Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
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우리는 캘거리 대학에서 동물 관리 시설 직원 뿐만 아니라 UCDNA 서비스 시설에서 지원 직원을 인정합니다. 우리는 그의 생물 정보학 지원에 대 한 매트 Workentine와 옌스 Durruthy 그의 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 jb에 요, 및 친교 (대표)는 알버타 어린이 건강 연구 연구소 CIHR 새로운 탐정 수상 CIHR 그랜트 (R.M. 그리고 jb에 요)에 의해 자금.

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이 프로토콜 방법을 보여 줍니다 단 세포의 적절 한 준비 수 단일 세포의 수천의 transcriptional이 밝히기 차별 기능 상태 또는 조직 내에서 고유한 세포 id. 프로토콜과 형광 기자 단백질 또는 유전자 변형 도구를 필요로 하지 않는 인간;에서 그들을 포함 하는 관심의 다양 한 조직에서 단일 세포의 분리에 적용 될 수 있습니다. 각 조직 명심 독특한 이며이 프로토콜 조정/수정 어느 정도 필요 합니다.
세포 내에서 다양 하 고 높은 동적 transcriptional 프로그램 단일 셀 유전체학의 가치를 강조 했다. 높은-품질 RNA 분리, 이외에도 고품질 데이터 집합에 필요한 중요 한 샘플 준비 단계 세포 조직에서 발표 완전히 되 고 세포가 건강 하 고 그대로 하도록 이다. 이것은 상대적으로 곧장 앞으로 쉽게 세포를 수집 발표, 순환 셀 또는 셀 느슨하게 그대로 유지 하는 조직에 림프 조직 같이. 하지만이 다른 성인 조직, 세포 외 기질 및 자주 엄밀한 cytoskeletal 단백질 세포 구조를 유지에 관련 된 큰 거리에 걸쳐 선진국 세포질 건축 때문에 도전적 일 수 있다. 심지어 적절 한 분리에 대 한 기술로 셀의 전체 릴리스, 잠재적인 필요한 엄격 하 고 종종 긴 처리 mRNA 품질 및 셀 무결성을 변경할 것입니다. 또한, 효소를 이용한 분리에 사용 되는 높은 온도 transcriptional 서명29,30또한 영향을 미칩니다. 프로토콜의 현재 품질 관리 검사, 최적화 이러한 장애물을 극복 하는 데 도움이 수 어떻게 보여 조직 myelinated 성인 신경 및 세포 외 매트릭스 풍부한 성인 피부 등을 사용 하 여입니다.
어떤 scRNA-Seq 실험을 설계할 때 주요 고려 시퀀싱 깊이의 선택입니다. 시퀀싱을 매우 다중화 하 고 읽을 수 있는 깊이 최대 5 백만 읽기/셀14 스마트가 같은 전체 길이 RNA-Seq 방법을 사용 하 여 드롭-Seq2 를 사용 하 여 매우 낮은 것에서 변화할 수 있다 대부분 scRNA-Seq 실험은 일반적으로 셀 형식을 분류41,42에 대 한 충분 한 시퀀싱 10000 읽기/셀, 낮은과 중간에 높은 식 성적을 감지할 수 있습니다. 얕은 시퀀싱 깊이 복잡 한 조직 세포의 수천 드문 인구를 자신 있게 돌리다 필요할 어디에 걸쳐 희귀 세포 인구를 감지 하려는 경우 시퀀싱 비용에 저장 하는 값입니다. 하지만 얕은 깊이 시퀀싱 유전자 발현과 관련 된 미묘한 transcriptional 서명 프로세스에 대 한 자세한 내용은 필요한 경우 적합 하지 않습니다. 현재, 그것은 500000 읽기/셀, 셀에 유전자의 대다수는 발견 하지만이 프로토콜에 따라 다를 수 있습니다 및 조직 입력43,44추정. 전장 사본 시퀀싱 어셈블리에 대 한 필요를 circumvents 및 따라서, 소설 또는 드문 결합 이체를 검색할 수 있습니다, 하는 동안 자주 시퀀싱 비용 스케일링 복잡 한 조직 시스템을 구성 하는 세포의 수천 검토를 같은 접근 제한. 반면, 3' 태그가 단일 셀 라이브러리와 같은 일반적으로이 프로토콜에서 설명 하는 것 들 낮은 복잡도 얕은 시퀀싱을 필요로. 5 지원된 시퀀서 중 하나에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 라이브러리의 순차를 설정할 수는 주의 하는 것이 중요 하다: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 빠른 실행 및 높은 출력, 4) NextSeq 500/550, 및 5) MiSeq.
섬세 한 조직 및 세포 아직 처리를 위한 필요를 감소 시키는 다른 접근 방법 단일 셀 RNA-Seq, 단일 셀 RNA-Seq의 혜택의 일부를 유지, 단일 핵45에서 RNA의 분석 이다. 이 이렇게는 RNA 저하, 그리고 더 많은 극단적인 조치, 핵의 적절 한 릴리스를 줄이고 더 빠른 처리를 허용 하 고 따라서 가능성이 해당된 조직 내에서 모든 셀을 나타내는 transcriptional 프로필의 자부 캡처 수 있습니다. 이 물론,만 따라서 따라 어떤 실험 목표가이 접근 하거나 적합 하지 않을 수 있습니다 관심의 특정된 셀 내에서 현재 transcriptional 활동의 일부를 제공할 것 이다.
특정된 조직 내에서 세포 id의 완전 한 특성, 외 scRNA-Seq 데이터 집합에 대 한 가장 중요 한 분석 중 하나는 '정의' 세포 인구에 걸쳐 중간 transcriptional 상태의 평가 이다. 이러한 중간 상태 전통적인 대량 RNA-Seq 접근 가능 했던 식별된 인구 내의 셀 간의 혈통 관계에 대 한 통찰력을가 르 친다 수 있습니다. 여러 scRNA-Seq bioinformatic 공구 지금이 명료 하 게 개발 되었습니다. 이러한 도구는, 예를 들어 암 세포 종양/전이성 상태로 전환 다양 한 터미널 운명 또는 상태와 무부하 상태 사이 왕복 하는 면역 세포로 성숙 하는 줄기 세포 관련 프로세스를 평가할 수 있습니다. 셀에 미묘한 transcriptome 차이 계보 편견, FateID, 같은 최근에 개발한 bioinformatic 도구47유추할 수 표시 될 수 있습니다. 이후 세포 전환 사이의 구분은 어려울 수 있습니다, 그리고 깊은 시퀀싱 필요한46수 transcriptional 차이 주어진 확인 미묘한 수 있습니다. 다행히, 다른 흐름 셀에 라이브러리를 다시 실행 하 여 데이터 집합을 추가 조사에 관심이 얕게 시퀀스 된 도서관의 범위를 늘릴 수 있습니다.
함께 찍은,이 프로토콜 transcriptionally 프로 한 실험에서 단일 세포의 수천 수백 사용자 수 있게 하는 적응 하기 쉬운 워크플로우를 제공 합니다. ScRNA-Seq 데이터 집합의 마지막 품질 최적화 된 세포 격리, cytometry, cDNA 라이브러리 생성 및 원시 유전자 바코드 매트릭스의 해석에 의존합니다. 이 위해,이 프로토콜에는 다양 한 조직 유형의 연구를 사용 하도록 쉽게 수정할 수 있는 모든 주요 단계에 대 한 포괄적인 개요를 제공 합니다.

높은 처리량 단일 셀 기술1,2 와 지난 10 년간3사용자 친화적인 생물 정보학 도구 발전의 개발, 고해상도 유전자 표정 분석의 새로운 필드가 나왔다- 단일 셀 RNA 시퀀싱 (scRNA-Seq) 단일 셀 유전자 발현의 연구 처음 줄기 세포 또는 암 세포, 정의 된 세포 인구 내에서 식별 하거나 식별 어려운 사용 하는 셀의4,5, 드문 인구 개발 되었다 전통적인 대량 RNA 시퀀싱 기법입니다. 소설 부분 모집단 (Seurat)2, psuedotime 공간 (Monocle)6, 인구 (또는 내 활성 신호 네트워크의 정의 따라 셀 순서의 시각화의 식별을 가능 하 게 Bioinformatic 도구 아름 다운)7, 단일-셀 (Seurat, 그리고 더 많은) 인공 3D 공간에서의 조립의 예측8. 이러한 새롭고 흥미로운 분석 과학 지역 사회에 사용할 수 있는, scRNA-Seq 빠른-되고있다 유전자 표정 분석에 대 한 새로운 표준 접근을.
ScRNA-Seq의 광대 한 잠재력에도 불구 하 고 깨끗 한 데이터 집합을 생성 하 고 결과 정확 하 게 해석 하는 데 필요한 기술 skillsets 이민자를 전하실 수 있습니다. 여기, 기본적인, 하지만 포괄적인 프로토콜 (그림 1) 제시 시각화를 전체 기본 조직에서 단일 세포의 분리 및 게시에 대 한 데이터의 프레 젠 테이 션에서 시작 합니다. 첫째, 건강 한 세포의 격리 수 있습니다 간주 도전, 효소 소화와 후속 기계적 분리에 감도의 그들의 정도에 따라 다릅니다 다른 조직. 이 프로토콜 이러한 격리 단계에 제공 하 고 과정 전반에 걸쳐 중요 한 품질 관리 검사점을 식별 합니다. 둘째, 호환성 및 단일 셀 기술 및 차세대 시퀀싱 사이 요구 사항 이해 복잡할 수 있다. 이 프로토콜 구현 하는 사용자 친화적인, 드롭릿 기반 단일 셀 barcoding 플랫폼 및 시퀀싱을 수행 하는 지침을 제공 합니다. 마지막으로, 컴퓨터 프로그래밍은 단일 셀 transcriptomic 데이터 집합을 분석 하기 위한 중요 한 전제 조건입니다. 이 프로토콜 R 프로그래밍 언어에서 시작 하기 위한 리소스를 제공 하 고 구현 하는 두 개의 인기 있는 scRNA Seq 관련 R 패키지 지침을 제공 합니다. 함께,이 프로토콜 명확 하 고, 해석할 결과 얻기 위해 scRNA-Seq 분석 수행에 신규 이민자 가이드 수 있습니다. 이 프로토콜, 마우스에서 대부분 조직에 조정 될 수 있다 그리고 중요 한 것은 인간 직물을 포함 한 다른 유기 체와 함께 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다. 조직 및 사용자에 따라 조정 해야 합니다.
다음이 프로토콜; 하는 동안 마음에 계속 몇 가지 고려 사항이 포함 하 여, 정확한 요약 셀 숫자 카운트 ( 그림 2에에서 요약 하면서 관심의 샘플 내에서 모든 셀의 가능한 단일 세포 현 탁 액을 되도록 권장 1) 다음 단계 1에서 모든 품질 관리 지침과이 프로토콜의 2 ). 일단이 이루어집니다, 그리고 품질 관리 단계를 삭제할 수 있습니다 모든 최적화 된 조건을 따른다면 (에 시간-절약 RNA 품질을 유지 하 고 감소 셀 손실). 높은 생존의 조직에서 단일 세포의 성공적인 격리 확인는 매우 추천 전에 다운스트림 처리 합니다. 2) 일부 세포 유형 스트레스를 다른 사람 보다 더 민감한 때문에, 과도 한 분리 기술 인구, 따라서 다운스트림 분석을 혼동 편견 실수로 수 있습니다. 불필요 한 세포 전단 및 소화 하지 않고 부드러운 분리는 높은 세포 수율과 조직 구성의 정확한 표현을 달성 하기 위한 중요 합니다. 전단 세력 분쇄, FACS, 물의 resuspension 단계 동안 발생합니다. 3)로 모든 RNA 일 그것은 최고의 작은 추가 RNase 가능한 샘플으로 준비 하는 동안 소개 하. 이 높은-품질 RNA를 유지 하는 데 도움이 됩니다. 청소 도구 및 모든 장비는 하지 rinsing ribonuclease 억제제 솔루션 사용 RNase 무료 DEPC 처리 제품을 피 하지만. 4) 가능한 한 빨리 준비를 수행 합니다. 이 높은-품질 RNA를 유지 하 고 세포 죽음을 줄이기 위해 도움이 됩니다. 조직 절 개 길이 동물 숫자에 따라 동시에 여러 해/준비를 시작 하는 것이 좋습니다. 5)을 유지 하는 고품질 RNA, 세포 죽음, 천천히 가능한 세포 신호 그리고 transcriptional 활동 때 얼음에 셀을 준비 합니다. 이기는 하지만, 얼음 처리는 대부분 세포 유형, 실 온에서 처리 될 때 일부 세포 유형 (예를들면, 중 성구) 더 나은 수행 합니다. 6) 피하 칼슘, 마그네슘, EDTA, DEPC 처리 제품 셀 준비 중.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

조직 또는 microenvironment 내에서 개별 셀의 수천에 걸쳐 단일 세포 유전자 발현의 분석은 식별 셀 구성, 기능 및의 밑에 관찰 된 조직 하는 분자 경로 차별 하기 위한 유용한 도구 함수 및 동물성 행동입니다. 그러나, 후속 다운스트림 단일 세포 분자 분석에 대 한 성인 포유류 조직에서 그대로, 건강 한 세포의 고립 전하실 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 일반 프로세스 및 품질 관리 신 시스템에서 높은-품질 성인 단일 셀 준비 하거나 피부를 위해 필요한 설정 이후 편견된 단일 셀 RNA 시퀀싱 및 분석 검사. 다운스트림 bioinformatic 분석에 대 한 가이드도 제공 됩니다.

ScRNA-Seq 데이터 집합을 분석 하도록 하는 오픈 소스 패키지의 레 퍼 토리는 이러한 패키지 사용 R 기반 언어3의 대다수와 가진40 극적으로 증가 했다. 여기, 두이 패키지를 사용 하 여 대표 결과 표시 됩니다: 평가의 자동된 그룹화 유전자 발현을 기반으로 셀을 단일 고 해결 궤적을 따라 하나의 셀을 순서이 세포 생물학 재조 처리합니다.
그림 4 는 미리 품질 검사 및 다운스트림 생물 정보학 분석을 처리 하기 위한 Seurat의 사용을 보여 줍니다. 첫째, 여과 및 분석에서 비정상적인 세포의 제거 품질 검사를 위해 필수적 이다. 이 미토 콘 드리 아 유전자, 유전자 (nGene)의 수 및 셀 남자와 outliers 식별 하 우미 (nUMI)의 수의 비율을 시각화 (그림 4b) 플롯 바이올린 (그림 4a)과 분산형을 사용 하 여. 분명 국외 자 수 유전자, 우미, 또는 미토 콘 드리 아 유전자의 비율의 어떤 셀 Seurat의 FilterCells 함수를 사용 하 여 제거 되었습니다. Seurat는 주성분 (PC)를 사용 하 여 이후 분석 점수 클러스터 셀, 통계적으로 중요 한 Pc 포함 하도록 결정에 중요 한 단계 이다. 팔꿈치 작 (그림 4c) PC 선택,' PC의 표준 편차 ' 고원 넘어 어떤 Pc에서 축 제외 했다 사용 되었다. 클러스터링의 해상도 또한 4 (높은 해상도 높은 세포 클러스터, 그림 4e 선도 하는 클러스터 수 변경할 수 있습니다, 0.4 (낮은 해상도 적은 셀 클러스터, 그림 4 d로 이어지는)에서 이르는 시연 조작 했다 ). 낮은 해상도, 높은 해상도에서 이것 또한 대표 있습니다 하위 또는 셀 인구의 과도 상태 반면 각 클러스터 정의 셀 형식을 나타내는 가능성이 높습니다. 이 인스턴스에서 저해상도 클러스터 설정은 특정된 클러스터 (그림 4 층)에서 가장 높은 표현된 유전자를 식별 하 식 heatmaps (Seurat의 DoHeatmap 함수를 사용 하 여) 추가 분석을 위해 사용 되었다. 이 경우 가장 높은 표현된 유전자는 각 클러스터를 고유 하 게 정의 된 유전자에 의해 표현 되었다 보여주는, 모든 다른 클러스터에 비해 특정된 클러스터에 차동 식 평가 하 여 확인 되었다. 또한, 개별 후보 유전자에 tSNE 음모에 Seurat의 FeaturePlot 기능 (그림 4 g)를 사용 하 여 구상 될 수 있다. 이 대 식 세포를 나타내는 클러스터 있었는지 해독에 대 한 허용. FeaturePlot를 사용 하 여, 우리 둘 다 2 클러스터 발견 4 Cd68-팬-대 식 세포 마커를 표현 했다.
단 안경 패키지 생물학 과정 (그림 5) 정리를 셀 클러스터에 Seurat, 식별을 확실 한지 알아보는 그리고 셀 궤도, 또는 pseudotemporal 주문, 건물 사용 되었다. Pseudotemporal 주문 사용할 수 있습니다 샘플에 대 한 단일 셀 식 프로필 생물 시간 코스를 따라 것으로 예상 된다. 셀 중간 상태, 두 대체 세포 운명의 분기 포인트를 해결 하기 위해 pseudotemporal 연속체를 따라 주문 될 수 있다 고 진 서명 인수 각 운명의 기본을 식별 합니다. 첫째, Seurat의 여과와 유사한 모든 셀에 걸쳐 mRNA의 분포는 로그 정상과 떨어진 사이 위와 더 낮은 그림 5a에서 식별 되는 가난한 품질 세포 제거 되었습니다. 단 안경의 newCellTypeHierarchy 함수를 사용 하 여 단일 세포 분류 되었다 그리고 알려진된 혈통 마커 유전자 (그림 5b, 5c)를 사용 하 여 계산 합니다. 예를 들어 PDGF 수용 체 알파 또는 섬유 특정 단백질 1을 표현 하는 세포를 만드는 섬유 아 세포를 정의 하기 위한 기준 셀 형식 # 1에 할당 했다. 다음,이 인구 (셀 타입 #1) 해독 구와 궤적을 평가 했다. 이 인구 내의 극단적인 상태를 나타내는 셀을 비교 하 고 (그림 5 d) 인구의 나머지 셀을 정렬 하기 위한 차동 유전자 발견 단 안경의 차동 GeneTest 함수 이용 되었다. 모든 셀에 걸쳐 매니폴드 학습 방법 (비-선형 차원 감소의 형식)을 적용 하 여 pseudotemporal 경로 따라 좌표 지정 되었다. 이 궤적은 다음 셀 주 (그림 5e) 및 pseudotime (그림 5 층)에 의해 시각.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> 그림 1: 순서도. 단일 분석에서 전체 동물 준비 단계 세포 RNA-Seq 집합 공개적으로 사용 가능한 저장소에 마지막 데이터 집합을 제출. 유제 (보석)에 젤 구슬 구슬 수천 단일 세포의 캡슐화는 바코드 oligonucleotides와를 참조 하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> 그림 2: 신경 조직에서 가능한 단일 세포 현 탁 액을 만들기. (a) 품질 관리 검사의 개요 만화. (b) 세포 및 세포 잔해는 아직도 파편 (빨간색 화살표)에 통합. (c) 세포 파편 (빨간색 화살표)에서 발표 했다. (FACS d) 세포 격리입니다. P0: 파편 분수; P1: 셀 같은 분수; Duplets;의 P3: 제외 P4: 생존 염료 (Sytox 오렌지) 부정적인 분수. (e) 생존 염료 컨트롤입니다. (f) 고립 된 파편을 대표 하는 P0 분수의 이미지. (g) 분리 가능한 셀 (빨간색 화살표)을 대표 하는 P4 분수의 이미지. (b) (c) (f) 및 (g) 핵 염료 이미징 하기 전에 20 분을 추가 했다. 스케일 바: 80 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> 그림 3: 처리 샘플 X 10에 복구 된 셀의 수를 예측 하는 얕은 시퀀싱. (a) 예 (예제 1.6) MiSeq에서 생성 된 csv 셀 바코드와 그 해당 우미의 자신 있게 매핑된 읽기에 따라 계산 됩니다. (b) 바코드 샘플 1.6에 대 한 순위 음모 셀 바코드의 기능으로 우미 수에 1 개의 중요 한 하락을 보여줍니다. 파선 및 고체 라인 셀과 검사에 의해 결정 되는 배경 간의 구분을 나타냅니다. (c) 셀 바코드 얕은 시퀀싱 정확 하 게 샘플 1.6에 대 한 셀의 개수를 계산 하는 것을 밝혀 셀 레인저 파이프라인 게시물-HiSeq를 사용 하 여 관찰. (d) 얕은 시퀀싱에 따라 흐름 셀 설정의 예는 셀 견적 파생. 1.6 샘플에 대 한 얕은 시퀀싱 예측 3480 셀 이후 1.17 차선 되도록 할당 된 > 셀 시퀀싱 범위 HiSeq에서 당 100000 읽습니다. 참고: 모든 차선은 100%를 추가 해야 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> 그림 4: 품질 관리 및 Seurat R 패키지를 사용 하 여 단일 셀 RNA-Seq dataset의 생물 정보학. (a) 유전자의, 독특한 분자 식별자 (Umi)의 수 및 미토 콘 드리 아 게놈에 성적 비율을 포함 하는 품질 관리 통계의 구획. (b) 샘플 유전자 감지 세포 미토 콘 드 리아 성적 및 Umi의 비정상적인 수준으로 플롯합니다. (c) 샘플 팔꿈치 줄거리 통계적으로 중요 한 Pc의 임시 결정에 사용. 대시 및 도트 점선 라인 그래프에서 분명 "팔꿈치"이 되는 컷오프를 나타냅니다. 이 팔꿈치 전에 PC 차원 다운스트림 분석에 포함 됩니다. (d, e) 그래프 기반 셀 클러스터 tSNE 플롯을 사용 하 여 저 차원 공간에서 두 개의 다른 해상도에서 시각. (f) 위쪽 표시자 유전자 (노란색) 각 클러스터에 대 한 Seurat의 DoHeatmap 함수를 사용 하 여 식 heatmap에 시각. (g)의 예, Cd68 유전자 세포 (보라색) Seurat의 FeaturePlot 함수를 사용 하 여 나타내는 마커 식 머릿속으로. 이 2-4 (패널 d)이 데이터이 집합의 해당 클러스터 세포를 나타냅니다 나왔다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> 그림 5: 세포 분류 및 Monocle 툴킷을 사용 하 여 peudotemporal 궤적을 따라 주문. (a)는 샘플의 모든 셀에 걸쳐 mRNA (우미 카운트에서 유추)의 분포를 검사 합니다. 만 셀 0-사이 mRNA ~ 20000 다운스트림 분석을 위해 이용 되었다. (b의 c) 할당 하 고 셀 형식이 알려진된 계보 셀 표식에 따라 계산 합니다. 예를 들어 PDGF 수용 체 알파 또는 섬유 특정 단백질 1을 표현 하는 셀에 할당 된 셀 형식 #1 팬-섬유 아 세포를 나타내는 단 안경의 newCellTypeHierarchy 함수를 사용 하 여. 다른 세포 유형의 수 (b) 원형 차트 및 테이블 (c)으로 구상 될 수 있다. (d) 셀을 사용 하 여 형식 #1 (fibroblasts) 예를 들어, 셀 평균 식 대 진 분산을 보여 주는 산 점도 사용 하 여 구상 될 수 있다 주문에 사용 되는 유전자. 빨간 곡선 유전자 단 안경의 estimateDispersions 함수를 사용 하 여 평균-분산 모델에 의해 계산 된 주문에 대 한 사용에 대 한 구분을 보여 줍니다. 이 구분을 충족 하는 유전자는 다운스트림 pseudotime 주문 사용 되었다. (e, f) 셀의 "국가" (e)와 단 안경에 할당 된 "Pseudotime" (f)에 의해 감소 된 2 차원 공간에서 셀 궤적의 시각화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

이 프로토콜에서는 일반적인 프로세스를 설명 합니다 및 품질 관리 검사 드롭릿 기반, 높은 처리량 단일 셀 RNA-Seq 준비에 대 한 건강 한 성인 포유류 단일 세포를 준비에 필요한. 시퀀싱 매개 변수, 읽기 정렬 및 다운스트림 단일 셀 bioinformatic 분석 또한 제공 됩니다.

드롭릿 바코드 기반 단일 셀 Transcriptomics 성인 포유류 직물의

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

이 방법은 미생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 부상이나 질병 후 단일 세포의 수천에 걸쳐 유전자 발현 변화를 이해하는 등. 이 기술의 주요 장점은 복잡한 조직 내에서 개별 세포의 전사를 해부하고 주어진 인구 내에서 기능적 역학을 더 잘 이해할 수 있다는 것입니다. 프로토콜의 장점은 1차 조직에서 단일 셀의 격리에서부터 이 데이터 집합의 분석 및 시각화에 이르기까지 포괄적인 방법을 제공한다는 것입니다.이 방법은 피부와 신경에서 단세포 현탁액에서 시작되지만, 우리가 설명하는 시퀀싱 방법은 모든 포유류 조직을 연구하기 위해 적용 될 수있다. 이 절차를 시연하는 것은 로디 라비트와 내 실험실에서 온 두 명의 연수생인 신위수입니다. 시작하려면, 먼저 마우스의 뒤쪽의 뒷부위에서 피부를 절단하여 안락사 마우스의 상시 신경을 해부.멸균 메스 블레이드를 사용하여 허벅지 길이를 따라 절개를 합니다. 그런 다음 미세 한 집게와 가위를 사용하여 좌골 신경을 노출하고 제거하십시오. 등불 뒤쪽 피부를 해부하려면 미세한 집게와 가위를 사용하여 어깨에서 어깨, 엉덩이를 가로 질러, 그리고 뒤쪽으로 절개를합니다.얼음 차가운 HBSS로 조직을 두 번 씻으시면 됩니다. 해부 현미경에서 원치 않는 결합 조직, 지방 예금 또는 이물질을 제거하십시오. 피부만을 위해, 멸균 메스 블레이드를 사용하여 얇은 조각으로 피부를 잘라.피부 진피를 얻으려면, 10 센티미터 접시에 HBSS에 디스파스에 피부 조각을 플로트, 37섭씨37도에서 30 ~ 40 분 동안. 미세 한 집게를 사용하여 표피를 벗겨 진피에서 분리한 다음 표피를 폐기하십시오. 그런 다음 피부와 신경을 위해 멸균 메스 블레이드 한 쌍을 사용하여 각 샘플을 1 ~ 2 밀리미터 조각으로 다진다.15 밀리리터 원추형 튜브에 밀리리터 콜드 콜라게나아제-4 효소 당 2그램의 티슈 피스를 갓 해동합니다. 37도의 섭씨 욕조에서 효소에 각 샘플을 30분 간 배양하여 10분마다 부드럽게 흔들어 보시고 있습니다. 30분 만에 P1000 피프터를 사용하여 조직을 20~30회 세리세게 하고 수조로 돌아갑니다.용액이 흐릿해 질 때까지 30분마다 반복하여 조직 덩어리가 크게 해리됩니다. 피부만을 위해, 인큐베이션의 마지막 시간에, 피부 샘플에 밀리리터 DNAse 당 1 밀리그램을 추가합니다. 일부 세포 유형은 기계적 스트레스에 다른 사람보다 더 민감하기 때문에 과도한 해리 기술은 인구를 편향시킬 수 있습니다.일반적인 해리는 높은 세포 수율을 달성하고 조직 구성의 정확한 표현을 달성하는 데 중요합니다. 그 후, 50 밀리리터 원판 튜브 위에 40 마이크로미터 필터를 사용하여 각 조직 샘플을 두 번 필터링하십시오. 1%의 BSA/HBSS로 필터를 헹구습니다.원고에 설명된 바와 같이 샘플을 원심분리한 후, HBSS의 세포 펠릿을 다시 중단하고, 1% BSA를 함유하고, 넓은 보어 팁을 사용하고, 얼음 위에 놓습니다. 생존 성 염료를 첨가하면 준비를 최적화하는 데 도움이됩니다. 당신은 적어도 목표로해야 80 % 실행 가능한 세포.최적화되면, 이 및 그밖 품질 통제 단계는 RNA 질을 더 잘 보존하고 세포 손실을 감소시키는 해리 프로세스를 서두르기 위하여 생략될 수 있습니다. FACS를 사용하여 실행 가능하고 건강한 세포를 격리하려면 먼저 샘플 수집을 위해 8 밀리리터의 얼음 냉기 1% BSA/HBSS로 15밀리리터 좁은 바닥 튜브를 준비합니다. 액체 표면과 튜브 내부 사이의 인터페이스가 촉촉하고 정적 및 표면 장력을 방지하기 위해 수집 전에 튜브를 반전시려면.FACS 세포 선별 직후, 세포가 15 밀리리터 튜브에서 수집되면, 1%의 BSA/HBSS의 1밀리리터를 사용하여 모든 세포를 세척하고 튜브의 측면 표면에서 아래로 밀어 넣습니다. 그런 다음 각 샘플을 260g에서 8분 동안 원심분리합니다. 상체를 폐기한 후, 세포 펠릿을 1% BSA/HBSS로 다시 중단하고 튜브에 33.8 마이크로리터를 추가하고 그 튜브를 얼음 위에 보관합니다.이 단계는 표준화된 키트에서 얻은 시약을 사용하여 수행되도록 설계되었습니다. 입증된 모든 단계는 제조업체의 지침에 따라 수행해야 합니다. GEM 생성을 준비하기 위해 칩 홀더에 칩을 배치하여 제조업체의 프로토콜에 따라 얼음에 셀 마스터 믹스를 준비합니다.마스터 믹스의 56.2 마이크로리터를 33.8 마이크로리터의 자체 서스펜션이 들어있는 튜브에 추가합니다. 칩을 준비하려면, 먼저 50 % 글리세롤에서 사용하지 않을 우물에. 그런 다음 셀 마스터 믹스의 마이크로리터 90개를 잘 1개, 젤 비드 40마이크로리터에 2개, 분할 오일 270마이크로리터를 3개에 잘 넣습니다.개스킷으로 칩을 덮습니다. 칩을 로드하고 단일 셀 컨트롤러에서 실행하려면 먼저 트레이를 배출합니다. 칩을 트레이에 놓습니다.트레이를 철회하고 재생을 누릅니다. 전체 실행 후, 샘플의 100 마이크로 리터를 수집하고 PCR 튜브에 배치합니다. PCR 튜브를 미리 설정된 PCR 기계에 놓고 키트에 따라 실행합니다.실행 후, GEM은 폴리아데니얼 된 mRNA에서 전체 길이, 바코드 cDNA를 포함한다. 하룻밤 사이에 튜브를 영하 20도에 놓습니다. 라이브러리 구성, 시퀀싱, 정렬 및 분석을 진행합니다.샘플이 원고에 설명된 대로 시퀀싱되고 정렬되면 NCBI의 GEO와 같은 공용 저장소에 데이터를 예치합니다. 이렇게 하려면 제출자 계정에 등록합니다. 먼저 메타데이터 시트를 다운로드하여 GEO 제출을 완료합니다.프로젝트 제출당 메타데이터 시트를 하나만 포함해야 합니다. 스프레드시트를 디렉터리에 배치합니다. 둘째, 디렉터리에 모든 라이브러리에 대한 셀 레인저 카운트 스크립트에서 생성된 원시 데이터 파일을 추가합니다.세 번째 폴더는 처리된 데이터 파일입니다. 모든 라이브러리에 대한 셀 레인저 수 스크립트에서 생성된 처리된 데이터 파일을 디렉터리에 배치합니다. GEO 제출자의 FTP 서버 자격 증명을 사용하여 세 가지 구성 요소가 모두 포함된 디렉터리를 전송합니다.세포 레인저를 실행 한 후, 분석 준비 유전자 바코드 행렬고급 생물 정보학을 사용하여 추가 처리 될 수있다. 첫째, 전처리 수량 검사는 세포 이중및 이상값을 확인하기 위해 유전자 수, 독특한 분자 식별자 수 및 미토콘드리아 유전자의 백분율을 시각화하기 위해 바이올린 및 분산 플롯을 생성한 Seurat R 패키지를 사용하여 수행되었습니다. 주요 구성 요소 또는 PC의 선택을 위해, 팔꿈치 플롯이 사용되었으며, PC 축의 표준 편차의 고원을 넘어 있는 PC는 제외되었다.클러스터링 해상도도 조작되었습니다. 낮은 해상도로 인해 셀 클러스터수가 줄어들었고 각 클러스터는 정의된 셀 유형을 나타냅니다. 고해상도는 세포 집단의 하위 유형 또는 과도기 상태를 나타내는 더 높은 세포 확률로 이어졌습니다.저해상도 클러스터 설정은 지정된 클러스터에서 가장 높게 발현된 유전자를 식별하기 위해 발현 히트 맵의 추가 분석을 위해 사용되었습니다. 개별 후보 유전자는 tSNE 플롯에 시각화되었다, Seurat의 기능 플롯 기능을 사용하여, 그 해독을 허용, 나타내는 클러스터가 있었는지 여부, 예를 들어, 대식 세포. 클러스터 2와 4 모두 팬 대식세포 마커인 CD68을 발현하였다.다른 패키지는 또한 품질 관리를 위한 도구를 제공합니다, 예를 들어, Monocle, 세포 궤적을 구축하는 데 사용되는 R 패키지, 가난한 품질의 세포를 제거하고, 모든 셀에 걸쳐 mRNA의 분포가 정상으로 로그되도록, 상부와 하한 사이에 떨어졌다. 그 때 단일 세포는 공지된 혈통 마커 유전자를 사용하여 분류및 계산되었고, 관심있는 마커를 발현하는 세포는 세포 유형 1에 할당되었다. 세포유형 1호는 섬유아세포라고 판단되었다.이 인구는 섬유아세포 발달 궤적을 구축하기 위해 평가되었다. 이 절차에 따라, 정량적 PCR 과 같은 다른 방법, 시상 혼성화에서, 면역 화학은 유전자 발현 결과의 정확성을 확인하기 위해 수행되어야한다. 단세포 mRNA 염기서열분석은 이제 많은 다른 분야의 연구원들이 세포 간 이질성을 탐구하고, 항상성 동안 다른 조직 내의 기능적 역학을 식별하고, 부상 후 또는 질병의 발달 에서 어떻게 변화할 수 있는지에 대한 길을 열었습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Dissociated 성인 포유류의 뉴런으로 DNA의 Microinjection Intranuclear

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

연구

생물학

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

성인 Zebrafish에서 기관의 해부

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

혐 기성 성장 및 포유류 세포의 유지 보수

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 성인 피부 조직에서 인간 멜라닌 세포의 수율을 강화

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...