Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Vi erkjenner støttepersonale på UCDNA tjenester anlegget og Animal Care anlegg personalet på University of Calgary. Vi takker Matt Workentine bioinformatics underhold og Jens Durruthy hans kundestøtte. Dette arbeidet ble finansiert av en CIHR grant (RM og JB), en CIHR ny etterforsker tildeling JB, og en Alberta barns helse Research Institute fellesskap (js).

<ol>
	<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+for+cellular+variation.">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation.</a> Nature. 510, 363-369 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161, 1202-1214 (2015).</li><li>Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+single-cell+RNA-seq+analysis+landscape+with+the+scRNA-tools+database.">Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database.</a> bioRxiv:206573. , (2018).</li><li>Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+defines+heterogeneity+and+transcriptional+dynamics+in+the+adult+neural+stem+cell+lineage.">Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage.</a> Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).</li><li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+Reveals+a+Population+of+Dormant+Neural+Stem+Cells+that+Become+Activated+upon+Brain+Injury.">Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Schwann+Cells+from+Adult+Human+Skin+and+Nerve.">Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Agilent Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135">https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135</a> (2018)</li><li>Kolodziejczyk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+RNA-Sequencing+of+Pluripotent+States+Unlocks+Modular+Transcriptional+Variation.">Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation.</a> Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex.">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).</li><li>. Sequencing Requirements for Single Cell 3' Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3</a> (2018)</li><li>. Introduction to R Available from: <a target="_blank" href="https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r">https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Creating a Reference Package with cellranger mkref Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references</a> (2018)</li><li>. System Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements</a> (2018)</li><li>. Software Downloads Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</a> (2018)</li><li>. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization</a> (2018)</li><li>. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial</a> (2018)</li><li>. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data Available from: <a target="_blank" href="https://www.scrna-tools.org/">https://www.scrna-tools.org/</a> (2018)</li><li>. Downloading conda Available from: <a target="_blank" href="https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html">https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html</a> (2018)</li><li>. r / packages / r 3.5.1 Available from: <a target="_blank" href="https://anaconda.org/r/r">https://anaconda.org/r/r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. Seurat - Guided Clustering Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html">https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>Github. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).</li><li>. GenBank Submission Portal Wizards Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/</a> (2018)</li><li>. Submitting data Available from: <a target="_blank" href="https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/">https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/</a> (2018)</li><li>Shah, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+and+Fate+Mapping+of+Ependymal+Cells+Reveals+an+Absence+of+Neural+Stem+Cell+Function.">Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function.</a> Cell. 173, 1045-1057 (2018).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11, 1 (2013).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144, 3625-3632 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96, 313-329 (2017).</li><li>Zeigenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+states+versus+single-cell+atlases+-+two+classes+of+heterogeneity+that+differ+in+meaning+and+method.">Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method.</a> Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).</li><li>Herman, J. S., Sagar, D., Gr&#252;n, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FateID+infers+cell+fate+bias+in+multipotent+progenitors+from+single-cell+RNA-seq+data.">FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data.</a> Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).</li></ol>

Ingen avsløringer

Denne protokollen demonstrerer hvordan riktig utarbeidelse av enkeltceller kan avdekke den transcriptional heterogeniteten av enkeltceller og diskriminere funksjonelle stater eller unike mobilnettet identiteter innenfor en vev. Protokollen krever ikke fluorescerende reporter proteiner eller transgene verktøy og kan brukes på isolasjon av enkeltceller fra ulike vev inkludert de fra mennesker; holde i tankene hvert vev er unik, og denne protokollen krever en viss justering/ombygging.
Allsidig og svært dynamisk transcriptional programmene i celler har understreket verdien av én celle genomics. Bortsett fra isolere høykvalitets RNA, et kritisk eksempel forberedelse skritt nødvendig for høykvalitets datasett er å sikre at celler helt frigjøres fra vev, og at cellene er sunn og intakt. Dette er relativt rett frem for å samle celler som er lett utgitt, som sirkulerende celler eller i vev celler beholdes der løst, som lymfoid vev. Men dette kan være utfordrende for andre voksen vev, på grunn av høyt utviklet mobilnettet arkitektur som spenner over store avstander, rundt ekstracellulær matrix og ofte stive cellen cytoskjelett proteiner involvert i vedlikehold cellestruktur. Selv med riktig dissosiasjon teknikker for den fulle versjonen av celler er det mulig at strenge og ofte lang behandling kreves ville endre mRNA kvalitet og celle integritet. I tillegg påvirke til høye temperaturer brukes for enzym-assistert dissosiasjon også transcriptional signaturer29,30. Hensikten med protokollen er å presentere kvalitetskontroll sjekker, bruker vev som myelinated voksen nerve og ekstracellulær matrix-rik voksen huden, for å demonstrere hvordan optimalisering kan hjelpe for å overvinne disse hindringene.
En viktig faktor når du utformer en scRNA-Seq eksperiment er valget av sekvensering dybde. Sekvensering kan være svært multiplekset og lese dybde kan variere fra å være svært lav bruker Drop-Seq2 til opp til 5 millioner leser/mobiltelefon14 bruke en full lengde RNA-Seq som Smart-Seq. De fleste scRNA-Seq eksperimenter kan oppdage moderat til høy uttrykk utskrifter med sekvensering så lavt som 10 000 leser/mobiltelefon, hvilke er vanligvis nok for celle type klassifisering41,42. Grunne sekvensering dybden er av verdi å lagre sekvensering kostnader når prøver å finne sjeldne celle populasjoner over komplekse vev hvor tusenvis av celler kanskje behøves å trygt tilskrive sjeldne populasjoner. Men grunne dybden sekvensering er ikke tilstrekkelig når detaljert informasjon om genuttrykk og prosesser knyttet til subtile transcriptional signaturer er nødvendig. Det er foreløpig anslått at det store flertallet av gener i en celle er oppdaget med 500.000 leser/mobiltelefon, men dette kan variere avhengig av protokollen og vev skriver43,44. Mens full transkripsjon omgår behovet for montering og kan derfor oppdage roman eller sjeldne skjøte varianter, begrenser sekvensering kostnader ofte skalering slike tilnærminger for å undersøke tusenvis av celler som består av en kompleks vev system. Derimot merket 3 encellede biblioteker som de som er beskrevet i denne protokollen vanligvis har lavere kompleksitet og krever grunnere sekvensering. Det er viktig å merke seg at biblioteker generert ved hjelp av beskrevet protokollen kan være sekvensielt på en av fem støttes sequencere: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 rask kjøre og høy produksjon, 4) NextSeq 500/550 og 5) MiSeq.
En alternativ tilnærming til enkeltcelle RNA-Seq, som reduserer behovet for sarte vevet og håndtering ennå vedlikeholder noen av fordelene med enkeltcelle RNA-Seq, er analysen av RNA fra enkelt kjerner45. Denne tilnærmingen kan raskere behandling reduserer RNA fornedrelse, og flere ekstrem måler å sikre tilstrekkelig utgaven av kjerner, og dermed sannsynligvis gir en mer trygg fangst av transcriptional profiler som representerer alle celler innenfor en gitt vev. Dette, selvfølgelig, bare gi en del av transcriptional aktivitet stede i en gitt celle, dermed avhengig av hva eksperimentelle mål er rundt denne tilnærmingen kan eller ikke kan være riktig.
Foruten komplett karakterisering av mobilnettet identiteter innenfor en gitt vev er en av de mest verdifulle analysene for scRNA-Seq datasett vurdering av mellomliggende transcriptional tilstander over 'definerte' celle populasjoner. Disse mellomliggende tilstander kan gi innsikt i avstamning relasjonene mellom celler i identifiserte befolkninger, som ikke var mulig med tradisjonelle bulk RNA-Seq tilnærminger. Flere scRNA-Seq bioinformatic verktøy er nå utviklet for å klargjøre dette. Slike verktøy kan vurdere prosessene involvert i, for eksempel kreftceller overgang til en kreftfremkallende/metastatisk tilstand, stamceller modning i ulike terminal skjebne eller immunceller skytteltrafikk mellom aktive og quiescent. Subtile transcriptome forskjeller i celler kan også være indikativ av avstamning biases, nylig utviklede bioinformatic verktøy som FateID, kan antyde47. Siden forskjellene mellom overgang celler kan være vanskelig å fastslå gitt transcriptional forskjellene kan være subtile, dypere sekvensering kan være nødvendig46. Heldigvis kan dekning av en lav sekvensert bibliotek økes hvis interessert i utprøvende datasettet ytterligere ved å kjøre biblioteket på nytt med en annen flyt celle.
Samlet gir denne protokollen en lett-å-adapt arbeidsflyt som gjør det mulig å transcriptionally profil hundrevis til tusenvis av enkelt-celler i et eksperiment. Den endelige kvaliteten på scRNA-Seq dataset er avhengig av optimalisert cellen aisolering, flowcytometri, cDNA biblioteket generasjon og tolkning av rå gen-strekkode matriser. Dette gir denne protokollen en omfattende oversikt over alle viktige trinn som kan enkelt endres for å aktivere studier av ulike vev.

Med utviklingen av høy gjennomstrømning enkeltcelle teknologi1,2 og fremskritt i brukervennlig Bioinformatikk verktøy over de siste tiår3, et nytt felt av høyoppløselige gene expression analyse har dukket opp- encellede RNA sekvensering (scRNA-Seq). Studiet av enkeltcelle genuttrykk ble først utviklet identifisere heterogenitet innenfor definerte celle populasjoner, som i stilk celler og kreftceller, eller identifisere sjeldne bestander av celler4,5, som var uoppnåelig med tradisjonelle bulk RNA sekvensering teknikker. Bioinformatic verktøy har aktivert identifikasjon av romanen Sub-populasjoner (Seurat)2, visualisering av celler langs en psuedotime plass (Monocle)6, definisjonen av aktive signalnettverk nettverk i eller mellom populasjoner ( NATURSKJØNNE)7, prediksjon av enkelt-celler i en kunstig 3D-rom (Seurat og mer)8. Med disse nye og spennende analyser tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet, er scRNA-Seq raskt bli den nye tilnærmingen til gene expression analyse.
Til tross for det store potensialet i scRNA-Seq, kan teknisk skillsets kreves for å produsere ren dataset og nøyaktig tolke resultatene være utfordrende for nykommere. En grunnleggende, men omfattende protokoll, fra isolering av enkeltceller fra hele primære vev visualisering og presentasjon av data for publisering her presenteres (figur 1). Først kan isolering av sunn enkeltceller anses utfordrende, ulike vev variere i deres grad av følsomhet for enzymatisk fordøyelsen og påfølgende mekanisk dissosiasjon. Denne protokollen gir følgende isolasjon og identifiserer viktige kvalitetskontroll sjekkpunkter gjennom hele prosessen. Andre, forstå kompatibilitet og krav mellom enkeltcelle teknologi og neste generasjons sekvensering kan være forvirrende. Denne protokollen gir retningslinjer for å implementere en brukervennlig, slippverktøy-baserte encellede barcoding plattform og utføre sekvensering. Endelig er programmering en viktig forutsetning for å analysere encellede transcriptomic datasett. Denne protokollen gir ressurser i å komme i gang med programmeringsspråket R og gir veiledning om implementering av to populære scRNA-Seq-R pakker. Sammen, veileder denne protokollen nykommere i utføre scRNA-Seq analyse for å få klar, interpretable resultater. Denne protokollen kan justeres til de fleste vev i musen, og viktigst kan bli endret for bruk med andre organismer, inkludert menneskelig vev. Justeringer avhengig av vev og brukeren vil være nødvendig.
Det er flere hensyn å huske på når du følger denne protokollen; inkludert 1) etter alle kvalitetskontroll retningslinjer i trinn 1 og 2 av denne protokollen anbefales å sikre en levedyktig enkeltcelle suspensjon av alle celler i utvalget rundt samtidig sikre nøyaktige totalt antall celletall (sammenfattet i figur 2 ). Når dette er oppnådd, og hvis alle optimalisert forholdene er fulgt, kvalitetskontroll trinnene kan drop (å spare tid - bevarer RNA kvalitet og redusere celle tap). Bekrefter vellykket isolering av høy levedyktighet enkeltceller fra vevet rundt er svært anbefaler før noen nedstrøms behandling. 2) siden noen celletyper er mer følsomme enn andre stress, kan overdreven dissosiasjon teknikker utilsiktet bias befolkningen, derfor confounding nedstrøms. Mild dissosiasjon uten unødvendige mobilnettet klipping og fordøyelsen er avgjørende for å oppnå høy mobilnettet avkastning og en nøyaktig gjengivelse av vev komposisjon. Skjær krefter oppstå under føden, FACS og rørets trinnene. 3) som med RNA arbeid, er det best å innføre som lite ekstra RNase i prøven som mulig under forberedelse. Dette vil hjelpe opprettholde høy kvalitet RNA. Bruke ribonuclease hemmer løsninger med skylling ren verktøy og utstyr som ikke er RNase-fri men unngå DEPC-behandlet produkter. 4) utføre forberedelser så raskt som mulig. Dette vil hjelpe opprettholde høy kvalitet RNA og redusere celledød. Avhengig av vev disseksjon lengde og dyr tall, Vurder å starte flere disseksjoner/forberedelser samtidig. 5) forberede celler på is når mulig å opprettholde høy kvalitet RNA, redusere celledød og langsom celle signalnettverk og transcriptional aktivitet. Riktignok iskald behandling er ideell for de fleste celletyper, gir noen celletyper (f.eks, nøytrofile) bedre når behandlet ved romtemperatur. 6) unngå kalsium, magnesium, EDTA og DEPC-behandlet produkter under cellen forberedelse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

Analyse av enkeltcelle genuttrykk over tusen individuelle celler innenfor en vev eller microenvironment er et verdifullt verktøy for å identifisere celle komposisjon, diskriminering av funksjonelle stater og molekylære baner underliggende observert vev funksjoner og dyrenes atferd. Imidlertid kan isolering av intakt, sunn enkeltceller fra voksen pattedyr vev for påfølgende nedstrøms enkeltcelle molekylær analyse være utfordrende. Denne protokollen beskriver generelle prosesser og kvalitetskontroll sjekker nødvendig for å få høy kvalitet voksen enkeltcelle preparater fra nervesystemet eller hud som aktivert påfølgende upartiske enkeltcelle RNA sekvensering og analyse. Retningslinjer for nedstrøms bioinformatic analyse tilbys også.

Repertoaret av åpen kildekode-pakker som er utformet til å analysere scRNA-Seq datasett har økt dramatisk40 med fleste av disse pakkene R-baserte språk3. Her, representant resultater med to av disse pakkene presenteres: vurdere unsupervised gruppering av enkelt cellene basert på genuttrykk og bestilling enkeltceller langs en bane for å løse celle heterogenitet og dekonstruere biologisk prosesser.
Figur 4 illustrerer bruken av Seurat for pre-prosessering kvalitetskontroller og nedstrøms bioinformatikk analyse. Først er filtrering og fjerning av avvikende celler fra analyse avgjørende for kvalitet kontroll. Dette ble gjort ved hjelp av fiolin (figur 4a) og scatter tomter (figur 4b) å visualisere prosentandelen av mitokondrie gener, antall gener (nGene) og antall UMI (nUMI) til å identifisere celle doublets og outliers. En celle med en klar avvikende antall gener, UMI eller prosentandel av mitokondrie gener ble fjernet Seurat's FilterCells funksjonen. Siden Seurat bruker viktigste komponenten (PC) analyse score til klynger cellene, bestemme statistisk signifikant PCs å inkludere er et kritisk punkt. Albue tomter (Figur 4 c) ble brukt for PC utvalg, i hvilken PC utover platået "standardavvik av PC" aksen ble utelatt. Oppløsningen for klynging ble også manipulert demonstrere at antallet klynger kan endres, fra 0,4 (lav oppløsning fører til færre celle klynger, Figur 4 d) til 4 (høy oppløsning fører til høyere celle klynger, figur 4e ). På lav oppløsning er det sannsynlig at hver sektorgruppe representerer en definert celle type, mens med høy oppløsning kan dette også representere subtyper eller overgangsreglene stater av cellen innbyggere. I dette tilfellet, ble innstillinger for lav oppløsning klyngen brukt for ytterligere analysere uttrykk heatmaps (funksjonen Seurat's DoHeatmap) for å identifisere de mest uttrykt genene i en gitt klynge (figur 4f). I dette tilfellet ble mest uttrykt genene identifisert ved å vurdere differensial uttrykk i en gitt klynge mot alle andre klynger kombinert, viser at hver sektorgruppe var unikt representert av definerte gener. I tillegg kan individuelle kandidat gener visualiseres på tSNE tomter funksjonen Seurat's FeaturePlot (Figur 4 g). Dette tillot tyde om det var klynger som representerte makrofager. Bruker FeaturePlot, fant vi at begge klynge 2 og 4 var uttrykke Cd68 - en pan-macrophage markør.
Monocle pakken ble brukt for bekrefter celle klynger identifisert i Seurat og bygge celle baner eller pseudotemporal bestilling, til recapitulate biologiske prosesser (figur 5). Pseudotemporal bestilling kan brukes for prøver der encellede uttrykket profiler forventes å følge en biologisk tid kurs. Cellene kan bestilles langs en pseudotemporal kontinuum løse mellomliggende tilstander, bifurkasjonen rundt to alternative celle skjebne, og identifisere genet signaturer underliggende oppkjøpet av hver skjebne. For det første, lik Seurats filtrering, dårlig kvalitet celler ble fjernet slik at fordelingen av mRNA over alle cellene var Logg normal og falt mellom øvre og nedre grense som er identifisert i figur 5a. Deretter bruker Monocle's newCellTypeHierarchy funksjonen, enkeltceller ble klassifisert og telles bruker kjente avstamning markør gener (figur 5b, 5 c). For eksempel ble celler uttrykke PDGF reseptor alfa eller Fibroblast bestemt Protein 1 tilordnet til celle Type #1 å lage vilkår for å definere fibroblaster. Deretter ble denne befolkningen (celle Type #1) vurdert dechiffrere fibroblast baner. Dette gjør ble Monocles differensial GeneTest funksjonen benyttet, som sammenlignet cellene representerer ekstreme statene i befolkningen og fant differensial gener for bestilling av gjenværende celler i befolkningen (figur 5 d). Ved å bruke mangfoldige undervisningsformer (en type ikke-lineære dimensionality reduksjon) i alle celler, ble en koordinat langs en pseudotemporal sti tilordnet. Denne banen ble deretter visualisert av cellen staten (figur 5e) og pseudotime (figur 5f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> Figur 1: flytdiagram. Skritt fra hele dyr forberedelse til å analysere enkelt celle RNA-Seq datasett å sende siste datasett til et offentlig tilgjengelig register. Gel perler i emulsjon (edelstener) se perler med barcoded oligonucleotides som kapsler inn tusenvis av enkeltceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> Figur 2: opprette levedyktig enkeltcelle suspensjon fra nervevev. (a) tegneserie oversikt over kvalitetskontroller. (b) celler og rusk cellene fremdeles innlemmet i rusk (røde piler). (c) celler fra rusk (røde piler). (d) cellen aisolering av FACS. P0: rusk brøkdel; P1: cellen som brøkdel; P3: utelukkelse av duplets; P4: levedyktighet fargestoff (Sytox Orange) negative brøkdel. (e) ingen levedyktighet fargestoff kontroll. (f) bilde av P0 brøkdel representerer isolert rusk. (g) bilde av P4 brøkdel representerer isolert levedyktige cellers (røde piler). (b) (c) (f) og (g) hadde kjernefysiske fargestoff lagt til 20 minutter før bildebehandling. Skala barer: 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> Figur 3: grunne sekvenser predikerer antall gjenopprettede celler i 10 X behandlet prøver. (a) et eksempel (Sample 1.6) på MiSeq-generert csv celle strekkoder og dens tilsvarende UMI teller som trygt tilordnet leser. (b) strekkode rang tomten for eksempel 1.6 viser en betydelig nedgang i UMI teller som en funksjon av cellen strekkoder. Stiplet og solid linjene representerer cut-off mellom celler og bakgrunn som bestemmes av visuell inspeksjon. (c) cellen strekkoder observert bruker celle Ranger rørledning innlegg-HiSeq avslører grunne sekvensering tilnærmes nøyaktig antall celler for eksempel 1.6. (d) et eksempel på en flyt-celle oppsett basert på grunt sekvensering avledet celle estimater. For eksempel 1.6, siden grunne sekvensering spådd 3480 celler, 1,17 baner ble tildelt slik > 100.000 leser per celle sekvensering dekning i HiSeq. Merk: Alle baner må legge til 100%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> Figur 4: kvalitetskontroll og bioinformatikk av encellede RNA-Seq datasett med Seurat R pakken. (a) tomter kvalitetskontroll beregninger som antall gener, antall unike molekylær identifikatorer (UMIs) og andelen utskrifter tilordning til mitokondrie genomet. (b) prøve genet tomter oppdage celler med avvikende mitokondrie utskrifter og UMIs. (c) prøve albue plott brukes for ad hoc fastsettelse av statistisk signifikant PCer. Stiplet og dot stiplede linjene representerer cut-off der en klar "albue" blir tydelig i diagrammet. PC dimensjoner før denne albue inkluderes i nedstrøms. (d, e) Grafbasert celle klynger visualisert på to forskjellige oppløsninger i en lav-dimensjonale rommet ved hjelp av en tSNE tomt. (f) øverste merket gener (gul) for hver klynge visualisert på et uttrykk heatmap Seurat's DoHeatmap funksjonen. (g) visualisere markør uttrykk for, for eksempel Cd68 genet som representerer makrofager (lilla) Seurat's FeaturePlot funksjonen. Dette tyder på at klyngen 2 og 4 (i panelet d) av dataset representerer makrofager. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> Figur 5: kategorisering og bestilling langs peudotemporal bane med monokkel toolkit. (a) inspisere fordelingen av mRNA (avledet fra UMI teller) i alle celler i et utvalg. Bare celler med mRNA mellom 0 - ~ 20.000 ble brukt til nedstrøms. (b, c) Tilordne og teller celletyper basert på kjente lineage celle markører. For eksempel celler uttrykke PDGF reseptor alfa eller Fibroblast bestemt Protein 1 ble tilordnet celle Type #1 representerer pan-fibroblaster Monocle's newCellTypeHierarchy funksjonen. Antall forskjellige celletyper kan visualiseres som et sektordiagram (b) og som en tabell (c). (d) med cellen Type #1 (fibroblaster) eksempel genene brukes for bestilling av celler kan visualiseres ved hjelp av et spredningsdiagram som demonstrerer genet spredning vs mener uttrykk. Rød kurven viser cut-off for gener brukes for bestilling beregnes bety-variansen modellen Monocle's estimateDispersions funksjonen. Gener som oppfyller denne cutoff ble brukt for nedstrøms pseudotime bestilling. (e, f) Visualisering av cellen baner i en redusert to-dimensjonale rommet farget ved celle "State" (e) og Monocle tilordnet "Pseudotime" (f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Denne protokollen beskriver generelle prosesser og kvalitetskontroll sjekker nødvendig for sunn voksen pattedyr enkeltceller forberedte slippverktøy-basert, høy gjennomstrømming enkeltcelle RNA-Seq forberedelser. Sekvensering parametere, tilbys Les justering og nedstrøms encellede bioinformatic analyse også.

Slippverktøy Barcoding-baserte enkelt celle Transcriptomics av voksen pattedyr vev

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen mikrobiologi, for eksempel å forstå genuttrykksendringer på tvers av tusenvis av enkeltceller etter en skade eller en sykdom. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater oss å dissekere transkripsjoner av individuelle celler i et komplekst vev, og å bedre sette pris på den funksjonelle dynamikken i en gitt befolkning. Fordelen med vår protokoll er at den gir omfattende metoder, fra isolering av enkeltceller i primærvev, til analyse og visualisering av dette datasettet.Selv om denne metoden starter fra encellede suspensjoner fra huden og nerven, kan sekvenseringsmetodene vi beskriver, brukes til å studere noe pattedyrvev. Å demonstrere denne prosedyren vil være Elodie Labit, og Wisoo Shin, to lærlinger fra laboratoriet mitt. For å begynne, dissekere isjiasnerven til en euthanized mus ved først å kutte huden bort fra bakområdet på baksiden av musen.Bruk et sterilt skalpellblad for å gjøre et snitt langs lårets lengde. Bruk deretter fine tang og saks for å eksponere og fjerne isjiasnerven. For å dissekere rygghuden, bruk fine tang og saks for å gjøre snitt fra skulder til skulder, over rumpen og ned på baksiden.Vask vevet to ganger med iskald HBSS. Under et dissekeringsmikroskop fjerner du uønsket bindevev, fettavleiringer eller rusk. Bare for huden, kutt huden i tynne skiver, ved hjelp av et sterilt skalpellblad.For å oppnå hud dermis, flyte hudskivene i dispase, i HBSS i en 10 centimeter tallerken, i 30 til 40 minutter ved 37 grader Celsius. Bruk fine tang til å skrelle og skille epidermis fra dermis, og kast deretter epidermis. Deretter, for hud og nerve, bruk et par sterile skalpellblader for å hakke hver prøve i en til to millimeter stykker.Legg vevsbitene i ny tint, to gram per milliliter kald kollagen-fire enzym i et 15 milliliter konisk rør. Inkuber hver prøve i enzymet i et 37-graders Celsius-bad i 30 minutter med mild risting hvert 10. På 30 minutter, bruk en P1000 pipetter til å triturate vevet 20 til 30 ganger, og gå tilbake til vannbadet.Gjenta triturasjon hvert 30. Bare for hud, i den siste timen av inkubasjon, legg til ett milligram per milliliter DNAse til hudprøven. Siden noen celletyper er mer følsomme enn andre til mekanisk stress, overdreven dissosiasjon teknikker kan skjevhet befolkningen.Generell dissosiasjon er avgjørende for å oppnå høye celleavlinger, og en nøyaktig representasjon av vevssammensetning. Deretter bruker du et 40 mikrometerfilter på toppen av det 50 milliliter koniske røret til å filtrere hver vevsprøve to ganger. Skyll filteret med én prosent BSA/HBSS.Etter å ha sentrifugert prøvene som beskrevet i manuskriptet, re-suspendere cellepellet i HBSS, som inneholder en prosent BSA, ved hjelp av en bred-bore tips, og plassere på is. Tillegg av levedyktighet fargestoff vil hjelpe deg med å optimalisere forberedelsene. Du bør sikte på minst 80 prosent levedyktige celler.Når optimalisert, dette og andre kvalitetskontroll trinn kan utelates for å fremskynde dissosiasjonsprosessen, som vil bedre bevare RNA kvalitet og redusere celletap. For å isolere levedyktige og friske celler ved hjelp av FACS, må du først forberede 15 milliliter smale bunnrør med åtte milliliter iskalde en prosent BSA/HBSS for prøvesamlinger. For å sikre at grensesnittet mellom overflaten av væsken og innsiden av røret er fuktig, og for å forhindre statisk og overflatespenning, inverter rørene før kolleksjoner.Umiddelbart etter FACS cellesortering, når cellene samles inn i et 15 milliliter rør, bruk en milliliter på en prosent BSA / HBSS til å vaske og skyve alle cellene ned fra sideflaten av røret. Deretter sentrifuger hver prøve på 260 g i åtte minutter. Etter å ha kastet det overnaturante, må du suspendere cellepelleten på nytt i én prosent BSA/HBSS, og tilsett 33,8 mikroliter til et rør, og hold røret på isen.Dette trinnet er utformet for å gjøres ved hjelp av reagenser hentet fra et standardisert sett. Alle demonstrerte trinn bør utføres i følge produsentens instruksjoner. For å forberede seg på GEM generasjon, plasser en chip i chip holderen, forberede en celle master blanding på is, i henhold til produsentens protokoll.Tilsett 56,2 mikroliter av masterblandingen til et rør som inneholder 33,8 mikroliter selvfjæring. For å forberede brikken, først ved 50 prosent glyserol til brønnene som ikke vil bli brukt. Tilsett deretter 90 mikroliter av cellemesterblandingen til godt ett, 40 mikroliter gelperler til godt to, og 270 mikroliter partisjonering av olje til godt tre.Dekk brikken med en pakning. Hvis du vil laste inn brikken og kjøre i en encellekontroller, må du først løse ut skuffen. Plasser brikken i skuffen.Trekk inn skuffen, og trykk på spill av. Etter fullført kjøring, samle 100 mikroliter av prøven, og plasser i et PCR-rør. Plasser PCR-rør i en forhåndsinnstilt PCR-maskin, og kjør i henhold til settet.Etter kjøringen vil GEMs inkludere full lengde, strekkodet cDNA, fra polyadenylert mRNA. Plasser rørene på minus 20 grader Celsius over natten. Fortsett med bibliotekkonstruksjon, sekvensering, justering og analyse.Når prøvene er sekvensert og justert som beskrevet i manuskriptet, setter du inn dataene på et offentlig repositorium, for eksempel NCBI's GEO. For å gjøre dette, registrer deg for submitter-kontoen. Først fullfører du GEO-innsendingen ved å laste ned metadataarket.Sørg for å inkludere bare ett metadataark per prosjektinnsending. Plasser regnearket i katalogen. For det andre legger du til rådatafilen som genereres fra cellevoktertellingsskriptet for alle biblioteker i katalogen.Den tredje mappen behandles datafiler. Plasser behandlede datafiler generert fra cellevoktertellingsskript for alle biblioteker i katalogen. Bruk GEO-senderens FTP-serverlegitimasjon til å overføre katalogen som inneholder alle tre komponentene.Etter å ha kjørt Cell Ranger, kan analyseklare genstrekkodematriser behandles videre ved hjelp av avansert bioinformatikk. Først ble pre-prosessering av mengdekontroller gjort ved hjelp av Seurat R-pakken, som genererte fiolin- og scatterplott for å visualisere antall gener, antall unike molekylære identifikatorer og prosentandel av mitokondriegener for å identifisere celledobbelter og outliers. For valg av hovedkomponenter, eller PCer, ble albueplott brukt, der PCer utenfor platået av standardavviket for PC-aksen, ble utelukket.Oppløsningen av klynger ble også manipulert. Lav oppløsning førte til færre celleklynger, og hver klynge representerer sannsynligvis en definert celletype. Høy oppløsning førte til høyere cellesannsynlighet, som representerer undertyper, eller overgangsstater, av en cellepopulasjon.Klyngeinnstillinger med lav oppløsning ble brukt til videre analyse av uttrykksvarmekart for å identifisere de mest uttrykte genene i en gitt klynge. Individuelle kandidatgener ble visualisert på tSNE-plott, ved hjelp av Seurats funksjonsplottfunksjon, som tillot dechiffrering, om det var klynger som representerte for eksempel makrofager. Både klynge to og fire uttrykte CD68, en pan-makrofag markør.Andre pakker gir også verktøy for kvalitetskontroll, for eksempel Monocle, en R-pakke som brukes til å bygge cellebaner, fjerner celler av dårlig kvalitet, og sikrer at fordelingen av mRNA på tvers av alle celler er logg normal, og falt mellom øvre og nedre grenser. Enkeltceller ble deretter klassifisert og talt, ved hjelp av kjente avstamning markør gener, og celler som uttrykker markører av interesse ble tildelt celletype nummer én. Det ble fastslått at celletype nummer én var fibroblaster.Denne befolkningen ble vurdert til å bygge fibroblaster utviklingsbane. Etter denne prosedyren, andre metoder som kvantitativ PCR, in situ hybridisering, en immunistisk kjemi bør utføres for å validere nøyaktigheten av genuttrykk resultater. Encellede mRNA sekvensering har nå banet vei for forskere i mange forskjellige felt for å utforske celle-til-celle heterogenitet, og identifisere funksjonell dynamikk i ulike vev under homeostase, og hvordan disse kan endres etter skade eller utvikling av sykdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Enkelt Cell transcriptional Profilering av Adult Mouse cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse av Cell Cycle Posisjon i pattedyrceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Måling av Heme Synthesis Levels i pattedyrceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Effektiv pattedyrcelle Expression og Single-step Rensing av Ekstracellulær Glykoproteiner for Krystallisering

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Anaerob vekst og vedlikehold av pattedyr cellelinjer

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Beriker utbyttet av menneskelige melanocytter fra voksen hudvev

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Single Myofiber Culture Assay for vurdering av voksen muskel stamcelle funksjonalitet Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...