Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Мы признаем вспомогательного персонала на объекте UCDNA услуг, а также животных уход сотрудников Фонда в Университете Калгари. Мы благодарим Matt Workentine за его поддержку биоинформатики и Йенс Durruthy его технической поддержки. Эта работа финансируется грантом КНИИЗ (р.м. и J.B.), КНИИЗ новую награду следователь J.B., и Альберта детей здоровья исследовательский институт стипендий (J.S.).

<ol>
	<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+for+cellular+variation.">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation.</a> Nature. 510, 363-369 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161, 1202-1214 (2015).</li><li>Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+single-cell+RNA-seq+analysis+landscape+with+the+scRNA-tools+database.">Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database.</a> bioRxiv:206573. , (2018).</li><li>Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+defines+heterogeneity+and+transcriptional+dynamics+in+the+adult+neural+stem+cell+lineage.">Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage.</a> Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).</li><li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+Reveals+a+Population+of+Dormant+Neural+Stem+Cells+that+Become+Activated+upon+Brain+Injury.">Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Schwann+Cells+from+Adult+Human+Skin+and+Nerve.">Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Agilent Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135">https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135</a> (2018)</li><li>Kolodziejczyk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+RNA-Sequencing+of+Pluripotent+States+Unlocks+Modular+Transcriptional+Variation.">Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation.</a> Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex.">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).</li><li>. Sequencing Requirements for Single Cell 3' Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3</a> (2018)</li><li>. Introduction to R Available from: <a target="_blank" href="https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r">https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Creating a Reference Package with cellranger mkref Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references</a> (2018)</li><li>. System Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements</a> (2018)</li><li>. Software Downloads Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</a> (2018)</li><li>. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization</a> (2018)</li><li>. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial</a> (2018)</li><li>. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data Available from: <a target="_blank" href="https://www.scrna-tools.org/">https://www.scrna-tools.org/</a> (2018)</li><li>. Downloading conda Available from: <a target="_blank" href="https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html">https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html</a> (2018)</li><li>. r / packages / r 3.5.1 Available from: <a target="_blank" href="https://anaconda.org/r/r">https://anaconda.org/r/r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. Seurat - Guided Clustering Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html">https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>Github. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).</li><li>. GenBank Submission Portal Wizards Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/</a> (2018)</li><li>. Submitting data Available from: <a target="_blank" href="https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/">https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/</a> (2018)</li><li>Shah, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+and+Fate+Mapping+of+Ependymal+Cells+Reveals+an+Absence+of+Neural+Stem+Cell+Function.">Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function.</a> Cell. 173, 1045-1057 (2018).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11, 1 (2013).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144, 3625-3632 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96, 313-329 (2017).</li><li>Zeigenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+states+versus+single-cell+atlases+-+two+classes+of+heterogeneity+that+differ+in+meaning+and+method.">Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method.</a> Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).</li><li>Herman, J. S., Sagar, D., Gr&#252;n, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FateID+infers+cell+fate+bias+in+multipotent+progenitors+from+single-cell+RNA-seq+data.">FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data.</a> Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).</li></ol>

Нет раскрытия информации

Этот протокол демонстрирует соответствующую подготовку одиночных клеток может раскрыть транскрипционный анализ гетерогенности тысячи одиночных клеток и дискриминацию функциональных состояний или уникальных сотовых тождества в ткани. Протокол не требует репортер флуоресцентные белки или трансгенных инструментов и может быть применен к изоляции одиночных клеток из различных тканей, представляющих интерес, в том числе от людей; Имея в виду каждая ткань уникальна, и этот протокол потребует определенной перестройки/модификации.
Разнообразных и весьма динамичный транскрипционный анализ программ внутри клетки подчеркивали значение одной ячейки геномики. Помимо изоляции высокого качества РНК, критических образца Подготовка шаг, необходимый для высокого качества наборов данных является обеспечение того, что клетки полностью освобождаются от ткани и клетки являются здоровыми и нетронутыми. Это довольно прямо вперед для сбора клеток, которые легко выпущена, например циркулирующих клеток или тканей, где слабо сохраняются клетки, такие как лимфоидной ткани. Но это может быть сложным для других взрослых тканях, благодаря высокоразвитой сотовой архитектуры, охватывающих большие расстояния, окружающих внеклеточного матрикса и часто жесткой цитоскелета белков, участвующих в поддержании клеточной структуры. Даже с соответствующим диссоциации методов для полного отпуска клеток есть потенциал, что строгие и часто продолжительной обработки требуется изменит качество и ячейки целостность мРНК. Кроме того высокие температуры, используемые для фермента помощь диссоциации также влияют на transcriptional подписей29,30. Целью протокола является в настоящее время контроль качества проверяет, используя ткани, такие как Миелинизированные нервные взрослых и внеклеточной матрицы богатых взрослых кожи, чтобы продемонстрировать, как оптимизация может помочь преодолеть эти препятствия.
Главным соображением при разработке любого эксперимента scRNA-Seq является выбор последовательности глубины. Последовательность может быть весьма мультиплексированием и читать глубина может варьироваться от очень низкий, с помощью Drop-Seq2 до 5 миллионов читает/ячейку14 полнометражных методом РНК-Seq как смарт-последующие Большинство scRNA-Seq эксперименты можно обнаружить умеренно высокий выражение стенограммы с последовательности как низко как 10 000 читает/клетки, которые обычно достаточно для ячейки типа классификации41,42. Глубина мелкой последовательности имеет значение сэкономить на стоимости последовательности при попытке обнаружить редкие клеточных популяций через сложные ткани, где тысячи клеток может потребоваться приписать уверенно редких населения. Но глубине последовательности не адекватные, когда необходима подробная информация о экспрессии генов и процессы, связанные с тонкими transcriptional подписей. В настоящее время предполагается, что большая часть генов в клетке обнаружены с 500.000 читает/клетки, но это может варьироваться в зависимости от протокола и ткани типа43,-44. Хотя полнометражного Стенограмма последовательности обходит необходимость сборки и может таким образом, обнаружить роман или редкие сращивания варианты, секвенирование расходы часто ограничивают масштабирования таких подходов для изучения тысяч клеток, включающий систему сложных тканей. В отличие от 3' тегами одноклеточных библиотек такие, как те, указанных в настоящем Протоколе обычно ниже сложности и требуют меньшую последовательности. Важно отметить, что на одном из пяти поддерживаемых синтезаторов можно упорядочивать библиотеки, созданные с помощью описанных протокол: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 быстрый запуск и высокий выход, 4) NextSeq 500/550 и 5) MiSeq.
Альтернативный подход к одной ячейке РНК-Seq, что снижает потребность в деликатных тканей и клеток, обработки еще не поддерживает некоторые из преимуществ одной ячейки РНК-Seq, является анализ РНК от одного ядра45. Этот подход позволяет более быстрой обработки, сокращения масштабов деградации РНК и более экстремальные меры для обеспечения надлежащего релиз ядра и таким образом вероятно позволяет более уверенно захвата транскрипционный анализ профилей, представляющий все ячейки в пределах данной ткани. Это конечно, только бы часть транскрипционный анализ деятельности в рамках данной ячейки, таким образом, в зависимости от того, каковы цели экспериментальных интерес этот подход может быть или не быть соответствующие.
Кроме полной характеристики сотовых самобытности в рамках данной ткани один из самых ценных анализов для scRNA-Seq наборов данных является оценка промежуточных транскрипционный анализ государств через «определенных» клеточных популяций. Эти промежуточные государства могут распространять идеи в линии связи между клетки внутри выявленных групп населения, которые не удалось с традиционными навалом, РНК-Seq подходов. Несколько scRNA-Seq bioinformatic инструменты были разработаны для выяснения этого. Такие инструменты могут оценить процессы, занимающиеся, например, раковые клетки, переходит к онкогенных/метастатического состояние, стволовые клетки, созревания в разнообразных терминала судьбы или иммунных клеток, курсируя между активным и покоя государствами. Транскриптом тонкие различия в клетках может также свидетельствовать о lineage предубеждения, что недавно разработанных bioinformatic инструменты, такие как FateID, может вывести47. Поскольку различия между переход клеток может быть трудным для выяснения учетом транскрипционный анализ различий может быть тонким, глубже последовательности может быть необходимым46. К счастью освещение неглубоко виртуализированного библиотеки может быть увеличена, если заинтересованы в зондирующего дальнейшего набора данных, повторно запустив библиотеке на другую ячейку потока.
Взятые вместе, этот протокол обеспечивает легко адаптировать рабочий процесс, который позволяет пользователям транскрипционно профиль сотни тысяч сингл клеток в пределах одного эксперимента. Конечное качество набора scRNA-Seq опирается на оптимизированные ячейки изоляции, проточной цитометрии, кДНК библиотеки поколения и интерпретации сырья ген штрих матриц. С этой целью этот протокол обеспечивает всесторонний обзор всех ключевых шагов, которые могут быть легко изменены для включения исследования тканей различных типов.

С развитием выдвижений в удобной Биоинформатика инструменты в течение последнего десятилетия3и высокую пропускную способность одной ячейки технологии1,2 возникло новое поле с высоким разрешением ген выражение анализа – Одноместный клеточной РНК последовательности (scRNA-Seq). Изучение экспрессии генов в одной ячейке впервые была разработана для выявления неоднородности в пределах определенных клеточных популяций, такие как в стволовых клеток или раковые клетки, или для выявления редких популяции клеток4,5, которые были недостижимой с помощью традиционных массовых РНК последовательности методов. Инструменты bioinformatic позволили идентификации новых подгрупп населения (сера)2, Визуализация ордена клетки вдоль psuedotime пространства (монокль)6, определение активных сигналов сетей внутри или между населением ( ЖИВОПИСНЫЕ)7, предсказание Ассамблеи сингл-клеток в искусственной 3D пространстве (сера и более)8. Эти новые и захватывающие анализы доступны для научного сообщества scRNA-Seq быстро становится новый стандартный подход для анализа выражения гена.
Несмотря на огромный потенциал scRNA-Seq технические skillsets, требуется производить чистую набора данных и точно интерпретировать результаты может быть сложным для новичков. Здесь основные, но всеобъемлющего протокола, начиная от изоляции единичных клеток от всей первичной тканей для визуализации и представления данных для публикации представлен (рис. 1). Во-первых изоляции здоровых единичных клеток может считаться сложным, как различные ткани различаются по степени их чувствительности к ферментативного пищеварения и последующие механические диссоциации. Этот протокол обеспечивает руководство в эти меры изоляции и идентифицирует важные качества контрольно-пропускных пунктах на протяжении всего процесса. Во-вторых понимание совместимость и требования между технологией одну ячейку и секвенирование нового поколения может быть запутанным. Этот протокол обеспечивает руководящие принципы для реализации платформы удобной, на основе капелька штриховое кодирование одноклеточных и выполнения последовательности. Наконец компьютерное программирование является важной предпосылкой для анализа транскриптомики Одноячеистые наборы данных. Этот протокол предоставляет ресурсы для начала работы с языком программирования R и предоставляет руководство по реализации двух популярных scRNA-Seq-R пакетов. Вместе этот протокол может направлять новичков в анализ scRNA-Seq для получения четких, интерпретируемых результатов. Этот протокол может корректироваться в большинстве тканей в мыши и главное, может быть изменен для использования с другими организмами, включая человеческие ткани. Коррективы в зависимости от ткани и пользователю будет необходимо.
Есть несколько соображений, чтобы иметь в виду, в то время как после этого протокола; включая, 1) после всех руководящих принципов контроля качества в шаги 1 и 2 настоящего Протокола рекомендуется обеспечить жизнеспособные одноклеточного подвеска всех клеток в образце интерес обеспечивая точное общее число клеток (кратко в Рисунок 2 ). После того, как это достигается, и если все оптимизированные условия соблюдаются, контроль качества шаги могут быть удалены (чтобы сэкономить время - сохранение качества РНК и сокращение ячеек потери). Подтверждение успешной изоляции одной высокой жизнеспособности клеток из ткани интерес очень рекомендую перед любой вниз по течению обработки. 2) так как некоторые типы клеток более чувствительны, чем другие, чтобы подчеркнуть, чрезмерная разобщенность методы могут непреднамеренно смещения населения, поэтому смешанным течению анализа. Нежный диссоциации без ненужных сотовой стрижка и пищеварение имеет решающее значение для достижения высоких урожаев сотовой и точное представление о составе ткани. Сдвига происходят во время действия Тритурация, СУИМ и ресуспендирования. 3) как с любой работой РНК, лучше представить, как мало дополнительных РНКазы в выборку можно во время подготовки. Это будет способствовать поддержанию высокого качества РНК. Используйте решения Ингибитор рибонуклеазы с промывки чистые инструменты и оборудования, которое не является РНКазы бесплатно, но избежать DEPC-лечение продуктами. 4) выполняют подготовку как можно быстрее. Это поможет сохранить высокое качество РНК и уменьшить смерти клетки. В зависимости от длины рассечение тканей и животных номер рассмотреть возможность начала несколько Анатомирование/препараты в то же время. 5) Подготовьте клетки на льду, когда можно поддерживать высокое качество РНК, сократить гибель клеток и медленно ячейки сигнализации и транскрипционный анализ активности. Хотя, ледяной обработка идеально подходит для большинства типов клеток, некоторые типы клеток (например, нейтрофилов) работают лучше при обработке при комнатной температуре. 6) Избегайте кальция, магния, ЭДТА и DEPC-лечение продукты во время подготовки ячейки.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

Анализ экспрессии генов одну ячейку на тысячи отдельных ячеек в ткани или микроокружения является ценным инструментом для выявления клеточный состав, дискриминации функциональных состояний и молекулярные пути, лежащие в основе наблюдаемых ткани функции и поведения животных. Однако изоляции нетронутыми, здоровые клетки одного из взрослых тканей млекопитающих для последующего течению одноклеточного молекулярного анализа может быть сложным. Этот протокол описывает общие процессы и контроль качества проверяет, что необходимо для получения высокого качества взрослые одноклеточного препараты от нервной системы или кожи, включен последующих беспристрастной одноклеточного РНК последовательности и анализа. Также предоставляются рекомендации по течению bioinformatic анализа.

Репертуар открытым исходным кодом упаковок, предназначенных для анализа наборов данных scRNA-Seq резко увеличилось40 с большинством этих пакетов использования языков на основе R3. Здесь представлены представителя результаты, с использованием двух из этих пакетов: оценки без присмотра группировки одной ячейки, основанные на выражении гена и заказ единичных клеток по траектории с целью разрешить мобильный неоднородность и разобрать биологического процессы.
Рисунок 4 иллюстрирует использование Сёра для предварительной обработки, проверки качества и анализ течению биоинформатики. Во-первых фильтрации и удаления девиантного клеток от анализа имеет важное значение для проверки качества. Это было сделано с помощью скрипки (рис. 4a) и точечные участки (Рисунок 4b) визуализировать процент митохондриальных генов, количество генов (nGene) и количество UMI (Нуми) для идентификации ячейки Дуплеты и промахи. Любую ячейку с четкой останец количество генов, UMI или процент митохондриальных генов был удален с помощью Seurat FilterCells функции. Так как Сёра использует основной компонент (PC) анализа оценки кластеры клеток, определения статистически ПК включить является важным шагом. Отвод участков (рис. 4 c) были использованы для выбора ПК, в которых компьютеры за пределами плато стандартное отклонение ПК оси были исключены. Резолюции кластеризации также было манипулировать, продемонстрировав что количество кластеров может быть изменен, начиная от 0.4 (низкое разрешение, ведущих к меньше ячейка кластеров, Рисунок 4 d) до 4 (высокое разрешение приводит к выше ячейки кластеров, рисунке 4e ). С низким разрешением вполне вероятно, что каждый кластер представляет тип определенной ячейки, в то время как с высоким разрешением, это может также представлять подтипы или переходного состояния популяции клеток. В этом случае параметры кластера с низким разрешением были использованы для дальнейшего анализа выражения карты (с помощью функции DoHeatmap Seurat) для выявления наиболее выраженной генов в данной группе (Рисунок 4f). В данном случае наиболее сильно выраженной гены были определены путем оценки дифференциальной выражения в данной группе против всех других кластеров комбинированные, демонстрируя, что каждый кластер представлял однозначно определенных генов. Кроме того отдельные кандидат гены могут быть визуализированы на tSNE участках, с помощью функции FeaturePlot Seurat (Рисунок 4 g). Это позволило расшифровка существуют ли кластеры, которые представлены макрофагов. С помощью FeaturePlot, мы обнаружили, что оба кластер 2 и 4 выражая Cd68 - Пан макрофагального маркер.
Монокль пакет был использован для соответствующей ячейки кластеры, выявленные в Сёра и для построения клеток траекторий, или pseudotemporal заказ, резюмировать биологических процессов (рис. 5). Pseudotemporal заказа может использоваться для образцов где одноклеточных выражение профили, как ожидается, следовать курсом биологического времени. Клетки можно заказать вдоль pseudotemporal континуум решить промежуточных состояний, точек бифуркации, два альтернативных клеток судеб и идентификации генов подписей лежащие в основе приобретение каждого судьбы. Во-первых, аналогично фильтрации Seurat, низкое качество клетки были удалены таким образом, чтобы распределение мРНК для всех ячеек было нормальное и упал между верхней и нижней границы, как это определено в Рисунок 5aжурнала. Затем с помощью функции newCellTypeHierarchy монокль в отдельные клетки были классифицированы и рассчитывает с помощью известных линии маркерных генов (Рисунок 5b, 5 c). Например клетки, выражая PDGF рецепторов альфа или фибробластов конкретных белок 1 были переданы ячейки тип #1 для создания критерия для определения фибробластов. Далее эта группа населения (ячейки типа #1) оценивали расшифровать фибробластов траекторий. Для этого был использован монокль в дифференциальной GeneTest функция, которая сравнению клетки, представляющие экстремальных государства в рамках населения и нашел дифференциального генов для заказа оставшиеся ячейки в численности населения (рис. 5 d). Путем применения методов коллектор обучения (тип уменьшения нелинейных размерность) для всех ячеек, был назначен координату вдоль pseudotemporal пути. Эта траектория был затем визуализирована состояния клеток (рис. 5e) и pseudotime (рис. 5f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> Рис 1: диаграмма. Шагах от всей животных подготовки к анализу одной ячейки РНК-Seq наборов данных для представления окончательного наборов данных в хранилище общедоступных. Гель бусинки в эмульсии (ГСМОС) относятся к бусины с перепутываются олигонуклеотиды, инкапсулирующие тысячи одиночных клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> Рисунок 2: создание жизнеспособных одноклеточного подвеска из нервных тканей. (a) мультфильм Обзор проверок контроля качества. (b) клеток и мусора с клетки по-прежнему включены в мусора (красные стрелки). (c) клетки, освобождены от мусора (красные стрелки). (d) изоляция клетки, СУИМ. P0: мусора фракция; P1: клетки как фракция; P3: исключение триоли; P4: жизнеспособности краситель (Sytox оранжевый) отрицательные дроби. (e) не жизнеспособности управления красителя. (f) изображение фракции P0, представляющий изолированных мусора. (g) изображение фракции P4, представляющие изолированных жизнеспособных клеток (красные стрелки). (b) (c) (f) и (g) ядерных краситель, добавил 20 минут до изображений. Масштаб баров: 80 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> Рисунок 3: мелкие последовательности предсказывает количество восстановленных клеток в 10 X обработанные образцы. () пример (образец 1.6) MiSeq созданные csv список ячейки штрих-кода и его соответствующий UMI подсчитывает как определяется уверенно сопоставленных читает. (b) ранга участок штрих-кодов для образца 1.6 показывает одно значительное падение в UMI count как функция ячейки штрих-кода. Пунктирная и твердой линии представляют отсечки между клетками и фона определяется визуального осмотра. (c) клетки штрих отмечено, используя ячейки Рейнджер конвейер пост HiSeq показывает, что мелкие последовательности точно аппроксимировать количество клеток для образца 1.6. (d) пример потока клеточной структуры, основанные на мелкие последовательности полученных оценок клетки. Для образца 1.6, поскольку мелкие последовательности предсказал 3480 клетки, 1.17 переулки были назначены для обеспечения > 100000 чтения за охват клетки последовательности в HiSeq. Примечание: Все полосы необходимо добавить до 100%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> Рисунок 4: контроль качества и биоинформатики одноклеточных РНК-Seq набора данных с помощью пакета Сёра Р. (a) участков контроля качества метрик, которые включают в себя количество генов, молекулярные уникальных идентификаторов (UMIs) и процент стенограммы, сопоставление митохондриального генома. (b) образец гена участков детектирования клетки с девиантным уровнями митохондриальной стенограммы и UMIs. (c) образец локоть участок используется для специального определения статистически шт. Пунктирная и точка пунктирной линии представляют отсечки, где четкое «колено» становится очевидным в графе. PC размеры до этого локоть включены в анализ вниз по течению. (d, e) Граф на основе клеток кластеры визуализирована на двух различных резолюций в низкоразмерных пространства с помощью tSNE участок. (f) топ маркерных генов (желтая) для каждого кластера на heatmap выражения, с помощью функции DoHeatmap Seurat. (g) визуализации маркер выражения гена, например, Cd68 представляющих макрофагов (фиолетовый) с помощью функции FeaturePlot Seurat. Это предполагает, что этот кластер 2 и 4 (Группа d) этого набора данных представляет макрофагов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> Рисунок 5: сотовый категоризации и заказ по peudotemporal траектории, используя Инструментарий монокль. a проверять распределение мРНК (выведен из графов UMI) для всех ячеек в образце. Только клетки с мРНК между 0 - ~ 20000 были использованы для анализа ниже по течению. (b, c) Назначение и подсчета клеток типы, основанные на известных lineage маркеров ячейки. Например, клетки, выражая PDGF рецепторов альфа или фибробластов конкретных белок 1 были назначены в ячейке тип #1 представляющих Пан фибробластов с помощью функции newCellTypeHierarchy в монокль. Количество различных типов клеток могут быть визуализированы как на круговой диаграмме (b) и как таблицы (c). (d) с помощью ячейки типа #1 (фибробласты) как, например, используемые для сортировки клеток могут быть визуализированы с помощью точечной, демонстрирующий гена дисперсии против означает выражение генов. Красная кривая показывает отсечки для генов используется для заказа рассчитанные среднеквадратическое отклонение модели с помощью функции estimateDispersions в монокль. Гены, которые отвечают этой отсечки были использованы для вниз по течению pseudotime заказа. (e, f) Визуализация траекторий клеток в цветные ячейки «государства» (e) и назначен монокль «Pseudotime» (f) сокращение двумерном пространстве. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Этот протокол описывает общие процессы и контроль качества проверяет необходимые для подготовки здоровых взрослых клеток млекопитающих одной капли основе, высокая пропускная способность одной ячейки РНК-Seq препаратов. Также предоставляются последовательности параметров, чтения выравнивание и вниз по течению одноклеточных bioinformatic анализа.

Капли на основе штриховое кодирование одну ячейку Transcriptomics взрослых тканей млекопитающих

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии, такие как понимание изменения экспрессии генов в тысячах одиночных клеток после травмы или болезни. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет нам вскрывать транскриптомы отдельных клеток в сложной ткани, а также лучше оценить функциональную динамику в данной популяции. Преимущество нашего протокола заключается в том, что он предоставляет комплексные методы, от изоляции одиночных клеток в первичных тканях до анализа и визуализации этого набора данных.Хотя этот метод начинается с одноклеточных суспензий от кожи и нерва, методы секвенирования, которые мы описываем, могут быть применены для изучения любой ткани млекопитающих. Демонстрацией этой процедуры будут Элоди Лабит и Вису Шин, два стажера из моей лаборатории. Для начала, вскрыть седалищный нерв усыпанной мыши, сначала отрезав кожу от задней области задней части мыши.Используйте стерильное лезвие скальпеля, чтобы сделать разрез по длине бедра. Затем используйте тонкие типсы и ножницы, чтобы разоблачить и удалить седалищный нерв. Чтобы вскрыть спинную кожу спины, используйте тонкие миппы и ножницы, чтобы сделать разрезы с плеча на плечо, через колею, и вниз по спине.Вымойте ткани дважды с ледяной HBSS. Под рассеченным микроскопом удалите нежелательные соединительной ткани, жировые отложения или мусор. Только для кожи нарежьте кожу тонкими ломтиками, используя стерильное лезвие скальпеля.Чтобы получить кожу дермы, плавать ломтики кожи в dispase, в HBSS в 10 сантиметров блюдо, в течение 30 до 40 минут при 37 градусов по Цельсию. Используйте тонкие типсы, чтобы очистить и отделить эпидермис от дермы, а затем отказаться от эпидермиса. Затем, для кожи и нерва, используйте пару стерильных лезвий скальпеля, чтобы измельчить каждый образец на один-два миллиметра штук.Поместите кусочки ткани в свежеоттая, два грамма на миллилитр холодного коллагеназы четыре фермента в 15 миллилитров конической трубки. Инкубировать каждый образец фермента в 37-градусной ванне по Цельсию в течение 30 минут с нежной тряской каждые 10 минут. На 30 минут, использовать P1000 pipetter тритурировать ткани 20 до 30 раз, и вернуться к водяной бане.Повторяйте тритурацию каждые 30 минут, пока раствор не появится облачным, и куски ткани в значительной степени разобщены. Только для кожи, в последний час инкубации, добавить один миллиграмм на миллилитр DNAse в образец кожи. В виду того что некоторые типы клетки более чувствительны чем другие к механически усилию, чрезмерно методы разобщенности могут смещения ваше населенность.Общая диссоциация имеет решающее значение для достижения высоких урожаев клеток, и точное представление состава тканей. После этого используйте 40-метровый фильтр поверх конической трубки 50 миллилитров, чтобы дважды отфильтровать каждый образец ткани. Промыть фильтр одним процентом BSA/HBSS.После центрифугирования образцов, описанных в рукописи, повторно приостанавливайте гранулы клеток в HBSS, содержащие один процент BSA, используя широко скважинный наконечник, и поместите на лед. Добавление красителя жизнеспособности поможет вам оптимизировать ваш препарат. Вы должны стремиться, по крайней мере 80 процентов жизнеспособных клеток.После оптимизации, этот и другие шаги контроля качества могут быть опущены для того, чтобы ускорить процесс диссоциации, что позволит лучше сохранить качество РНК и уменьшить потерю клеток. Чтобы изолировать жизнеспособные и здоровые клетки с помощью FACS, сначала подготовьте 15 миллилитров узкодонных трубок с восемью миллилитров ледяного 1 процента BSA/HBSS для сбора образцов. Для обеспечения того, чтобы интерфейс между поверхностью жидкости и внутренней частью трубки был влажным, а также для предотвращения статического и поверхностного натяжения, инвертировать трубки перед коллекциями.Сразу же после сортировки клеток FACS, как только клетки собираются в 15 миллилитровую трубку, используйте один миллилитр одного процента BSA/HBSS, чтобы мыть и толкать все клетки вниз от боковой поверхности трубки. Затем центрифуга каждого образца на 260 г в течение восьми минут. После отказа от супернатанта, повторно приостановить ячейки гранулы в один процент BSA / HBSS, и добавить 33,8 микролитров в трубку, и держать трубку на льду.Этот шаг предназначен для использования реагентов, полученных из стандартизированного комплекта. Все продемонстрированые шаги должны выполняться в соответствии с инструкциями производителя. Чтобы подготовиться к генерации GEM, поместите чип в держатель чипа, подготовьте смесь мастера ячейки на льду, согласно протоколу производителя.Добавьте 56,2 микролитров мастер-микса в трубку, содержащую 33,8 микролитров самооправляемой. Чтобы подготовить чип, сначала на 50 процентов глицерол для скважин, которые не будут использоваться. Затем добавьте 90 микролитров смеси мастера клеток к хорошо одному, 40 микролитров гелеобразных бусин хорошо два, и 270 микролитров перегородки масла к хорошо три.Обложка чип с прокладкой. Чтобы загрузить чип, и запустить в одноклеточный контроллер, сначала извлечь лоток. Поместите чип в лоток.Увяйте лоток и нажмите игру. После полного запуска соберите 100 микролитров образца и поместите в трубку ПЦР. Поместите ПЦР трубки в предустановленную машину PCR и запустите в соответствии с комплектом.После запуска, GEMs будет включать в себя полнометражный, штрих-код cDNA, от полиаденилатной мРНК. Поместите трубки при температуре минус 20 градусов по Цельсию на ночь. Продолжить строительство библиотеки, секвенирование, выравнивание и анализ.После того, как образцы секвенированы и выровнены, как описано в рукописи, депонировать данные в общедоступный репозиторий, таких как GEO NCBI. Для этого зарегистрируйтесь на учетную запись отправителя. Во-первых, заполните представление GEO, загрузив лист метаданных.Убедитесь в том, чтобы включить только один лист метаданных на представление проекта. Поместите электронную таблицу в каталог. Во-вторых, добавьте в каталог необработанный файл данных, генерируемый из сценария подсчета ячеек для всех библиотек.Третья папка обрабатывается файлами данных. Поместите обработанные файлы данных, полученные из сценария подсчета ячеек для всех библиотек, в каталог. Используйте учетные данные сервера FTP отправителя GEO для передачи каталога, содержащего все три компонента.После запуска Cell Ranger, готовые к анализу матрицы генного штрих-кода могут быть дополнительно обработаны с помощью передовой биоинформатики. Во-первых, предварительная обработка количества проверок была проведена с использованием пакета Seurat R, который генерируется скрипки и рассеяния участков для визуализации количества генов, количество уникальных молекулярных идентификаторов, и процент митохондриальных генов для выявления клеток дублетов и выбросов. Для выбора основных компонентов, или ПК, использовались локтевые участки, в которых были исключены ПК за пределами плато стандартного отклонения оси ПК.Было также манипулировать разрешением кластеризации. Низкое разрешение привело к уменьшению кластеров ячееок, при этом каждый кластер, вероятно, представляет определенный тип ячейки. Высокое разрешение привело к более высокой вероятности клеток, представляющих подтипы, или переходные состояния, популяции клеток.Настройки кластера низкого разрешения использовались для дальнейшего анализа карт экспрессии тепла для определения наиболее высоко выраженных генов в данном кластере. Отдельные гены-кандидаты визуализировались на участках tSNE, используя функцию сюжета Seurat, что позволяло расшифровывать, были ли кластеры, которые представляли, например, макрофаги. Оба кластера два и четыре выраженных CD68, пан-макрофаг маркер.Другие пакеты также предоставляют инструменты для контроля качества, например, Monocle, пакет R, используемый для построения траекторий ячейки, удаляет некачественные ячейки и гарантирует, что распределение мРНК по всем ячейкам является нормальным журналом и упало между верхними и нижними границами. Одиночные клетки после этого были классифицированы и подсчитаны, используя известные гены маркера линии, и клетки выражая маркеры интереса были заданы к типу клетки одно. Было установлено, что тип клетки номер один были фибробласты.Эта популяция была оценена для построения траектории развития фибробластов. После этой процедуры, другие методы, такие как количественный ПЦР, на месте гибридизации, иммунологической химии должны быть выполнены для проверки точности результатов экспрессии генов. Одноклеточное секвенирование мРНК в настоящее время проложило путь для исследователей во многих различных областях, чтобы исследовать неоднородность клетки к клетке, и определить функциональную динамику в различных тканях во время гомеостаза, и как они могут измениться после травмы или в развитии болезни.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Внутриядерных микроинъекции ДНК в диссоциированных взрослых млекопитающих Нейроны

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Препарирование органов у взрослых данио рерио

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

МИССИЯ esiRNA для скрининга RNAi в клетках млекопитающих

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell транскрипции Профилирование взрослых кардиомиоцитов мышь

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Анализ сотового Позиция цикла в клетках млекопитающих

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Измерение уровней Гем синтез в клетках млекопитающих

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Эффективное млекопитающих выражение клеток и Пошаговый Очистка внеклеточной гликопротеинов для кристаллизации

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Анаэробные роста и поддержания линий клеток млекопитающих

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 обогащает урожайность меланоцитов человека из тканей кожи взрослого человека

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Один анализ культуры миофибры для оценки функциональности взрослых мышечных стволовых клеток Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...