Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Vi erkänner stödpersonal vid anläggningen i UCDNA tjänster, liksom djur vård anläggning Personalen på University of Calgary. Vi tackar Matt Workentine för uppbackningen bioinformatik och Jens Durruthy för hans teknisk support. Detta arbete var finansieras av ett CIHR bidrag (R.M. och J.B.), en CIHR nya Investigator Award till J.B. och en Alberta barns hälsa forskning Institutet Fellowship (JS).

<ol>
	<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+for+cellular+variation.">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation.</a> Nature. 510, 363-369 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161, 1202-1214 (2015).</li><li>Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+single-cell+RNA-seq+analysis+landscape+with+the+scRNA-tools+database.">Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database.</a> bioRxiv:206573. , (2018).</li><li>Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+defines+heterogeneity+and+transcriptional+dynamics+in+the+adult+neural+stem+cell+lineage.">Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage.</a> Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).</li><li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+Reveals+a+Population+of+Dormant+Neural+Stem+Cells+that+Become+Activated+upon+Brain+Injury.">Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Schwann+Cells+from+Adult+Human+Skin+and+Nerve.">Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Agilent Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135">https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135</a> (2018)</li><li>Kolodziejczyk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+RNA-Sequencing+of+Pluripotent+States+Unlocks+Modular+Transcriptional+Variation.">Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation.</a> Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex.">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).</li><li>. Sequencing Requirements for Single Cell 3' Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3</a> (2018)</li><li>. Introduction to R Available from: <a target="_blank" href="https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r">https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Creating a Reference Package with cellranger mkref Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references</a> (2018)</li><li>. System Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements</a> (2018)</li><li>. Software Downloads Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</a> (2018)</li><li>. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization</a> (2018)</li><li>. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial</a> (2018)</li><li>. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data Available from: <a target="_blank" href="https://www.scrna-tools.org/">https://www.scrna-tools.org/</a> (2018)</li><li>. Downloading conda Available from: <a target="_blank" href="https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html">https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html</a> (2018)</li><li>. r / packages / r 3.5.1 Available from: <a target="_blank" href="https://anaconda.org/r/r">https://anaconda.org/r/r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. Seurat - Guided Clustering Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html">https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>Github. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).</li><li>. GenBank Submission Portal Wizards Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/</a> (2018)</li><li>. Submitting data Available from: <a target="_blank" href="https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/">https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/</a> (2018)</li><li>Shah, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+and+Fate+Mapping+of+Ependymal+Cells+Reveals+an+Absence+of+Neural+Stem+Cell+Function.">Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function.</a> Cell. 173, 1045-1057 (2018).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11, 1 (2013).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144, 3625-3632 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96, 313-329 (2017).</li><li>Zeigenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+states+versus+single-cell+atlases+-+two+classes+of+heterogeneity+that+differ+in+meaning+and+method.">Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method.</a> Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).</li><li>Herman, J. S., Sagar, D., Gr&#252;n, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FateID+infers+cell+fate+bias+in+multipotent+progenitors+from+single-cell+RNA-seq+data.">FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data.</a> Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).</li></ol>

Inga upplysningar

Detta protokoll visar hur den lämplig preparering av enstaka celler kan avslöja tusentals enstaka celler transkriptionell heterogenitet och diskriminera funktionellt påstår eller unika cellulära identiteter i en vävnad. Protokollet kräver inte fluorescerande reporter proteiner eller transgena verktyg och kan användas till isolering av enstaka celler från olika vävnader av intresse även från människor; att hålla i åtanke varje vävnad är unik och detta protokoll kommer att kräva en viss justering/ändring.
De mångsidiga och högdynamiska transkriptionell program inom celler har betonat värdet av encelliga genomik. Bortsett från isolera högkvalitativa RNA, är ett avgörande prov förberedelse steg nödvändigt för hög kvalitet datamängder att säkerställa att celler frigörs helt från vävnad och att celler är frisk och intakt. Detta är relativt rakt fram för att samla celler som lätt släppt, såsom cirkulerande celler eller vävnader celler behålls där löst, såsom i lymfvävnad. Men detta kan vara utmanande för andra vuxna vävnader, på grund av det välutvecklade cellulära arkitektur som spänner över stort distanserar, omgivande extracellulära matrix och de ofta-styv cytoskeletal proteinerna som är inblandade i att upprätthålla cellstruktur. Även med lämpliga dissociation tekniker för den fullständiga versionen av celler finns det potential att den rigorösa och ofta långdragna bearbetning som krävs skulle ändra mRNA kvalitet och cell integritet. Dessutom, påverka de höga temperaturer som används för enzym-assisted dissociation också transkriptionell signaturer29,30. Syftet med protokollet är att presentera kvalitetskontroll kontroller, använda vävnader såsom myeliniserade vuxen nerven och extracellulära matrix-rika vuxen huden, för att visa hur optimering kan bidra till att övervinna dessa hinder.
En viktig fråga vid utformningen av alla scRNA-Seq experiment är valet av sekvensering djup. Sekvensering kan vara mycket multiplexerade och läsa djup kan variera från att vara mycket låg med Drop-Seq2 till upp till 5 miljoner läsningar per cell14 metoden en fullängds RNA-Seq såsom Smart-följande punkter De flesta scRNA-Seq experiment kan upptäcka måttlig till hög uttryck avskrifter med sekvensering så låg som 10 000 läsningar/cell, vilket är normalt tillräcklig för cell typ klassificering41,42. Grunt sekvensering djup är av värde att spara på sekvensering kostnader när du försöker upptäcka sällsynta cellpopulationer över komplexa vävnader där tusentals celler kan behövas att tryggt tillskriva sällsynta populationer. Men grunt djup sekvensering är inte lämplig när detaljerad information om genuttryck och processer associerade med subtila transkriptionell signaturer krävs. För närvarande, uppskattas det att en stor majoritet av gener i en cell upptäcks med 500.000 läsningar/cell, men detta kan variera beroende på protokollet och vävnad typ43,44. Fullängds avskrift sekvensering kringgår behovet av montering och kan därför upptäcka roman eller sällsynta skarv varianter, begränsa sekvensering kostnader ofta skalning sådana tillvägagångssätt för att undersöka tusentals celler bestående av ett komplex vävnad system. Däremot taggade 3' encelliga bibliotek såsom de som beskrivs i detta protokoll vanligtvis har lägre komplexitet och kräver grundare sekvensering. Det är viktigt att notera att bibliotek som genereras med hjälp av beskrivna protokollet kan sekvenseras på en av fem stöds sequencers: 1) NovaSeq, (2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 snabb kör och hög effekt, 4) NextSeq 500/550 och 5) MiSeq.
En alternativ strategi för enstaka cell RNA-Seq, som minskar behovet av delikat vävnads- och hantering ännu bevarar några av fördelarna med enstaka cell RNA-Seq, är analysen av RNA från enda atomkärnor45. Detta tillvägagångssätt tillåter snabbare bearbetning minska RNA nedbrytning, och mer extrema åtgärder för att säkerställa adekvat frisättning av kärnor, och således sannolikt möjliggör en mer självsäker fånga av transkriptionell profiler som representerar alla celler i en viss vävnad. Detta skulle, naturligtvis, endast ge en del av aktiviteten transkriptionell inom en given cell, således beroende på vad experimentella mål är av intresse detta tillvägagångssätt kan eller inte kan vara lämpliga.
Förutom fullständig karakterisering av cellulära identiteter inom en viss vävnad är en av de mest värdefulla analyserna för scRNA-Seq datamängder bedömningen av transkriptionell mellanlägen över 'definierade' cellpopulationer. Dessa förmedlande stater kan ge insikter om härstamning relationerna mellan celler inom identifierade populationer, vilket inte var möjligt med traditionella bulk RNA-Seq närmar sig. Flera scRNA-Seq bioinformatiska verktyg har nu utvecklats för att belysa detta. Sådana verktyg kan bedöma de processer som är involverade i, till exempel cancerceller som övergår till en onkogen/metastaserad stat, stamceller mognar till olika terminal öden eller immunceller skytteltrafik mellan aktivt och quiescent. Subtila transkriptom skillnader i celler kan också vara vägledande av härstamning fördomar att nyligen utvecklade bioinformatiska verktyg som FateID, kan härleda47. Eftersom skillnaderna mellan övergår celler kan vara svårt att få klarhet i tanke transkriptionell skillnaderna kan vara subtil, djupare sekvensering kan vara nödvändiga46. Lyckligtvis, täckning av ett grunt sekvenserade bibliotek kan ökas om intresserad sondera datamängden ytterligare genom att åter köra biblioteket på en annan flöde cell.
Detta protokoll tillsammans och ger en lätt-till-adapt arbetsflöde som möjliggör för användare att transcriptionally profilera hundratals till tusentals singel-celler inom ett experiment. Den slutliga kvaliteten på en scRNA-Seq datamängd är beroende av optimerad cell isolering, flödescytometri, cDNA bibliotek generation och tolkning av rå gen-barcode matriser. I detta syfte ger detta protokoll en omfattande överblick över alla viktiga steg som enkelt kan ändras för att möjliggöra studier av olika vävnadstyper.

Med utvecklingen av hög genomströmning enda cell teknik1,2 och framsteg inom användarvänliga bioinformatiska verktyg över de senaste decenniet3, har ett nytt fält av högupplösta gen uttryck analys uppstått – encelliga RNA-sekvensering (scRNA-Seq). Studien av enstaka cell genuttryck utvecklades först att identifiera heterogenitet inom definierade cellpopulationer, såsom i stamceller eller cancerceller, eller för att identifiera sällsynta populationer av celler4,5, som var ouppnåeliga använder traditionell bulk RNA-sekvensering tekniker. Bioinformatiska verktyg har aktiverat identifiering av romanen subpopulationer (Seurat)2, visualisering storleksordningen celler längs ett psuedotime utrymme (Monocle)6, definitionen av aktiva signalering nätverk inom eller mellan populationer ( NATURSKÖNA)7, prediktion av montering av singel-celler i en konstgjord 3D-rymden (Seurat, och mer)8. Med dessa nya och spännande analyser finns tillgängliga för det vetenskapliga samfundet, scRNA-Seq är snabbt på att bli den nya standarda metoden för gen uttryck analys.
Trots den stora potentialen hos scRNA-Seq, kan tekniska skillsets krävs för att producera en ren datamängd och korrekt tolka resultaten vara utmanande att nykomlingar. Här, ett grundläggande, men omfattande protokoll, start från isoleringen av enstaka celler från hela primära vävnader till visualisering och presentation av data för publikationen presenteras (figur 1). Först, isolering av friska enstaka celler kan anses vara utmanande, eftersom olika vävnader varierar i deras grad av känslighet för enzymatisk nedbrytning och efterföljande mekaniska dissociation. Detta protokoll ger vägledning i stegen isolering och identifierar viktiga kvalitetskontroll kontrollpunkter i hela processen. Andra, förstå kompatibilitet och krav mellan singelcellteknologi och nästa generations sekvensering kan vara förvirrande. Detta protokoll ger riktlinjer för att genomföra en användarvänlig, droplet-baserade encelliga streckkodning plattform och utföra sekvensering. Slutligen, datorprogrammering är en viktig förutsättning för att analysera encelliga transcriptomic datamängder. Detta protokoll innehåller resurser för att komma igång med programmeringsspråket R och ger vägledning om genomföra två populära scRNA-Seq-specifika R paket. Tillsammans, kan detta protokoll vägleda nykomlingar i utföra scRNA-Seq analys för att få tydliga och tolkningsbara resultat. Detta protokoll kan anpassas till de flesta vävnader i musen, och allt kan ändras för användning med andra organismer, inklusive mänsklig vävnad. Justeringar beroende på vävnad och användaren kommer att krävas.
Det finns flera faktorer att ha i åtanke när du följer detta protokoll; inklusive, 1) efter alla kvalitetskontroll riktlinjer i steg 1 och 2 i detta protokoll rekommenderas att garantera en livskraftig enda cellsuspension av alla celler i provet av intresse samtidigt som man säkerställer korrekta totala antalet blodkroppar (sammanfattas i figur 2 ). När detta uppnås, och om alla optimerade villkor följs, kvalitetskontroll stegen kan släppas (Spara tid - bevara RNA kvalitet och minska celler förlust). Bekräftar framgångsrika isolering av hög bärkraft enstaka celler från vävnaden av intresse är starkt rekommendera innan något nedströms bearbetning. (2) eftersom vissa celltyper är mer känsliga än andra för att betona, kan Överdriven dissociation tekniker oavsiktligt bias befolkningen, därför confounding nedströms analys. Mild dissociation utan onödiga cellulära klippning och matsmältningen är kritiska för att uppnå hög cellulära avkastning och en korrekt representation av vävnadssammansättning. Skeva styrkor inträffa under sönderdelning, FACS och resuspension stegen. (3) som med varje RNA-arbete, är det bäst att presentera som lite extra RNase i provet som möjligt under beredning. Detta kommer att bidra till att upprätthålla hög kvalitet RNA. Använda ribonunkleas hämmare lösningar med sköljning till rena verktyg och utrustning som inte RNase-fri men undvika DEPC-behandlad produkter. (4) utför förberedelserna så snabbt som möjligt. Detta hjälper upprätthålla hög kvalitet RNA och minska celldöd. Beroende på vilken vävnad dissektion längd och djurens antal, överväga att starta flera dissektioner/preparat samtidigt. (5) Förbered celler på is när möjligt att upprätthålla hög kvalitet RNA, minska celldöd och långsam cell signalering och transkriptionell aktivitet. Om än, iskall bearbetning är idealisk för de flesta celltyper, presterar vissa celltyper (t.ex., neutrofiler) bättre när bearbetas vid rumstemperatur. (6) undvika kalcium, magnesium, EDTA och DEPC-behandlad produkter under cell beredning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

Analys av enstaka cell genuttryck över tusentals enskilda celler i en vävnad eller närmiljön är ett värdefullt verktyg för att identifiera cell sammansättning, diskriminering av funktionellt påstår och molekylära vägar bakomliggande observerade vävnad funktioner och djurs beteenden. Isolering av intakt, friska enstaka celler från vuxna däggdjur vävnader för efterföljande nedströms enda cell molekylär analys kan dock vara utmanande. Det här protokollet beskriver de allmänna processerna och kvalitetskontroll kontroller behövs för att få hög kvalitet vuxen enda cell preparat från nervsystemet eller hud som aktiverat efterföljande opartisk enda cell RNA-sekvensering och analys. Riktlinjer för nedströms bioinformatiska analyser finns också.

Repertoar av open source-paket utformade för att analysera scRNA-Seq datamängder har ökat dramatiskt40 med majoriteten av dessa paket använder R-baserade språk3. Här, representativa resultat med hjälp av två av dessa paket presenteras: bedömning av oövervakade gruppering av enstaka celler baserat på genuttryck, och beställa enstaka celler längs en bana för att lösa cell heterogenitet och dekonstruera biologiska processer.
Figur 4 illustrerar användningen av Seurat för förbearbetning kvalitetskontroller och nedströms bioinformatik analys. Först, filtrering och borttagning av avvikande celler från analys är viktigt för kvalitet kontroll. Detta gjordes med hjälp av fiol (figur 4a) och scatter tomter (figur 4b) att visualisera procentandelen av mitochondrial gener, antal gener (nGene) och antalet UMI (nUMI) att identifiera cell dubletter och extremvärden. En cell med ett tydligt avvikande antal gener, UMI eller andelen mitochondrial gener togs bort funktionen Seurat's FilterCells. Eftersom Seurat använder huvudkomponenten (PC) analys noter till kluster celler, att fastställa statistiskt signifikant datorer att inkludera är ett viktigt steg. Armbågen tomter (figur 4 c) användes för val av PC, i vilka datorer utöver platån av 'standardavvikelsen för PC' axel var uteslutna. Upplösningen av klustring var också manipulerade visar att antalet kluster kan ändras, alltifrån 0,4 (lågupplöst leder till färre cell kluster, figur 4 d) till 4 (högupplöst leder till högre cell kluster, figur 4e ). Med låg upplösning är det troligt att varje kluster utgör en definierad celltyp, med hög upplösning kan detta också utgör undertyper eller de övergångsbestämmelser cell invånare. I detta fall användes lågupplösta klusterinställningar för att ytterligare analysera uttryck heatmaps (funktionen Seurat's DoHeatmap) för att identifiera de mest högt uttryckt generna i ett visst kluster (figur 4f). I detta fall identifierades de mest högt uttryckt generna genom att bedöma differentiell uttryck i ett visst kluster jämfört med alla andra kluster som sammantaget visar att varje kluster unikt företräddes av definierade gener. Dessutom kan enskilda kandidatgener visualiseras på tSNE tomter Seurat's FeaturePlot funktionen (figur 4 g). Detta möjliggjorde för att dechiffrera om det fanns kluster som representerade makrofager. Med FeaturePlot upptäckte vi att både kluster 2 och 4 uttryckte Cd68 - pan-makrofag markör.
Monocle paketet användes för bekräftande cell kluster identifierades i Seurat och bygga cellen banor, eller beställning av pseudotemporal, för att sammanfatta biologiska processer (figur 5). Beställning av pseudotemporal kan användas för prover där encelliga uttrycket profiler förväntas följa en biologisk tidsförlopp. Celler kan beställas längs en pseudotemporal kontinuum att lösa mellanlägen, bifurkation pekar av två alternativa cell öden, och identifiera genen signaturer underliggande förvärv av varje öde. För det första, liknar Seurats filtrering, dåliga celler togs bort så att fördelningen av mRNA över alla celler var log normal och föll mellan övre och nedre gränser som anges i figur 5a. Sedan använda Monocle's newCellTypeHierarchy funktion, enstaka celler klassificerades och räknade med känd härstamning markörgener (Figur 5b, 5 c). Till exempel tilldelades celler som uttrycker PDGF receptor alfa eller Fibroblast specifika Protein 1 till Cell typ #1 att skapa ett villkor för att definiera fibroblaster. Därefter bedömdes denna population (Cell typ nr 1) dechiffrera fibroblast banor. Detta gör utnyttjades Monocles differentierad GeneTest funktion, som jämförde celler som representerar de extrema staterna inom befolkningen och fann differentiell gener för beställning resterande celler i befolkningen (figur 5 d). Genom att tillämpa grenrör inlärningsmetoder (en typ av icke-linjära dimensionalitet minskning) över alla celler, tilldelades en koordinat längs en pseudotemporal bana. Denna bana var sedan visualiseras av cellen (figur 5e) och pseudotime (figur 5f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> Figur 1: flödesschema. Steg från hela djur förberedelse till analysera enstaka cell RNA-Seq datamängder till att skicka slutliga datamängder till en offentligt tillgänglig databas. Gel pärlor i Emulsion (ädelstenar) avser pärlor med barcoded oligonukleotider som kapsla in tusentals enstaka celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> Figur 2: skapa livskraftiga enda cellsuspension från nervvävnad. (a) tecknad översikt av kvalitetskontroller. (b) celler och skräp med celler fortfarande införlivas i skräp (röda pilar). (c) celler frigörs från skräp (röda pilar). (d) cell isolering av FACS. P0: skräp bråkdel; P1: cell-liknande bråkdel; P3: uteslutning av duplets; P4: livskraft färgämne (Sytox Orange) negativa fraktion. (e) ingen bärkraft dye kontroll. (f) bilden av P0 bråkdel som representerar isolerade skräp. (g) bilden av P4 bråkdel som representerar isolerade viabla celler (röda pilar). (b) (c) (f) och (g) hade kärnvapen dye tillkommer 20 minuter innan imaging. Skala barer: 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> Figur 3: grunt sekvensering förutspår antalet återvunna celler i 10 X bearbetade prover. (a) ett exempel (prov 1,6) MiSeq-genererade CSV notering cell streckkoder och dess motsvarande UMI räknas som bestäms av tryggt mappade läsningar. (b) streckkod rang tomt för provet 1.6 visar en betydande nedgång i UMI räknas som en funktion av cell streckkoder. De streckad och fasta linjerna representerar cutoff mellan celler och bakgrund som bestäms av okulärbesiktning. (c) cell streckkoder observerats med hjälp av Cell Ranger pipeline inlägg-HiSeq avslöjar grunt sekvensering approximeras exakt antalet celler för provet 1.6. (d) ett exempel på en flöde cell set-up baserat på grunt sekvensering härrör cell uppskattningar. För prov 1.6, eftersom grunt sekvensering förutspådde 3480 celler, 1,17 körfält tilldelades till säkerställa > 100 000 läsningar per cell sekvensering täckning i HiSeq. Obs: Alla körfält måste lägga till 100%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> Figur 4: kvalitetskontroll och bioinformatik av encelliga RNA-Seq datamängd använder Seurat R package. (a) tomter kvalitetskontroll mätvärden som inkluderar antal gener, antal unika molekylära identifierare (UMIs) och andelen avskrifter mappning till mitokondriella genomet. (b) prov gen tomter upptäcka celler med avvikande nivåer av mitokondriell avskrifter och UMIs. (c) prov armbåge tomt används för ad hoc-bestämning av statistiskt signifikant datorer. De streckad och dot-streckad linjerna representerar cutoff där en tydlig ”armbågar” blir uppenbart i grafen. PC dimensioner innan denna armbåge ingår i efterföljande analys. (d, e) Graf-baserade cell kluster visualiseras på två olika upplösningar i en låg-dimensionell rymd som använder en tSNE tomt. (f) övre markörgener (gul) för varje kluster visualiseras på ett uttryck heatmap Seurat's DoHeatmap funktionen. (g) visualisera markör uttryck för, till exempel Cd68 gen som representerar makrofager (lila) använder Seurat's FeaturePlot funktion. Detta tyder på att kluster 2 och 4 (i panelen d) i denna dataset representerar makrofager. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> Figur 5: Cell kategorisering och beställa längs peudotemporal bana med monokel toolkit. (a) inspekterar fördelningen av mRNA (innebäras från UMI räkningar) över alla celler i ett prov. Endast celler med mRNA mellan 0 - ~ 20.000 användes för efterföljande analys. (b, c) Tilldela och räknar celltyper baserat på kända härstamning cell markörer. Till exempel celler som uttrycker PDGF receptor alfa eller Fibroblast specifika Protein 1 tilldelades till Cell typ nr 1 som representerar pan-fibroblaster Monocle's newCellTypeHierarchy funktionen. Antal olika celltyper kan visualiseras som ett cirkeldiagram (b) och som en tabell (c). (d) använda Cell typ nr 1 (fibroblaster) som ett exempel, de gener som används för beställning av celler kan visualiseras med hjälp av ett spridningsdiagram som visar gen dispersion vs. genomsnittliga uttryck. Den röda kurvan visar cutoff för gener används för beställning beräknas av mean – variance modellen använder Monocle's estimateDispersions funktion. Gener som uppfyller denna cutoff användes för nedströms pseudotime beställning. (e, f) Visualisering av cell banor i en reducerad två-dimensionell rymd färgade genom cellens ”staten” (e) och Monocle-tilldelad ”Pseudotime” (f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Det här protokollet beskriver de allmänna processerna och kvalitetskontroll kontroller som krävs för att förbereda friska vuxna enda däggdjursceller droplet-baserade, hög genomströmning enda cell RNA-Seq preparat. Sekvensering parametrar, finns Läs justering och nedströms encelliga bioinformatiska analyser också.

Droplet streckkodning-baserade enda Cell transkriptomik av vuxna däggdjur vävnader

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor inom mikrobiologi, såsom att förstå förändringar genuttryck över tusentals enskilda celler efter en skada eller en sjukdom. Den största fördelen med denna teknik är att det tillåter oss att dissekera transkriptomer av enskilda celler inom en komplex vävnad, och att bättre uppskatta den funktionella dynamiken inom en viss population. Fördelen med vårt protokoll är att det ger omfattande metoder, från isolering av enstaka celler i primära vävnader, till analys och visualisering av denna datamängd.Även om denna metod börjar från encelliga suspensioner från huden och nerven, kan sekvenseringsmetoder som vi beskriver tillämpas för att studera någon däggdjursvävnad. Demonstrera detta förfarande kommer att Elodie Labit, och Wisoo Shin, två praktikanter från mitt laboratorium. Till att börja med dissekera den sciatic nerven av en avlivad mus genom att först skära huden bort från den hind regionen av baksidan av musen.Använd en steril skalpell blad för att göra ett snitt längs längden på låret. Använd sedan fina tlyktor och sax för att exponera och ta bort ischiasnerven. För att dissekera rygghuden, använd fina kraftpens och sax för att göra snitt från skuldra till skuldra, över rumpan och ner på baksidan.Tvätta vävnaderna två gånger med iskall HBSS. Under en dissekera mikroskop, ta bort oönskade bindväv, fettdepåer, eller skräp. För huden bara, skär huden i tunna skivor, med hjälp av en steril skalpell blad.För att erhålla huden dermis, flyta huden skivor i dispase, i HBSS i en 10 centimeter skål, för 30 till 40 minuter vid 37 grader Celsius. Använd fina teds för att skala och separera epidermis från dermis, och sedan kasta epidermis. Sedan, för hud och nerv, använd ett par sterila skalpellblad för att hacka varje prov i en till två millimeter bitar.Placera vävnadsbitarna i nytinad, två gram per milliliter kall kollagenas-fyra enzym i en 15 milliliter konisk slang. Inkubera varje prov i enzymet i ett 37-graders Celsiusbad i 30 minuter med varsam skakning var 10:e minut. Vid 30 minuter, använd en P1000 pipetter att triturate vävnaden 20 till 30 gånger, och återgå till vattenbad.Upprepa trituration var 30 minuter tills lösningen verkar grumlig, och bitar av vävnad är till stor del separeras. För endast hud, under den sista timmen av inkubation, tillsätt ett milligram per milliliter DNAse till hudprovet. Eftersom vissa celltyper är mer känsliga än andra för mekanisk stress, kan överdriven dissociation tekniker bias din befolkning.Allmän dissociation är avgörande för att uppnå hög cell avkastning, och en korrekt representation av vävnad sammansättning. Därefter använder du ett 40-mikrometerfilter ovanpå det 50 milliliter koniska röret för att filtrera varje vävnadsprov två gånger. Skölj filtret med en procent BSA/HBSS.Efter centrifugering av proverna som beskrivs i manuskriptet, åter upphäva cellpellets i HBSS, som innehåller en procent BSA, med hjälp av en bred-bore spets, och placera på is. Tillsats av livskraft färgämne hjälper dig att optimera din beredning. Du bör sikta på minst 80 procent livskraftiga celler.När optimerad, denna och andra kvalitet-kontroll steg kan utelämnas för att påskynda dissociation processen, som bättre kommer att bevara RNA-kvalitet och minska cellförlust. För att isolera livskraftiga och friska celler med FACS, först förbereda 15 milliliter smalbottna rör med åtta milliliter iskall en procent BSA / HBSS för provsamlingar. För att säkerställa att gränssnittet mellan ytan av vätskan och insidan av röret är fuktig, och för att förhindra statisk och ytspänning, invertera rören före samlingar.Omedelbart efter FACS cellsortering, när celler samlas i ett 15 milliliter rör, använd en milliliter av en procent BSA/HBSS för att tvätta och trycka ner alla celler från rörets sidoyta. Därefter centrifugera varje prov vid 260 g i åtta minuter. Efter att du har kastat supernatanten, åter upphäva cellpelletsen i en procent BSA/HBSS, och tillsätt 33,8 mikroliter till ett rör och förvara det röret på is.Detta steg är utformat för att göras med hjälp av reagenser som erhålls från en standardiserad sats. Alla påvisade steg ska utföras efter tillverkarens anvisningar. För att förbereda för GEM generation, placera ett chip i chip innehavaren, förbereda en cell master mix på is, enligt tillverkarens protokoll.Tillsätt 56,2 mikroliter av mastermixen till ett rör som innehåller 33,8 mikroliter av självfjädring. För att förbereda chipet, först vid 50 procent glycerol till brunnarna som inte kommer att användas. Tillsätt sedan 90 mikroliter av cellen master mix till väl en, 40 microliters av gel pärlor till väl två, och 270 microliters av partitionering olja till väl tre.Täck chipet med en packning. För att läsa in chipet och köra i en encellsstyrenhet, mata först ut facket. Placera chipet i facket.Dra tillbaka facket och tryck på play. Efter den fullständiga körningen, samla 100 mikroliter av provet, och placera i ett PCR-rör. Placera PCR-rör i en förinställd PCR-maskin, och kör enligt satsen.Efter körningen kommer GEMs att innehålla fullängds, streckkodad cDNA, från polyadenylated mRNA. Placera rören på minus 20 grader Celsius över natten. Fortsätt med bibliotekskonstruktion, sekvensering, anpassning och analys.När proverna är sekvenserade och i linje enligt beskrivningen i manuskriptet, deponera data på ett offentligt förråd, såsom NCBI: s GEO. För att göra detta, registrera dig för inlämnarkontot. Slutför först GEO-inlämningen genom att ladda ned metadatabladet.Se till att bara ta med ett metadatablad per projektinlämning. Placera kalkylbladet i katalogen. Lägg för det andra till den obehandlade datafil som genereras från cell-ranger-antalsskriptet för alla bibliotek i katalogen.Den tredje mappen bearbetas datafiler. Placera bearbetade datafiler som genereras från cell-ranger räkna skript för alla bibliotek i katalogen. Använd GEO-inlämnarens FTP-serverreferenser för att överföra katalogen som innehåller alla tre komponenterna.Efter att ha kört Cell Ranger kan analysfärdiga genstreckkodsmatriser bearbetas vidare med hjälp av avancerad bioinformatik. Först gjordes förbearbetning av mängdkontroller med hjälp av Seurat R-paketet, som genererade violin- och spridningstomter för att visualisera antalet gener, antal unika molekylära identifierare och procentandel mitokondriella gener för att identifiera celldubbel och extremvärden. För val av huvudsakliga komponenter, eller datorer, armbåge tomter användes, där DATORER bortom platån av standardavvikelsen av PC-axeln, uteslöts.Upplösningen av klustring manipulerades också. Låg upplösning ledde till färre cellkluster, där varje kluster sannolikt representerar en definierad celltyp. Hög upplösning ledde till högre cellsannolikhet, som representerar undertyper, eller övergångsstater, av en cellpopulation.Klusterinställningar med låg upplösning användes för vidare analys av uttrycksvärmekartor för att identifiera de mest uttryckta generna i ett givet kluster. Enskilda kandidatgener visualiserades på tSNE-tomter, med hjälp av Seurats funktionskomplott, som tillät dechiffrering, om det fanns kluster som representerade till exempel makrofager. Både kluster två och fyra uttryckt CD68, en pan-macrophage markör.Andra paket ger också verktyg för kvalitetskontroll, till exempel Monocle, ett R-paket som används för att bygga cellbanor, tar bort celler av dålig kvalitet och säkerställer att fördelningen av mRNA över alla celler är loggnormal, och föll mellan övre och nedre gränser. Enstaka celler klassificerades sedan och räknades, med hjälp av kända härstamningsmarkörgener och celler som uttrycker markörer av intresse tilldelades celltyp nummer ett. Det bestämdes att celltyp nummer ett var fibroblaster.Denna population bedömdes att bygga fibroblaster utvecklingsmässiga bana. Efter detta förfarande, andra metoder som kvantitativa PCR, in situ hybridisering, en immunist kemi bör utföras för att validera riktigheten av dina genuttryck resultat. Encellig mRNA-sekvensering har nu banat väg för forskare inom många olika områden att utforska cell-till-cell-heterogeniteten, och identifiera funktionell dynamik inom olika vävnader under homeostas, och hur dessa kan förändras efter skada eller i sjukdomsutveckling.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranuclear mikroinjektion av DNA i dissocierade vuxna däggdjur Neuroner

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissektion av organ från vuxna Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

UPPDRAG esiRNA för RNAi screening i däggdjursceller

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell transkriptionell Profilering av Vuxen mus Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analys av cellcykeln Position i däggdjursceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Mätning av hemsyntesen nivåer i däggdjursceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Effektiv Mammalian Cell Expression och Single-steg Rening av extracellulära glykoproteiner för kristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Anaerob tillväxt och underhåll av däggdjursceller linjer

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Berikar avkastningen av mänskliga melanocyter från vuxna hudvävnader

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Single Myofiber Culture Assay för bedömning av vuxna muskelstamcellsfunktionalitet Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...