Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Reconhecemos que o pessoal de apoio à instalação de serviços de UCDNA, bem como o pessoal de instalação Cuidado Animal na Universidade de Calgary. Agradecemos a Matt Workentine para seu apoio de bioinformática e Jens Durruthy para seu suporte técnico. Este trabalho foi financiado por um subsídio CIHR (R.M. e J.B.), um CIHR New Investigator Award, J.B., e saúde Research Institute Fellowship (J.S. uma infantil de Alberta).

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Sem divulgações

Este protocolo demonstra como a preparação adequada de células únicas pode descobrir a heterogeneidade transcriptional de milhares de células únicas e discriminar Estados funcionais ou identidades únicas de celulares dentro de um tecido. O protocolo não exige ferramentas transgénicas ou proteínas fluorescentes repórter e pode ser aplicado para o isolamento de células únicas de diversos tecidos de interesse, incluindo os de seres humanos; tendo em mente cada tecido é único e este protocolo exigirá algum grau de adaptação/modificação.
Os programas transcriptional diversificados e altamente dinâmicos dentro de células têm enfatizado o valor da célula única genómica. Além de isolar o RNA de alta qualidade, uma etapa de preparação de amostra crítico necessária para conjuntos de dados de alta qualidade é garantir que as células são completamente liberadas do tecido e que as células são saudáveis e intacta. Isto é relativamente direta para coleta de células que são facilmente lançou, como circulantes de células ou tecidos onde as células são frouxamente retidas, como em tecidos linfoides. Mas isso pode ser um desafio para outros tecidos adultos, devido à arquitetura celular altamente desenvolvidos, abrangendo grandes distâncias, em torno da matriz extracelular e as proteínas do citoesqueleto rígida frequentemente envolvidos na manutenção da estrutura celular. Mesmo com técnicas de dissociação apropriado para a versão completa de células, há um potencial que o rigoroso e muitas vezes demorado processamento necessário alteraria a integridade de qualidade e celular mRNA. Além disso, as altas temperaturas, utilizadas para dissociação enzima assistida também afetam assinaturas transcriptional29,30. A intenção do protocolo é apresentar controle de qualidade verifica, usando tecidos tais como o nervo adulto mielinizado e a pele de adulta ricos em matriz extracelular, para demonstrar como a otimização pode ajudar a superar esses obstáculos.
Uma consideração importante ao projetar qualquer experimento scRNA-Seq é a escolha de profundidade de sequenciamento. Sequenciamento pode ser altamente multiplexado e ler profundidade pode variar sendo muito baixo usando Drop-Seq2 para até 5 milhões de leituras/célula14 usando um método de RNA-Seq completo como Smart-Seq A maioria dos experimentos de scRNA-Seq podem detectar transcrições de moderada a alta expressão com sequenciamento tão baixo quanto 10.000 leituras/célula, que é geralmente suficiente para4241,classificação do tipo celular. Sequenciamento superficial profundidade é de valor para economizar em custos de sequenciamento ao tentar detectar populações de células raras em tecidos complexos, onde milhares de células podem ser necessários para confiantemente atribuem populações raras. Mas o sequenciamento de profundidade não é adequado quando são necessárias informações detalhadas na expressão dos genes e processos associados com assinaturas transcriptional sutis. Atualmente, estima-se que a grande maioria dos genes em uma célula é detectada com 500.000 leituras/célula, mas isso pode variar dependendo do protocolo e tecido tipo43,44. Enquanto transcrição completos no sequenciamento contorna a necessidade de montagem e pode, portanto, detectar romance ou variantes raras da tala, custos de sequenciamento frequentemente limitam a escala tais abordagens para examinar milhares de células que inclui um sistema complexo de tecido. Em contraste, 3' com a tag bibliotecas unicelulares tais como as descritas neste protocolo normalmente têm baixa complexidade e exigem mais raso sequenciamento. É importante notar que bibliotecas geradas usando o protocolo descrito podem ser sequenciadas em uma das cinco sequenciadores suportados: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 2500 3) HiSeq execução rápida e alta saída, 4) NextSeq 500/550 e MiSeq 5).
Uma abordagem alternativa a única célula RNA-Seq, que reduz a necessidade de tecidos delicados e célula manipulação ainda mantém alguns dos benefícios da única célula RNA-Seq, é a análise do RNA do núcleo único45. Esta abordagem permite o processamento mais rápido, reduzindo a degradação do RNA e tomar medidas mais drásticas para garantir a adequada liberação de núcleos e assim provavelmente permite uma captura mais confiante dos perfis transcriptional que representa todas as células dentro de um determinado tecido. Isto, claro, só forneceria uma porção da atividade transcricional presente dentro de uma determinada célula, assim, dependendo de quais objetivos experimentais são de interesse, esta abordagem pode ou não ser adequado.
Além a caracterização completa de identidades celulares dentro de um determinado tecido, uma das mais valiosas análises para conjuntos de dados scRNA-Seq é a avaliação de Estados intermediários transcriptional em populações de células 'definido'. Estes Estados intermediários podem dar insights sobre as relações de linhagem entre células dentro das populações identificadas, que não foi possível com a tradicional massa que se aproxima do RNA-Seq. Várias ferramentas de bioinformatic scRNA-Seq agora foram desenvolvidas para elucidar isso. Tais ferramentas podem avaliar os processos envolvidos em, por exemplo, as células cancerosas em transição para um estado oncogênica/metastático, células-tronco amadurecimento em diversos destinos terminais ou células imunitárias vaivém entre os Estados ativos e inativo. Transcriptoma sutis diferenças nas células também podem ser indicativas de enviesamentos de linhagem que, ferramentas de bioinformatic recentemente desenvolvidos como FateID, pode inferir47. Uma vez que as distinções entre as células de transição podem ser difícil verificar tendo em conta as diferenças transcriptional pode ser sutil, sequenciamento mais profundo pode ser necessário46. Felizmente, a cobertura de uma biblioteca superficialmente sequenciada pode ser aumentada se interessado na investigação do conjunto de dados mais re-executando a biblioteca na outra célula de fluxo.
Tomados em conjunto, este protocolo fornece um fácil-para-adaptar-se de fluxo de trabalho que permite aos usuários transcricionalmente perfil centenas ou milhares de single-células dentro de um experimento. A qualidade final de um conjunto de dados de scRNA-Seq baseia-se no isolamento de célula otimizado, citometria de fluxo, geração de biblioteca de cDNA e interpretação de matrizes gene cru-código de barras. Para este fim, este protocolo fornece uma visão abrangente de todas as etapas-chave que pode ser facilmente modificado para permitir estudos de tipos diversos de tecido.

Com o desenvolvimento da alta taxa de transferência única célula tecnologia1,2 e avanços em ferramentas de Bioinformática amigável ao longo da última década3, surgiu-se um novo campo de análise de expressão do gene de alta resolução – sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-Seq). O estudo da expressão gênica de célula única foi desenvolvido para identificar heterogeneidade dentro de populações de células definidos, tais como em células estaminais ou células cancerosas, ou para identificar raras populações de células4,5, que estavam usando inatingível técnicas de sequenciamento de RNA em massa tradicional. Ferramentas de Bioinformatic permitiram a identificação de sub-populações romance (Seurat)2, visualização da ordem de células ao longo de um psuedotime espacial (monóculo)6, definição das redes de sinalização ativas dentro ou entre populações ( CÊNICA)7, predição da Assembleia do único-células em um espaço 3D artificial (Seurat e muito mais)8. Com estas análises novas e excitantes disponíveis para a comunidade científica, scRNA-Seq é rápido, tornando-se a nova abordagem padrão para análise de expressão do gene.
Apesar do vasto potencial de scRNA-Seq, skillsets técnicos necessários para produzir um conjunto de dados limpo e com precisão, interpretar resultados pode ser um desafio para os recém-chegados. Aqui, um protocolo básico, mas abrangente, a partir do isolamento de células únicas de tecidos todo primários para visualização e apresentação de dados para publicação é apresentada (Figura 1). Em primeiro lugar, o isolamento de células saudáveis único pode ser considerado desafiador, como tecidos diferentes variam em seu grau de sensibilidade à digestão enzimática e subsequente dissociação mecânica. Este protocolo fornece orientação nessas etapas de isolamento e identifica os pontos de verificação de controle de qualidade importante durante todo o processo. Em segundo lugar, a compreensão da compatibilidade e requisitos entre tecnologia única célula e sequenciamento de próxima geração pode ser confuso. Este protocolo fornece diretrizes para implementar uma plataforma amigável, baseada em gotículas barcoding monocelulares e realizar o sequenciamento. Finalmente, programação de computadores é um requisito importante para a análise de conjuntos de dados transcriptomic de célula única. Este protocolo fornece recursos para começar com a linguagem de programação R e fornece orientação sobre como implementar dois pacotes de R populares scRNA Seq-específicos. Juntos, este protocolo pode orientar os recém-chegados na realização de análises scRNA-Seq para a obtenção de resultados claros, interpretáveis. Este protocolo pode ser ajustado para a maioria dos tecidos no mouse e importante poderia ser modificado para uso com outros organismos, incluindo o tecido humano. Ajustes dependendo do tecido e do usuário serão necessários.
Há várias considerações a ter em mente ao seguir este protocolo; incluindo, 1) seguir todas as diretrizes de controle de qualidade nas etapas 1 e 2 do presente protocolo é recomendado para garantir uma suspensão de célula única viável de todas as células dentro da amostra de interesse, assegurando a contagem de número de células de total exato (resumidas em Figura 2 ). Uma vez que este é alcançado, e se forem seguidas todas as condições otimizadas, as etapas de controle de qualidade podem ser descartadas (para economizar tempo - preservar a qualidade do RNA e redução de células perda). Confirmando o sucesso isolamento de células únicas de alta viabilidade do tecido de interesse é altamente recomendo antes de qualquer um jusante de processamento. 2) uma vez que alguns tipos de células são mais sensíveis do que outros ao estresse, técnicas de dissociação excessiva podem inadvertidamente viés da população, confundindo, portanto, a análise a jusante. Dissociação suave sem ruptura celular desnecessários e digestão é fundamental para alcançar altos rendimentos de celulares e uma representação exata da composição do tecido. Forças de cisalhamento ocorrem durante as etapas de trituração, FACS e ressuspensão. 3) como com qualquer trabalho de RNA, é melhor introduzir como RNase adicional pequeno da amostra quanto possível durante a preparação. Isto ajudará a manter a qualidade do RNA. Utilizar soluções de inibidor do ribonuclease com lavagem de ferramentas limpas e qualquer equipamento que não é livre de RNase mas Evite produtos DEPC tratada. 4) realize preparações tão rapidamente quanto possível. Isto ajudará a manter a qualidade do RNA e reduzir a morte celular. Dependendo do comprimento de dissecação de tecido e o número de animais, considere começar várias dissecações ou preparações ao mesmo tempo. 5) prepare células no gelo quando possível para manter a alta qualidade do RNA, reduzir a morte celular e lenta atividade transcricional e sinalização de células. Embora, processamento gelado é ideal para a maioria dos tipos de células, alguns tipos de células (por exemplo, os neutrófilos) melhor desempenho quando processado à temperatura ambiente. 6) Evite o cálcio, magnésio, EDTA e tratada com DEPC produtos durante a preparação da célula.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

A análise da expressão gênica de célula única através de milhares de células individuais dentro de um tecido ou microambiente é uma ferramenta valiosa para identificar composição celular, discriminação dos Estados funcionais e vias moleculares subjacentes observado tecido funções e comportamentos animais. No entanto, o isolamento de células única intactas e saudáveis de tecidos de mamíferos adultos para análise molecular subsequente a jusante única célula pode ser um desafio. Este protocolo descreve os processos gerais e controle de qualidade verifica necessário para obter preparações de alta qualidade adulto única célula do sistema nervoso ou pele que permitiu análise e sequenciamento de célula única imparcial subsequentes do RNA. Diretrizes para a análise de bioinformatic jusante também são fornecidas.

O repertório de pacotes de código aberto projetado para analisar conjuntos de dados scRNA-Seq aumentou dramaticamente a40 , com a maioria de uso esses pacotes de idiomas baseados em R3. Aqui, apresentam-se resultados representativos usando dois desses pacotes: avaliar agrupamento sem supervisão de único baseadas na expressão gênica de células e ordenação de células únicas ao longo de uma trajetória para resolver heterogeneidade de célula e desconstruir biológico processos.
A Figura 4 ilustra o uso de Seurat para pré-processamento de controlos de qualidade e análise de Bioinformática a jusante. Primeiro, filtragem e remoção de células desviantes de análise é essencial para o controlo de qualidade. Isto foi feito usar o violino (figura 4a) e dispersão parcelas (figura 4b) para visualizar a porcentagem de genes mitocondriais e número de genes (nGene) número de UMI (nUMI) para identificar parelhas de célula e exceções. Qualquer célula com um número de outlier clara de genes, UMI ou a porcentagem de genes mitocondriais foi removida usando a função FilterCells de Seurat. Desde que Seurat usa o componente principal (PC) resultados de análise de aglomerados de células, determinando estatisticamente significativas PCs para incluir é uma etapa crítica. Parcelas de cotovelo (Figura 4C) foram usadas para a seleção de PC, no quais PCs além do planalto do 'desvio padrão de PC' eixo foram excluídos. A resolução de cluster foi manipulada também demonstrando que o número de clusters pode ser alterado, variando de 0,4 (baixa resolução, levando a menos aglomerados de células, Figura 4D) a 4 (resolução alta, levando a maiores aglomerados de células, Figura 4e ). Em baixa resolução, é provável que cada cluster representa um tipo de célula definida, Considerando que, em alta resolução isso também pode representar subtipos ou Estados de transição de uma população celular. Nesta instância, configurações de baixa resolução cluster foram utilizadas para analisar mais expressão heatmaps (usando a função DoHeatmap de Seurat) para identificar os genes mais altamente expressos em um determinado cluster (Figura 4f). Neste caso, os mais altamente expressos genes foram identificados através da avaliação de expressão diferencial em um determinado cluster contra todos os outros grupos combinados, demonstrando que cada cluster foi exclusivamente representada por genes definidos. Além disso, genes candidatos individuais podem ser visualizados nas parcelas de tSNE usando a função FeaturePlot de Seurat (Figura 4 g). Isto permitiu decifrar se houve clusters que representou os macrófagos. Usando FeaturePlot, descobrimos que ambos cluster 2 e 4 foram expressando Cd68 - um marcador de pan-macrófago.
O pacote de monóculo foi usado para corroborando aglomerados de células identificados em Seurat e para a construção de trajetórias de célula, ou encomendar pseudotemporal, recapitular os processos biológicos (Figura 5). Ordenação pseudotemporal pode ser usado para amostras onde perfis de expressão de célula única são esperados para seguir um curso de tempo biológico. Células podem ser encomendadas ao longo de um continuum pseudotemporal para resolver Estados intermediários, pontos de bifurcação de dois destinos alternativos da célula e identificam as assinaturas de gene subjacente a aquisição de cada destino. Em primeiro lugar, semelhante à filtragem de Seurat, células de má qualidade foram removidas de tal forma que a distribuição do mRNA através de todas as células foi log normal e caiu entre os limites superiores e inferiores, conforme identificado na Figura 5a. Em seguida, usando a função de newCellTypeHierarchy do monóculo, células únicas foram classificadas e contados usando genes marcadores de linhagem conhecida (Figura 5b, 5C). Por exemplo, células expressando PDGF receptor alfa ou fibroblasto específico da proteína 1 foram atribuídas a célula tipo #1 para criar um critério para a definição de fibroblastos. Em seguida, esta população (célula tipo #1) foi avaliada para decifrar as trajetórias de fibroblasto. Para fazer isso, a função de GeneTest diferencial do monóculo foi utilizada, que comparou as células que representam os Estados extremos no seio da população e encontrado genes diferenciais para ordenar as células restantes na população (Figura 5D). Através da aplicação de métodos de aprendizagem múltipla (um tipo de redução de dimensionalidade não-linear) em todas as células, foi atribuída uma coordenada ao longo do caminho pseudotemporal. Esta trajetória foi depois visualizada pelo estado da célula (Figura 5e) e pseudotime (Figura 5f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> Figura 1: fluxograma. Etapas de preparação todo animal para analisar uma única célula RNA-Seq datasets para apresentação de conjuntos de dados finais para um repositório disponível publicamente. Grânulos do gel em emulsão (gemas) consulte contas com código de barras oligonucleotides que encapsulam milhares de células únicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> Figura 2: criando suspensão viável única célula do tecido nervoso. (a) desenho animado visão geral dos controlos do controlo de qualidade. (b) células e restos com células ainda incorporados em escombros (setas vermelhas). (c) células lançadas de detritos (setas vermelhas). (d) célula isolamento pela FACS. P0: fração de detritos; P1: célula-como fração; P3: exclusão de duplets; P4: negativo fração viabilidade tintura (Sytox Orange). (e) não há controle de tintura de viabilidade. (f) a imagem da fração P0 representando fragmentos isolados. (g) imagem da fração de P4, que representa células viáveis isoladas (setas vermelhas). (b) (c) (f) e (g) tinha corante nuclear adicionado 20 minutos antes de imagem. Barras de escala: 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> Figura 3: sequenciamento superficial prevê o número de células recuperadas em 10 X de amostras processadas. um exemplo (1.6 de amostra) de csv gerado pelo MiSeq listando célula códigos de barras e sua correspondente UMI conta conforme determinado pela leituras confiàvel mapeadas. (b) enredo de classificação do código de barras para amostra 1.6 mostra uma significativa queda na contagem UMI em função de códigos de barras do celular. As linhas tracejadas e sólidas representam o corte entre as células e fundo, conforme determinado pela inspeção visual. (c) códigos de barras célula observaram usando a célula Ranger gasoduto post-HiSeq revela raso sequenciamento aproximados com precisão o número de células por exemplo 1.6. (d) um exemplo de uma configuração de célula de fluxo baseado no sequenciamento superficial derivada estimativas de célula. Por exemplo 1.6, desde sequenciamento superficial previu 3480 células, 1,17 pistas foram designadas para assegurar > 100.000 leituras por cobertura de sequenciamento de celular em HiSeq. Nota: Todas as faixas devem adicionar a 100%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> Figura 4: controle de qualidade e bioinformática de célula única RNA-Seq dataset usando o pacote de Seurat R. (a) parcelas de métricas de controle de qualidade que incluem o número de genes, o número de identificadores exclusivos moleculares (UMIs) e a porcentagem de transcrições de mapeamento de genoma mitocondrial. (b) gene amostra parcelas detectar células com níveis desviantes de transcrições mitocondriais e UMIs. (c) enredo de cotovelo amostra utilizado para determinação de ad hoc dos PCs estatisticamente significativas. As linhas tracejadas e ponto-tracejado representam o corte onde um claro "cotovelo" torna-se evidente no gráfico. Dimensões do PC antes esse cotovelo são incluídos na análise a jusante. (d, e) Aglomerados de células gráfico baseado visualizados em duas resoluções diferentes em um baixo-dimensional espaço usando um enredo tSNE. (f) superior genes marcadores (amarelos) para cada cluster visualizados em uma expressão heatmap usando a função DoHeatmap de Seurat. (g) visualizando a expressão do marcador de, por exemplo, Cd68 gene representando os macrófagos (roxos) usando a função FeaturePlot de Seurat. Isto sugere que o cluster 2 e 4 (no painel d) deste dataset representa os macrófagos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> Figura 5: categorização e ordenando ao longo da trajetória de peudotemporal usando o toolkit de monóculo celular. (a) fiscalizar a distribuição de mRNA (inferido UMI contagens) em todas as células em uma amostra. Somente as células com mRNA entre 0 - ~ 20.000 foram utilizados para análise a jusante. (b, c) Atribuindo e contando os tipos de células com base em marcadores de células de linhagem conhecida. Por exemplo, células expressando PDGF receptor alfa ou fibroblasto específico da proteína 1 foram atribuídas a célula tipo #1 representando panfibroblastos usando a função de newCellTypeHierarchy do monóculo. Número de diferentes tipos de células pode ser visualizado como um gráfico de pizza (b) e como uma tabela (c). (d) usando a célula tipo #1 (fibroblastos), por exemplo, os genes usados para ordenar as células podem ser visualizadas usando um gráfico de dispersão que demonstra a dispersão de gene vs expressão significa. A curva vermelha mostra o corte para genes usados para requisitar calculado pelo modelo de média-variância usando a função de estimateDispersions do monóculo. Genes que atendam este corte foram usados para requisitar pseudotime a jusante. (e, f) Visualização trajectórias de célula em um espaço reduzido bidimensional colorido por "Estado" do célula (e) e pelo monóculo atribuído "Pseudotime" (f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Este protocolo descreve os processos gerais e controle de qualidade verifica necessário para a preparação de células simples mamíferos adultas saudáveis para preparações de RNA-Seq de célula única baseada em gotículas, alta taxa de transferência. Parâmetros de sequenciamento, alinhamento de leitura e análise de bioinformatic a jusante de célula única também são fornecidos.

Transcriptomics de célula única baseada em código de barras da gota de tecidos de mamíferos adultos

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da microbiologia, como entender as mudanças na expressão genética em milhares de células únicas após uma lesão ou uma doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite dissecar transcritos de células individuais dentro de um tecido complexo, e apreciar melhor a dinâmica funcional dentro de uma determinada população. A vantagem do nosso protocolo é que ele fornece métodos abrangentes, desde o isolamento de células únicas nos tecidos primários, até a análise e visualização desse conjunto de dados.Embora este método comece a partir de suspensões unicelulares da pele e do nervo, os métodos de sequenciamento que descrevemos podem ser aplicados para estudar qualquer tecido mamífero. Demonstrando este procedimento serão Elodie Labit, e Wisoo Shin, dois estagiários do meu laboratório. Para começar, dissecar o nervo ciático de um rato eutanizado cortando a pele pela primeira vez da região traseira da parte de trás do rato.Use uma lâmina de bisturi estéril para fazer uma incisão ao longo do comprimento da coxa. Em seguida, use fórceps finos e tesouras para expor e remover o nervo ciático. Para dissecar a pele dorsal nas costas, use fórceps finos e tesouras para fazer incisões de ombro a ombro, através da garupa, e para baixo nas costas.Lave os tecidos duas vezes com HBSS gelado. Sob um microscópio dissecando, remova tecido conjuntivo indesejado, depósitos de gordura ou detritos. Somente para a pele, corte a pele em fatias finas, usando uma lâmina de bisturi estéril.Para obter a dermis da pele, flutue as fatias de pele em dispase, em HBSS em um prato de 10 centímetros, por 30 a 40 minutos a 37 graus Celsius. Use fórceps finos para descascar e separar a epiderme da derme e, em seguida, descartar a epiderme. Em seguida, para pele e nervo, use um par de lâminas de bisturi estéreis para picar cada amostra em pedaços de um a dois milímetros.Coloque os pedaços de tecido em descongelamento fresco, dois gramas por mililitro de colagenase fria-quatro enzima em um tubo cônico de 15 mililitros. Incubar cada amostra na enzima em um banho Celsius de 37 graus por 30 minutos com agitação suave a cada 10 minutos. Aos 30 minutos, use uma pipetter P1000 para triturar o tecido 20 a 30 vezes, e retornar ao banho de água.Repita a trituração a cada 30 minutos até que a solução pareça turva, e pedaços de tecido são em grande parte dissociados. Somente para a pele, na última hora de incubação, adicione um miligrama por mililitro DNAse à amostra de pele. Uma vez que alguns tipos de células são mais sensíveis do que outros ao estresse mecânico, técnicas excessivas de dissociação podem influenciar sua população.A dissociação geral é fundamental para alcançar altos rendimentos celulares e uma representação precisa da composição tecidual. Depois disso, use um filtro de 40 micrômetros em cima do tubo cônico de 50 mililitros para filtrar cada amostra de tecido duas vezes. Enxágüe o filtro com 1% de BSA/HBSS.Depois de centrifugar as amostras como descrito no manuscrito, suspenda a pelota celular no HBSS, contendo um por cento de BSA, usando uma ponta larga, e coloque no gelo. A adição de corante de viabilidade ajudará você a otimizar sua preparação. Você deve mirar em pelo menos 80% de células viáveis.Uma vez otimizadas, esta e outras etapas de controle de qualidade podem ser omitidas para acelerar o processo de dissociação, o que preservará melhor a qualidade do RNA e reduzirá a perda celular. Para isolar células viáveis e saudáveis usando FACS, primeiro prepare tubos de fundo estreito de 15 mililitros com oito mililitros de gelo de 1% de BSA/HBSS para coletas de amostras. Para garantir que a interface entre a superfície do líquido e o interior do tubo esteja úmida, e para evitar tensão estática e superficial, inverta os tubos antes das coletas.Imediatamente após a triagem celular FACS, uma vez que as células são coletadas em um tubo de 15 mililitros, use um mililitro de um por cento de BSA/HBSS para lavar e empurrar todas as células para baixo da superfície lateral do tubo. Em seguida, centrifugar cada amostra a 260 g por oito minutos. Depois de descartar o supernascer, suspenda a pelota celular em um por cento BSA/HBSS, e adicione 33,8 microliters a um tubo, e mantenha esse tubo no gelo.Esta etapa foi projetada para ser feita utilizando reagentes obtidos a partir de um kit padronizado. Todas as etapas demonstradas devem ser executadas seguindo as instruções do fabricante. Para se preparar para a geração GEM, coloque um chip no suporte do chip, prepare uma mistura mestre de células no gelo, de acordo com o protocolo do fabricante.Adicione 56,2 microliters da mistura mestre a um tubo contendo 33,8 microliters de auto-suspensão. Para preparar o chip, primeiro com 50% de glicerol para os poços que não serão usados. Em seguida, adicione 90 microliters da mistura mestre celular a bem um, 40 microliters de contas de gel para bem dois, e 270 microliters de óleo particionário para bem três.Cubra o chip com uma junta. Para carregar o chip e executar em um controlador de célula única, primeiro ejete a bandeja. Coloque o chip na bandeja.Retraia a bandeja e pressione play. Após a execução completa, colete 100 microliters da amostra e coloque em um tubo PCR. Coloque tubos PCR em uma máquina PCR predefinida e execute de acordo com o kit.Após a execução, os GEMs incluirão cDNA de código de barras completo, a partir de mRNA poliadenylated. Coloque os tubos a menos 20 graus Celsius durante a noite. Prossiga com construção de biblioteca, sequenciamento, alinhamento e análise.Uma vez que as amostras são sequenciadas e alinhadas como descrito no manuscrito, deposite os dados em um repositório público, como o GEO do NCBI. Para isso, cadastre-se para a conta do inscrito. Primeiro, complete a submissão GEO baixando a folha de metadados.Certifique-se de incluir apenas uma folha de metadados por submissão do projeto. Coloque a planilha no diretório. Em segundo lugar, adicione o arquivo de dados bruto gerado a partir do script de contagem de células-ranger para todas as bibliotecas no diretório.A terceira pasta é arquivos de dados processados. Coloque arquivos de dados processados gerados a partir do script de contagem de células-ranger para todas as bibliotecas no diretório. Use as credenciais do servidor FTP do subsedor GEO para transferir o diretório contendo os três componentes.Depois de executar o Cell Ranger, as matrizes de código de barras genética prontas para análise podem ser processadas usando bioinformática avançada. Primeiro, foram feitas verificações de quantidade pré-processamento usando o pacote Seurat R, que gerou tramas de violino e dispersão para visualizar o número de genes, número de identificadores moleculares únicos e porcentagem de genes mitocondriais para identificar dobras celulares e outliers. Para seleção dos componentes principais, ou PCs, foram utilizadas parcelas de cotovelo, nas quais foram excluídos PCs além do platô do desvio padrão do eixo PC.A resolução do agrupamento também foi manipulada. A baixa resolução levou a menos aglomerados celulares, com cada aglomerado provavelmente representando um tipo de célula definida. A alta resolução levou a maior probabilidade celular, representando subtipos, ou estados transitórios, de uma população celular.Foram utilizadas configurações de cluster de baixa resolução para análise posterior de mapas de calor de expressão para identificar os genes mais altamente expressos em um determinado cluster. Genes de candidatos individuais foram visualizados em parcelas do TSNE, usando a função de enredo de Seurat, que permitiu decifrar, se havia aglomerados que representavam, por exemplo, macrófagos. Ambos o cluster dois e quatro expressaram CD68, um marcador pan-macrófago.Outros pacotes também fornecem ferramentas para controle de qualidade, por exemplo, o Monóculo, um pacote R usado para a construção de trajetórias celulares, remove células de má qualidade e garante que a distribuição de mRNA em todas as células seja normal e entre os limites superior e inferior. As células únicas foram então classificadas e contadas, usando genes marcadores de linhagem conhecidos, e as células expressando marcadores de interesse foram atribuídas ao tipo celular número um. Foi determinado que o tipo celular número um eram fibroblastos.Essa população foi avaliada para construir trajetória de desenvolvimento de fibroblastos. Após este procedimento, outros métodos como PCR quantitativo, hibridização in situ, uma química imunista deve ser realizada para validar a precisão dos resultados da expressão genética. O sequenciamento de mRNA unicelulares abriu agora o caminho para pesquisadores em muitos campos diferentes explorarem a heterogeneidade célula-celular, e identificar dinâmicas funcionais dentro de diferentes tecidos durante a homeostase, e como estes podem mudar após lesões ou no desenvolvimento de doenças.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranucleares microinjeção de DNA em Dissociated neurônios de mamíferos adultos

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Biologia

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

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Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

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Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Crescimento anaeróbico e manutenção de linhas de células de mamíferos

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Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Ensaio de cultura de myofibra única para a avaliação da funcionalidade de células-tronco musculares adultas Ex Vivo

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