo lo smistamento delle celle FACS, una volta raccolte le cellule in un tubo da 15 millilitri, utilizzare un millilitro dell'uno per cento di BSA /HBSS per lavare e spingere tutte le cellule verso il basso dalla superficie laterale del tubo. Quindi centrifugare ogni campione a 260 g per otto minuti. Dopo aver scartato il supernatante, sospendere di nuovo il pellet cellulare in BSA/HBSS all'uno per cento e aggiungere 33,8 microlitri a un tubo e tenere quel tubo sul ghiaccio.Questo passaggio è progettato per essere fatto utilizzando reagenti ottenuti da un kit standardizzato. Tutti i passaggi dimostrati devono essere eseguiti seguendo le istruzioni del produttore. Per prepararsi alla generazione GEM, posizionare un chip nel supporto del chip, preparare un mix di master di cellule sul ghiaccio, secondo il protocollo del produttore.Aggiungere 56,2 microlitri del mix principale a un tubo contenente 33,8 microlitri di autososo sospensione. Per preparare il chip, prima al 50% di glicerolo ai pozzi che non verranno utilizzati. Quindi aggiungere 90 microlitri del mix di master di cellule a ben uno, 40 microlitri di perline di gel a ben due e 270 microlitri di olio divisorio a ben tre.Coprire il chip con una guarnizione. Per caricare il chip ed eseguire in un controller a cella singola, espellere prima il vassoio. Metti il truciolo nel vassoio.Ritrarre il vassoio e premere play. Dopo l'esecuzione completa, raccogliere 100 microlitri del campione e posizionarli in un tubo PCR. Posizionare i tubi PCR in una macchina PCR preimpostata e funzionare in base al kit.Dopo la corsa, i GEM includeranno cDNA con codice a barre a lunghezza intera, da mRNA poliadenilato. Posizionare i tubi a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Procedere con la costruzione, il sequenziamento, l'allineamento e l'analisi della libreria.Una volta che i campioni sono sequenziati e allineati come descritto nel manoscritto, depositare i dati su un repository pubblico, come il GEO di NCBI. Per fare ciò, registrati per l'account di invio. Per prima cosa, completa l'invio GEO scaricando il foglio dei metadati.Assicurarsi di includere un solo foglio di metadati per invio del progetto. Inserire il foglio di calcolo nella directory. In secondo luogo, aggiungere il file di dati non elaborati generato dallo script di conteggio dei ranger di celle per tutte le librerie nella directory.La terza cartella è file di dati elaborati. Inserire nella directory i file di dati elaborati generati dallo script del conteggio dei ranger di celle per tutte le librerie. Utilizzare le credenziali del server FTP dell'inviatoRE GEO per trasferire la directory contenente tutti e tre i componenti.Dopo aver eseguono Cell Ranger, le matrici di codici a barre geniche pronte per l'analisi possono essere ulteriormente elaborate utilizzando bioinformatica avanzata. In primo luogo, i controlli della quantità pre-elaborazione sono stati effettuati utilizzando il pacchetto Seurat R, che ha generato trame di violino e dispersione per visualizzare il numero di geni, il numero di identificatori molecolari univoci e la percentuale di geni mitocondriali per identificare doppietti cellulari e valori anomali. Per la selezione dei componenti principali, o PC, sono stati utilizzati grafici a gomito, in cui sono stati esclusi PC oltre l'altopiano della deviazione standard dell'asse del PC.Anche la risoluzione del clustering è stata manipolata. La bassa risoluzione ha portato a un minor numero di cluster di celle, con ogni cluster che probabilmente rappresenta un tipo di cella definito. L'alta risoluzione portò ad una maggiore probabilità cellulare, che rappresentava sottotipi, o stati di transizione, di una popolazione cellulare.Le impostazioni dei cluster a bassa risoluzione sono state utilizzate per ulteriori analisi delle mappe di calore di espressione per identificare i geni più espressi in un dato cluster. I singoli geni candidati sono stati visualizzati su appezzamenti tSNE, usando la funzione feature plot di Seurat, che ha permesso la decifrazione, se ci fossero ammassi che rappresentavano, ad esempio, macrofagi. Sia il cluster due che quattro espressero CD68, un marcatore pan-macrofago.Altri pacchetti forniscono anche strumenti per il controllo di qualità, ad esempio Monocle, un pacchetto R utilizzato per costruire traiettorie cellulari, rimuove le celle di scarsa qualità e garantisce che la distribuzione dell'mRNA tra tutte le celle sia normale al log e cada tra i limiti superiore e inferiore. Le singole cellule sono state quindi classificate e contate, utilizzando geni marcatori di lignaggio noti, e le cellule che esprimono marcatori di interesse sono state assegnate al tipo di cellula numero uno. È stato determinato che il tipo di cellula numero uno erano i fibroblasti.Questa popolazione è stata valutata per costruire la traiettoria di sviluppo dei fibroblasti. Seguendo questa procedura, altri metodi come la PCR quantitativa, l'ibridazione in situ, una chimica immunista devono essere eseguiti per convalidare l'accuratezza dei risultati dell'espressione genica. Il sequenziamento dell'mRNA a cellule singole ha ora spianato la strada ai ricercatori in molti campi diversi per esplorare l'eterogeneità cellula-cellula e identificare la dinamica funzionale all'interno di diversi tessuti durante l'omeostasi, e come questi possono cambiare dopo la lesione o nello sviluppo della malattia.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Microiniezione intranucleari di DNA in dissociato neuroni dei mammiferi adulti

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Ricerca

Biologia

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Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

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Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Crescita anaerobica e la manutenzione di linee cellulari di mammifero

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