Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Reconocemos que el personal de apoyo en la instalación de servicios de UCDNA, así como el personal de la institución de cuidado Animal de la Universidad de Calgary. Agradecemos a Matt Workentine por su apoyo de Bioinformática y Jens Durruthy por su apoyo técnico. Este trabajo fue financiado por una donación CIHR (R.M. y J.B.), un premio de investigador nuevo de CIHR y J.B., salud investigación Instituto beca (J.S. un infantil de Alberta).

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No hay revelaciones

Este protocolo demuestra cómo la preparación adecuada de las células puede revelar la heterogeneidad transcripcional de miles de células individuales y discriminar Estados funcionales o identidades únicas celulares dentro de un tejido. El Protocolo no requiere proteínas reportero fluorescente o herramientas de transgénicos y se puede aplicar al aislamiento de las células de diversos tejidos, incluyendo los de seres humanos; teniendo en cuenta cada tejido es único y este protocolo requiere cierto grado de ajuste o la modificación.
Los programas transcripcionales diversos y dinámicos dentro de las células han hecho hincapié en el valor de la sola célula genómica. Además de aislar el RNA de alta calidad, un paso de preparación de muestra crítica necesario para conjuntos de datos de alta calidad es asegurar que las células se liberan completamente de tejido y que las células son sanos e intactos. Esto es relativamente directo para la recolección de células que son fácilmente liberados, como la circulación de las células o en los tejidos donde las células se mantienen libremente, como en los tejidos linfoides. Pero esto puede ser un reto para otros tejidos adultos, debido a la arquitectura celular altamente desarrolladas que abarcan largas distancias, que rodea la matriz extracelular y las proteínas citoesqueléticas rígido a menudo involucrados en mantener la estructura de la célula. Incluso con técnicas de disociación apropiado para la versión completa de las células, es posible que la rigurosa y a menudo largas elaboraciones alteraría integridad calidad y celular mRNA. Además, las altas temperaturas usadas para ayuda de enzima disociación también afectan a firmas transcripcional29,30. El propósito del protocolo es presentar control de calidad verifica, utilizando tejidos como el nervio myelinated adulto y la piel de adultos de ricos en matriz extracelular, para demostrar cómo la optimización puede ayudar a superar estos obstáculos.
Una consideración importante al diseñar cualquier experimento de scRNA-Seq es la elección de la profundidad de la secuencia. La secuencia puede ser altamente multiplexada y leer profundidad puede variar de ser muy bajo con Seq gota2 a hasta 5 millones de lecturas/celular14 utilizando un método integral de RNA-Seq como Smart-SS. Mayoría de los experimentos scRNA-Seq puede detectar transcripciones de moderada a alta expresión con secuencias tan bajo como 10.000 lecturas/célula, que es generalmente suficiente para celular tipo clasificación41,42. Profundidad de la secuencia superficial es de valor para ahorrar en costos de secuenciación para detectar poblaciones de raros de la célula a través de tejidos complejos que pueden ser necesarios miles de células atribuir con confianza las poblaciones raras. Pero la secuencia de la profundidad no es adecuada cuando es necesaria obtener información detallada sobre expresión de genes y procesos asociados con firmas transcripcionales sutiles. Actualmente, se estima que la gran mayoría de los genes en una célula se detecta con 500.000 lecturas/cell, pero esto puede variar dependiendo del protocolo y tejido tipo43,44. Mientras que secuencia de transcripción larga duración evita la necesidad de Asamblea y, por lo tanto, detectar novela o variantes raras de empalme, los costes de la secuenciación a menudo limitan escala estos enfoques para examinar miles de células que comprende un sistema complejo tejido. En contraste, 3' etiquetado bibliotecas unicelular como las descriptas en este protocolo por lo general tienen menor complejidad y requieren menor secuencia. Es importante tener en cuenta que pueden ser secuenciadas de bibliotecas mediante el protocolo descrito en uno de los secuenciadores compatibles cinco: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 ejecutar rápida y alto rendimiento, 4) NextSeq 500/550 y 5) MiSeq.
Un enfoque alternativo a celular solo RNA-Seq, que reduce la necesidad de delicados tejidos y células manejo todavía mantiene algunos de los beneficios de célula única RNA-Seq, es el análisis de ARN de núcleos solo45. Este enfoque permite la tramitación más rápida reducción de la degradación del RNA y medidas más extremas para asegurar la adecuada liberación de núcleos y así probablemente permite una captura de más confianza de los perfiles transcripcionales que representa todas las celdas dentro de un determinado tejido. Esto, por supuesto, sólo daría una parte de la actividad transcripcional presente dentro de una célula dada, así dependiendo de lo que son objetivos experimentales de interés este enfoque puede o puede no ser apropiado.
Además de la caracterización completa de identidades celulares en un tejido dado, uno de los más valiosos análisis para conjuntos de datos scRNA-Seq es la evaluación de Estados transcripcionales intermedias en poblaciones celulares 'definido'. Estos estados intermedios pueden impartir conocimientos sobre las relaciones de linaje entre las células dentro de las poblaciones identificadas, que no era posible con a granel tradicional que acerca de RNA-Seq. Han desarrollado ahora varias herramientas bioinformáticas de scRNA-Seq para aclarar esto. Tales herramientas pueden evaluar los procesos involucrados, por ejemplo, las células cancerosas la transición a un estado oncogénico, metastásico, las células madre maduran en diversos destinos terminal o las células inmunes, transporte entre los Estados activados y quietos. Transcriptoma sutiles diferencias en las células también pueden ser indicativas de sesgos de linaje que, herramientas bioinformáticas desarrolladas recientemente como FateID, puede inferir47. Puesto que las diferencias entre las células de transición pueden ser difíciles determinar dadas las diferencias transcripcionales puede ser sutil, la secuencia más profunda puede ser necesario46. Afortunadamente, la cobertura de una biblioteca bajo secuenciada puede aumentar si está interesado en sondear el conjunto de datos más de nuevo ejecutando la biblioteca en otro célula de flujo.
Tomados en conjunto, este protocolo proporciona un flujo de trabajo fácil adaptación que permite a los usuarios de perfil transcripcionalmente cientos o miles de células individuales dentro de un experimento. La calidad final de un conjunto de datos de scRNA-Seq se basa en el aislamiento optimizada de la célula, citometría de flujo, generación de biblioteca de cDNA e interpretación de matrices de crudo gene-código de barras. Para ello, este protocolo proporciona una descripción comprensiva de todos los pasos claves que puede ser fácilmente modificado para permitir estudios de tipos de tejidos diversos.

Con el desarrollo del alto rendimiento unicelular tecnología1,2 y los avances en Bioinformática fácil de usar herramientas en la última década3, ha surgido un nuevo campo de análisis de expresión génica de alta resolución – secuencia de RNA unicelular (scRNA-Seq). El estudio de la expresión génica de células solo primero fue desarrollado para identificar heterogeneidad en las poblaciones de celda definida, como en las células madre o células cancerosas, o para identificar raras poblaciones de células4,5, que eran inalcanzables utilizando técnicas de secuenciación de RNA a granel tradicionales. Herramientas bioinformáticas han permitido la identificación de subpoblaciones novela (Seurat)2, visualización del orden de las células a lo largo de un psuedotime espacio (monóculo)6, definición de redes de señalización activadas dentro o entre poblaciones ( SCENIC)7, predicción de la Asamblea de solo las células en un espacio 3D artificial (Seurat y más)8. Con estos análisis nuevos y emocionantes para la comunidad científica, scRNA-Seq es rápido-convertirse en el nuevo enfoque estándar para análisis de expresión génica.
A pesar del gran potencial de scRNA-Seq, los conjuntos de habilidades técnicas necesarios para producir un conjunto de datos limpia y a interpretar con precisión los resultados pueden ser difícil para los recién llegados. Aquí, un protocolo básico, pero completo, a partir del aislamiento de las células de tejidos toda primarias a la visualización y presentación de datos para la publicación se presenta (figura 1). En primer lugar, el aislamiento de las células sanas se puede considerar un reto, como distintos tejidos varían en su grado de sensibilidad a la digestión enzimática y posterior disociación mecánica. Este protocolo proporciona una guía en estos pasos de aislamiento e identifica puntos importantes de control de calidad durante todo el proceso. En segundo lugar, puede ser confuso entender la compatibilidad y requerimientos entre la tecnología de la célula y secuenciación de próxima generación. Este protocolo proporciona las directrices para implantar una plataforma fácil de usar, basado en la gotita sola celda el código de barras y realizar la secuencia. Finalmente, la programación es un prerrequisito importante para el análisis de conjuntos de datos transcriptómicos unicelular. Este protocolo proporciona los recursos para empezar con el lenguaje de programación R y proporciona orientación sobre la aplicación de dos populares paquetes de R scRNA-Seq-específicos. Juntos, este protocolo puede guiar a los recién llegados en la realización de análisis scRNA-Seq para la obtención de resultados claramente interpretables. Este protocolo se puede ajustar a la mayoría de los tejidos en el ratón y lo importante es que podría modificarse para su uso con otros organismos, incluyendo el tejido humano. Se requerirá de ajustes según el tejido y el usuario.
Hay varias consideraciones a tener en cuenta siguiendo este protocolo; incluyendo 1) siguiendo todas las pautas de control de calidad en los pasos 1 y 2 del presente Protocolo se recomienda para asegurar una suspensión unicelular viable de todas las células dentro de la muestra de interés asegurando precisión total número recuento (resumido en figura 2 ). Una vez que esto se consigue, y si se siguen todas las condiciones optimizadas, las medidas de control de calidad pueden ser bajadas (para ahorrar tiempo - preservando calidad de RNA y la reducción de la célula pérdida). Confirmando el aislamiento exitoso de células alta viabilidad de los tejidos de interés es muy aguas abajo se recomienda antes de cualquier proceso. 2) ya que algunos tipos de células son más sensibles que otras al estrés, técnicas de disociación excesivas inadvertidamente pueden sesgar a la población, por lo tanto confundir análisis aguas abajo. Disociación suave sin corte celulares innecesarios y la digestión es fundamental para el logro de altos rendimientos celulares y una representación exacta de la composición tisular. Las fuerzas de corte se producen durante las etapas de trituración, FACS y resuspensión. 3) como con cualquier trabajo del RNA, es mejor introducir como poco Rnasa adicional en la muestra como sea posible durante la preparación. Esto le ayudará a mantener la alta calidad RNA. Utilice soluciones de inhibidor de la ribonucleasa con enjuague para limpiarlos herramientas y cualquier equipo que no es libre de Rnasa, pero evitar los productos tratada con DEPC. 4) realizar los preparativos lo antes posible. Esto ayudará a mantener la alta calidad RNA y reducir la muerte celular. Dependiendo de la longitud de la disección del tejido y el número de animales, tener en cuenta a partir de preparaciones de disecciones múltiples al mismo tiempo. 5) preparar las células en hielo cuando sea posible para mantener la alta calidad RNA, reducir la muerte celular y el retraso de la célula actividad transcripcional y señalización. Aunque helada es ideal para la mayoría de los tipos de la célula, algunos tipos de células (e.g., neutrófilos) se desempeñan mejor cuando se procesa a temperatura ambiente. 6) Evite productos de tratada con DEPC, EDTA, magnesio y calcio durante la preparación de la célula.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

El análisis de la expresión génica de células individuales a través de miles de células individuales dentro de un tejido o microambiente es una herramienta valiosa para identificar composición celular, discriminación de Estados funcionales y vías moleculares subyacentes tejido observado funciones y comportamiento de los animales. Sin embargo, el aislamiento de células intactas, sanas de tejidos mamíferos adultos para análisis molecular de la célula descendente posterior puede ser difícil. Este protocolo describe el proceso general y control de calidad verifica necesarios para obtener preparaciones celulares solo adultos de alta calidad desde el sistema nervioso o la piel activa análisis y secuenciación posterior imparcial unicelular RNA. También se ofrecen pautas para el análisis Bioinformático aguas abajo.

El repertorio de paquetes de código abierto diseñado para analizar conjuntos de datos scRNA-Seq ha disparado40 con la mayoría de estos uso de paquetes de lenguajes basados en R3. Aquí, se presentan resultados representativos usando dos de estos paquetes: evaluar agrupamiento no supervisado de basado en la expresión génica de células y ordenar a las células a lo largo de una trayectoria para resolver heterogeneidad de células y deconstruir biológico procesos.
Figura 4 ilustra el uso de Seurat para el procesamiento de los controles de calidad y análisis bioinformáticos posteriores. En primer lugar, filtración y eliminación de las células desviadas del análisis es esencial para el control de calidad. Esto se hizo utilizando la violín (figura 4a) y la dispersión de parcelas (Figura 4b) para visualizar el porcentaje de genes mitocondriales, número de genes (nGene) y número de UMI (nUMI) para identificar los dobletes de la célula y afloramientos. Cualquier célula con un número claro aislados de genes, UMI o el porcentaje de genes mitocondriales fue quitada usando la función FilterCells de Seurat. Puesto que Seurat utiliza componentes principales (PC) resultados de análisis a racimos de células, determinar estadísticamente significativa PC incluir es un paso crítico. Parcelas de codo (figura 4 c) fueron utilizados para la selección de PC, en que PC más allá de la meseta de la desviación estándar de la PC, eje se excluyeron. La resolución de la agrupación también fue manipulada demostrando que puede cambiarse el número de racimos, que van desde 0.4 (baja resolución a menos racimos de célula, figura 4 d) a 4 (de alta resolución a racimos de célula mayor, Figura 4e ). En baja resolución, es probable que cada grupo representa un tipo de celda definida, mientras que en alta resolución esto puede representar también subtipos o Estados transicionales de una población celular. En este caso, se utilizaba cluster baja resolución configuración para el análisis adicional de expresión heatmaps (usando la función DoHeatmap de Seurat) para identificar los genes más altamente expresados en un conjunto dado (figura 4f). En este caso, los genes más altamente expresados fueron identificados mediante la evaluación de expresión diferencial en un clúster determinado frente a todos los demás grupos combinados, demostrando que cada cluster estuvo representada únicamente por genes definidos. Además, se pueden visualizar genes candidatos individuales en parcelas de tSNE función de FeaturePlot de Seurat (figura 4 g). Esto permitió descifrar si hubo grupos que representan a los macrófagos. Usando el FeaturePlot, encontramos que ambos cluster 2 y 4 se expresan Cd68 - un marcador de pan-macrófago.
El paquete de monóculo se utilizó para corroborar racimos de célula identificados en Seurat y para la construcción de trayectorias de la célula, u ordenar pseudotemporal, recapitular procesos biológicos (figura 5). Ordenar pseudotemporal puede utilizarse para muestras donde perfiles de expresión unicelular se esperan que siga un curso de tiempo biológico. Las células pueden ordenarse a lo largo de un continuum pseudotemporal para resolver Estados intermedios, puntos de bifurcación de dos destinos alternativos de la célula e identifican firmas de genes subyacentes de adquisición de cada destino. En primer lugar, similar a la filtración de Seurat, células de mala calidad se retiraron tal que la distribución de mRNA a través de todas las células fue la log normal y cayó entre los límites superiores e inferiores identificadas en la figura 5a. Luego, mediante de monóculo newCellTypeHierarchy, las células fueron clasificadas y contaron utilizando genes marcadores de linaje conocido (figura 5b, 5C). Por ejemplo, las células alfa del receptor PDGF o fibroblastos específicos proteína 1 fueron asignadas a células tipo #1 para crear un criterio para la definición de fibroblastos. A continuación, esta población (célula tipo #1) se evaluó para descifrar trayectorias del fibroblasto. Para ello, se utilizó función diferencial de GeneTest de monóculo, que en comparación con las células que representan los Estados extremos dentro de la población y encontrar genes diferencial para ordenar las celdas restantes de la población (figura 5 d). Mediante la aplicación de métodos de aprendizaje múltiple (un tipo de reducción no lineal de la dimensionalidad) a través de todas las células, fue asignada una coordenada a lo largo de un camino pseudotemporal. Esta trayectoria se visualizó entonces por estado de la célula (figura 5e) y pseudotime (figura 5f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo. Pasos de la preparación de todo animal a analizar solo células RNA-Seq datasets a presentar final conjuntos de datos en un repositorio público. Perlas de gel en emulsión (GEMs) se refieren a cuentas con oligonucleótidos con código de barras que encapsulan miles de células individuales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> Figura 2: creación de suspensión unicelular viable del tejido nervioso. (a) Resumen de controles de calidad de la historieta. (b) células y desechos con las células todavía incorporan en escombros (flechas rojas). (c) células de escombros (flechas rojas). (d) célula de aislamiento por FACS. P0: fracción de escombros; P1: célula-como fracción; P3: exclusión de duplas; P4: fracción negativa de viabilidad tinte (Sytox Orange). (e) ningún control de tinte de viabilidad. (f) imagen de P0 fracción que representan restos aislados. (g) imagen de P4 fracción representar aislado células viables (flechas rojas). (b) .co (f) y (g) tenía tinte nuclear agrega 20 minutos antes de la proyección de imagen. Barras de escala: 80 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> Figura 3: secuenciación superficial predice el número de células recuperadas en 10 X muestras procesadas. un ejemplo (muestra 1.6) de csv generado MiSeq lista de códigos de barras de la célula y su correspondiente UMI cuenta según lecturas asignadas con confianza. (b) código de barras fila para 1.6 muestra muestra una gota significativa en el conteo de la UMI en función de códigos de barras de la célula. Las líneas sólidas y punteadas representan el límite entre las células y fondo según lo determinado por inspección visual. (c) códigos de barras célula observan usando el Cell Ranger tubería post-HiSeq revela secuencia superficial con precisión aproximada el número de células por ejemplo 1.6. (d) un ejemplo de una configuración de celda de flujo basado en la secuencia baja deriva las estimaciones de la célula. Para muestra 1.6, desde secuencias someras predijeron 3480 células, 1,17 carriles fueron asignados para garantizar > 100.000 lecturas por cobertura de la secuencia de células en HiSeq. Nota: Todos los carriles se deben agregar a 100%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> Figura 4: control de calidad y bioinformática de unicelular RNA-Seq dataset mediante paquete Seurat R. (a) parcelas de métricas de control de calidad que incluyen el número de genes, número de identificadores únicos de moleculares (UMIs) y el porcentaje de las transcripciones con el genoma mitocondrial. (b) gen muestra parcelas detectar células con niveles desviadas de las transcripciones mitochondrial y UMIs. (c) parcela de codo de la muestra utilizado para la determinación especial de PC estadísticamente significativa. Las líneas discontinuas y discontinua de punto representan el límite donde un "codo" de claro se hace evidente en el gráfico. Dimensiones del PC antes de este codo se incluyen en análisis posteriores. (d, e) Racimos de célula basada en gráfico visualizados en dos resoluciones diferentes en un espacio de baja dimensión con una parcela de tSNE. (f) mejores genes marcadores (amarillos) para cada cluster visualizados en un mapa de calor de expresión usando la función DoHeatmap de Seurat. g visualizar la expresión de marcadores de, por ejemplo, Cd68 gen representando macrófagos (morados) con función de FeaturePlot de Seurat. Esto sugiere que cluster 2 y 4 (panel d) de este conjunto de datos representa los macrófagos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> Figura 5: célula de categorización y ordenamiento a lo largo de la trayectoria de peudotemporal usan monóculo herramientas. (a) inspeccionar la distribución de mRNA (deducido de la cuenta UMI) a través de todas las células en una muestra. Sólo las células con el mRNA entre 0 - ~ 20.000 fueron utilizados para el análisis de aguas abajo. (b, c) Asignar y contando los tipos de la célula basados en marcadores de la célula de linaje conocido. Por ejemplo, las células alfa del receptor PDGF o fibroblastos específicos proteína 1 fueron asignadas a células tipo #1 que representan fibroblastos de pan usando la función newCellTypeHierarchy de monóculo. Número de diferentes tipos de células se puede visualizar como un gráfico de sectores (b) y como una tabla (c). (d) con célula tipo #1 (fibroblastos), por ejemplo, los genes utilizados para ordenar las células pueden ser visualizadas usando un terreno de dispersión que demuestra el dispersión génica vs expresión media. La curva roja muestra el atajo de genes utilizados para ordenar calculado por el modelo de media varianza usando la función estimateDispersions de monóculo. Genes que cumplen con este atajo se utilizaron para ordenar pseudotime aguas abajo. (e, f) Visualización de trayectorias de la célula en un reducido espacio bidimensional de color "Estado" de la celda (e) y monóculo asignado "Pseudotime" (f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Este protocolo describe el proceso general y control de calidad controles necesarios para la preparación de células sanas de mamíferas adultos solo para preparaciones de RNA-Seq de celulares solo basada en gota, alto rendimiento. Secuenciación parámetros, lea alineación y análisis Bioinformático unicelular aguas abajo también se proporcionan.

Transcriptómica de célula basada en código de barras gotita de tejidos mamíferos adultos

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como la comprensión de los cambios en la expresión génica en miles de células individuales después de una lesión o una enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite diseccionar transcriptomas de células individuales dentro de un tejido complejo, y apreciar mejor la dinámica funcional dentro de una población determinada. La ventaja de nuestro protocolo es que proporciona métodos integrales, desde el aislamiento de células individuales en los tejidos primarios, hasta el análisis y visualización de este conjunto de datos.Aunque este método comienza a partir de suspensiones unicelulares de la piel y el nervio, los métodos de secuenciación que describimos se pueden aplicar para estudiar cualquier tejido de mamíferos. Demostrando este procedimiento serán Elodie Labit, y Wisoo Shin, dos aprendices de mi laboratorio. Para empezar, disecciona el nervio ciático de un ratón eutanasiado cortando primero la piel lejos de la región posterior de la parte posterior del ratón.Use una cuchilla de bisturí estéril para hacer una incisión a lo largo de la longitud del muslo. Luego usa fórceps finos y tijeras para exponer y quitar el nervio ciático. Para diseccionar la piel dorsal de la espalda, utilice fórceps finos y tijeras para hacer incisiones de hombro a hombro, a través de la grupa y por la espalda.Lave los tejidos dos veces con HBSS helado. Bajo un microscopio diseccionable, elimine el tejido conectivo no deseado, los depósitos de grasa o los desechos. Sólo para la piel, cortar la piel en rodajas finas, utilizando una hoja de bisturí estéril.Para obtener la dermis de la piel, flote la piel en rodajas dispase, en HBSS en un plato de 10 centímetros, durante 30 a 40 minutos a 37 grados centígrados. Utilice fórceps finos para pelar y separar la epidermis de la dermis, y luego deseche la epidermis. Luego, para la piel y los nervios, usa un par de cuchillas de bisturí esterilizado para picar cada muestra en trozos de uno a dos milímetros.Coloque los trozos de tejido en una enzima recién descongelada, dos gramos por mililitro de colagenasa fría y cuatro en un tubo cónico de 15 mililitros. Incubar cada muestra en la enzima en un baño celsius de 37 grados durante 30 minutos con un suave temblor cada 10 minutos. A los 30 minutos, utilice un pipetter P1000 para triturar el tejido de 20 a 30 veces, y volver al baño de agua.Repita la trituración cada 30 minutos hasta que la solución parezca turbia y los trozos de tejido se disocucicen en gran medida. Para la piel solamente, en la última hora de incubación, añadir un miligramo por mililitro DNAse a la muestra de piel. Dado que algunos tipos de células son más sensibles que otros al estrés mecánico, las técnicas de disociación excesiva pueden sesgar a su población.La disociación general es fundamental para lograr altos rendimientos celulares y una representación precisa de la composición del tejido. Después de eso, utilice un filtro de 40 micrómetros en la parte superior del tubo cónico de 50 mililitros para filtrar cada muestra de tejido dos veces. Enjuague el filtro con un uno por ciento de BSA/HBSS.Después de centrifugar las muestras como se describe en el manuscrito, vuelva a suspender el pellet celular en HBSS, que contiene un uno por ciento de BSA, utilizando una punta de diámetro ancho, y colocar en hielo. La adición de tinte de viabilidad le ayudará a optimizar su preparación. Usted debe apuntar a por lo menos 80 por ciento células viables.Una vez optimizado, este y otros pasos de control de calidad se pueden omitir con el fin de acelerar el proceso de disociación, que preservará mejor la calidad del ARN y reducirá la pérdida de células. Para aislar las células viables y sanas utilizando FACS, primero prepare tubos de fondo estrecho de 15 mililitros con ocho mililitros de BSA/HBSS al frío helado al uno por ciento para las colecciones de muestras. Para asegurarse de que la interfaz entre la superficie del líquido y el interior del tubo está húmeda, y para evitar la tensión estática y superficial, invierta los tubos antes de las colecciones.Inmediatamente después de la clasificación celular FACS, una vez que las células se recogen en un tubo de 15 mililitros, utilice un mililitro de un porcentaje de BSA/HBSS para lavar y empujar todas las células hacia abajo desde la superficie lateral del tubo. A continuación, centrifugar cada muestra a 260 g durante ocho minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en un porcentaje de BSA/HBSS, y agregue 33,8 microlitros a un tubo, y mantenga ese tubo en hielo.Este paso está diseñado para realizarse utilizando reactivos obtenidos de un kit estandarizado. Todos los pasos demostrados deben realizarse siguiendo las instrucciones del fabricante. Para prepararse para la generación de GEM, coloque un chip en el soporte de la viruta, prepare una mezcla maestra de celda sobre hielo, de acuerdo con el protocolo del fabricante.Añadir 56,2 microlitros de la mezcla maestra a un tubo que contenga 33,8 microlitros de auto suspensión. Para preparar el chip, primero al 50 por ciento de glicerol a los pozos que no se utilizarán. A continuación, agregue 90 microlitros de la mezcla maestra de la célula a uno bien, 40 microlitros de cuentas de gel a dos bien, y 270 microlitros de aceite de partición a pozo tres.Cubra el chip con una junta. Para cargar el chip y ejecutarlo en un controlador de una sola celda, primero expulse la bandeja. Coloque el chip en la bandeja.Retirar la bandeja y pulsar play. Después de la ejecución completa, recoja 100 microlitros de la muestra y colóquelos en un tubo pcR. Coloque los tubos PCR en una máquina PCR preestablecida y ejecútese de acuerdo con el kit.Después de la ejecución, los GEM incluirán cDNA con código de barras de longitud completa, de ARNm poliadenilado. Coloque los tubos a menos 20 grados centígrados durante la noche. Continúe con la construcción, secuenciación, alineación y análisis de la biblioteca.Una vez que las muestras se secuencian y alinean como se describe en el manuscrito, deposite los datos en un repositorio público, como GEO de NCBI. Para ello, regístrese en la cuenta del remitente. En primer lugar, complete el envío GEO descargando la hoja de metadatos.Asegúrese de incluir solo una hoja de metadatos por envío de proyecto. Coloque la hoja de cálculo en el directorio. En segundo lugar, agregue el archivo de datos sin procesar generado a partir del script de recuento de rangos de celdas para todas las bibliotecas en el directorio.La tercera carpeta se procesan archivos de datos. Coloque los archivos de datos procesados generados a partir del script de recuento de ranger de celdas para todas las bibliotecas en el directorio. Utilice las credenciales del servidor FTP del remitente GEO para transferir el directorio que contiene los tres componentes.Después de ejecutar Cell Ranger, las matrices de códigos de barras genéticos listos para el análisis se pueden procesar más allá utilizando bioinformática avanzada. En primer lugar, se realizaron comprobaciones de cantidad de preprocesamiento utilizando el paquete Seurat R, que generó violín y parcelas de dispersión para visualizar el número de genes, el número de identificadores moleculares únicos y el porcentaje de genes mitocondriales para identificar dobletes celulares y valores atípicos. Para la selección de componentes principales, o PC, se utilizaron gráficas de codo, en las que se excluyeron los PC más allá de la meseta de la desviación estándar del eje de PC.La resolución de la agrupación en clústeres también fue manipulada. La baja resolución dio lugar a menos clústeres de celdas, y cada clúster probablemente representaba un tipo de celda definido. La alta resolución dio lugar a una mayor probabilidad celular, que representaba subestilos, o estados de transición, de una población celular.La configuración del clúster de baja resolución se utilizó para un análisis posterior de los mapas de calor de expresión para identificar los genes más expresados en un clúster determinado. Los genes candidatos individuales se visualizaron en las gráficas tSNE, utilizando la función de trazado de características de Seurat, que permitían descifrar, si había racimos que representaban, por ejemplo, macrófagos. El clúster dos y cuatro expresaron CD68, un marcador pan-macrophage.Otros paquetes también proporcionan herramientas para el control de calidad, por ejemplo, Monocle, un paquete R utilizado para construir trayectorias de celdas, elimina celdas de mala calidad y garantiza que la distribución del ARNm entre todas las celdas sea normal y esté comprendida entre los límites superior e inferior. Las células individuales fueron clasificadas y contadas, utilizando genes marcadores de linaje conocidos, y las células que expresaban marcadores de interés se asignaban al tipo de celda número uno. Se determinó que el tipo de célula número uno eran fibroblastos.Esta población fue evaluada para construir la trayectoria de desarrollo de los fibroblastos. Después de este procedimiento, se deben realizar otros métodos como la PCR cuantitativa, la hibridación in situ, una química inmunizante para validar la exactitud de los resultados de la expresión génica. La secuenciación de ARNm de una sola célula ha allanado el camino para que los investigadores en muchos campos diferentes exploren la heterogeneidad de célula a célula, e identifiquen la dinámica funcional dentro de diferentes tejidos durante la homeostasis, y cómo estos pueden cambiar después de la lesión o en el desarrollo de la enfermedad.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

La microinyección de ADN en intranucleares disociada neuronas de mamíferos adultos

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Investigación

Biología

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Perfiles de transcripción de los organismos unicelulares de los cardiomiocitos de ratón adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Crecimiento anaerobio y mantenimiento de líneas de células de mamífero

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 enriquece el rendimiento de los melanocitos humanos de los tejidos adultos de la piel

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Ensayo único de cultivo de Myofiber para la evaluación de la funcionalidad de las células madre musculares adultas ex vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...