Name: droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Destek personeli UCDNA Hizmetleri tesisinde, hem de hayvan bakım tesisi personeli University of Calgary anıyoruz. Biz onun Biyoinformatik desteği için Matt Workentine ve Jens Durruthy onun teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser yapıldı (RM ve JB), yanında bir CIHR vermek bir CIHR yeni araştırmacı Ödülü JB ve bir Alberta çocuk sağlığı Araştırma Enstitüsü Bursu (js) finanse.

<ol>
	<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+for+cellular+variation.">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation.</a> Nature. 510, 363-369 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161, 1202-1214 (2015).</li><li>Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+single-cell+RNA-seq+analysis+landscape+with+the+scRNA-tools+database.">Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database.</a> bioRxiv:206573. , (2018).</li><li>Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+defines+heterogeneity+and+transcriptional+dynamics+in+the+adult+neural+stem+cell+lineage.">Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage.</a> Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).</li><li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+Reveals+a+Population+of+Dormant+Neural+Stem+Cells+that+Become+Activated+upon+Brain+Injury.">Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Schwann+Cells+from+Adult+Human+Skin+and+Nerve.">Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Agilent Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135">https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135</a> (2018)</li><li>Kolodziejczyk, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+RNA-Sequencing+of+Pluripotent+States+Unlocks+Modular+Transcriptional+Variation.">Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation.</a> Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex.">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).</li><li>. Sequencing Requirements for Single Cell 3' Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3</a> (2018)</li><li>. Introduction to R Available from: <a target="_blank" href="https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r">https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. User Guides Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/">https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/</a> (2018)</li><li>. Creating a Reference Package with cellranger mkref Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references</a> (2018)</li><li>. System Requirements Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements</a> (2018)</li><li>. Software Downloads Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</a> (2018)</li><li>. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization</a> (2018)</li><li>. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial</a> (2018)</li><li>. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data Available from: <a target="_blank" href="https://www.scrna-tools.org/">https://www.scrna-tools.org/</a> (2018)</li><li>. Downloading conda Available from: <a target="_blank" href="https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html">https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html</a> (2018)</li><li>. r / packages / r 3.5.1 Available from: <a target="_blank" href="https://anaconda.org/r/r">https://anaconda.org/r/r</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>. Seurat - Guided Clustering Tutorial Available from: <a target="_blank" href="https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html">https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html</a> (2018)</li><li>. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis Available from: <a target="_blank" href="https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357">https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357</a> (2018)</li><li>Github. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).</li><li>. GenBank Submission Portal Wizards Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/</a> (2018)</li><li>. Submitting data Available from: <a target="_blank" href="https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/">https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/</a> (2018)</li><li>Shah, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+and+Fate+Mapping+of+Ependymal+Cells+Reveals+an+Absence+of+Neural+Stem+Cell+Function.">Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function.</a> Cell. 173, 1045-1057 (2018).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11, 1 (2013).</li><li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts:+a+molecular+atlas+of+kidney+development.">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144, 3625-3632 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96, 313-329 (2017).</li><li>Zeigenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+states+versus+single-cell+atlases+-+two+classes+of+heterogeneity+that+differ+in+meaning+and+method.">Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method.</a> Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).</li><li>Herman, J. S., Sagar, D., Gr&#252;n, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FateID+infers+cell+fate+bias+in+multipotent+progenitors+from+single-cell+RNA-seq+data.">FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data.</a> Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).</li></ol>

Hiçbir açıklamalar

Bu protokolü nasıl tek hücreler uygun hazırlanması tek hücreleri binlerce transkripsiyon heterojen ortaya çıkarmak ve işlevsel devletler veya bir doku içinde benzersiz hücresel kimlikler ayırımcılık gösterir. Protokol does değil istemek floresan muhabir proteinler veya transgenik araçları ve tek hücre izolasyon için ilgi insanlar de dahil olmak üzere çeşitli dokularda uygulanabilir; Her doku göz önünde bulundurarak benzersizdir ve bu protokol ayarlama/değiştirme bir dereceye gerektirir.
Hücre içinde farklı ve son derece dinamik transkripsiyon programlar tek hücreli genomik değerini vurgulamıştık. Yüksek kaliteli RNA izole bir yana, kaliteli veri kümeleri için gerekli kritik örnek hazırlama adım hücreleri tamamen dokudan serbest bırakılır ve hücreleri sağlıklı ve sağlam olduğunu garanti etmektedir. Bu nispeten düz ön kolayca olan hücreleri toplama, nereye hücreler gevşek korunur, dokularda veya hücreleri dolaşan gibi lenfoid doku gibi serbest bırakmak için olduğunu. Ama bu büyük mesafeler, hücre dışı matriks ve genellikle katı hücre iskeleti proteinleri hücre yapısını korumak dahil çevreleyen kapsayan çok gelişmiş hücresel mimarisi nedeniyle diğer yetişkin dokular için zor olabilir. Hücre dolu serbest bırakmak için bile uygun ayrışma teknikleri ile gerekli titiz ve sık sık uzun işleme mRNA kalite ve hücre bütünlüğü değiştirecek potansiyel yoktur. Buna ek olarak, enzim destekli ayrılma için kullanılan yüksek sıcaklıklar da transkripsiyon imzalar29,30etkiler. İletişim kuralı kalite kontrol sunmak için nasıl en iyi duruma getirme bu engelleri aşmak için yardımcı olabilir göstermek için dokulara myelinated yetişkin sinir ve ekstraselüler matriks zengini yetişkin cilt gibi kullanarak denetler kararlıdır.
Herhangi bir scRNA-Seq deneme tasarlarken büyük göz önünde bulundurarak bir sıralama derinlik seçimdir. Sıralama olabilir son derece multiplexed ve okumak derinliği değişir damla-Seq2 5 milyon kadar okuma/hücre14 akıllı-devamı gibi tam uzunlukta bir RNA-Seq yöntemiyle kullanarak çok düşük olması Çoğu scRNA-Seq deneyler ile sıralama 10.000 okuma/hücre, düşük orta yüksek ifade tutanakları hücre tipi sınıflandırma41,42için genellikle yeterli olduğu algılayabilir. Nerede hücreleri binlerce güvenle nadir nüfus atfetmek için gerekli olabilecek karmaşık dokular arasında nadir hücre popülasyonlarının algılamaya çalışırken sıralama maliyetlerinde tasarruf değerinin sığ sıralama derinliğidir. Ama gen ekspresyonu ve ince transkripsiyon imzaları ile ilişkili işlemler hakkında ayrıntılı bilgi gerekli olduğunda sığ derinlik sıralama yeterli değildir. Şu anda, bu genlerin hücrede büyük çoğunluğu 500.000 okuma/hücre ile tespit edilir ama bu protokol bağlı olarak değişebilir ve doku yazın43,44tahmin edilmektedir. Tam uzunlukta transkript sıralama derleme ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve bu nedenle, roman ya da nadir splice türevleri, tespit edebilen sıralama maliyeti genellikle karmaşık doku sistem oluşan hücreler binlerce incelemek için bu tür yaklaşımlar ölçekleme sınırlayın. Bu protokol için tipik olarak açıklanan olanlar daha düşük karmaşıklık ve sığ sıralama gereksinimi gibi buna ek olarak, 3' tek hücreli kitaplıkları öğesini. Açıklanan protokolü kullanılarak oluşturulan kitaplıkları beş desteklenen sıralayıcılar birinde sıralı unutmamak gerekir: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 hızlı koşmak ve yüksek çıkış, 4) NextSeq 500/550 ve 5) MiSeq.
Narin doku ve hücre henüz işleme azaltacak alternatif bir yaklaşım tek hücre RNA-Seq, tek hücre RNA-Seq yararlarından bazıları tutar, RNA tek çekirdek45' den analizidir. Bu yaklaşım daha hızlı işleme RNA bozulması ve yeterli çekirdek sürümü sağlamak için daha fazla aşırı önlemler azaltmak sağlar ve böylece büyük olasılıkla belirli bir doku içinde tüm hücreleri temsil eden transkripsiyon profilleri daha güvenli bir yakalama sağlar. Bu tabii ki, sadece transkripsiyon etkinlik böylece bu yaklaşım olabilir veya uygun olmayabilir ilgi deneysel hedefleri nelerdir bağlı olarak belirli bir hücrenin içinde mevcut bir bölümünü sağlar.
Belirli bir doku içinde hücresel kimlikleri tam karakterizasyonu yanı sıra, scRNA-Seq veri kümeleri için en değerli analizleri ara Transkripsiyon Birleşik değerlendirilmesi 'tanımlanmış' hücre popülasyonlarının biridir. Bu ara devletlerin geleneksel toplu RNA-Seq yaklaşımlar mümkün değildi tanımlanan nüfus içindeki hücreleri arasında soy ilişkileri anlayışlar aktarabilir. Birkaç scRNA Seq bioinformatic araç şimdi bu aydınlatmak için geliştirilmiştir. Gibi araçlar, örneğin, kök hücre içine çeşitli terminal kader ya da bağışıklık hücreleri aktif ve durgun durumlar arasında mekik olgunlaşması bir oncogenic/metastatik durumuna geçiş kanser hücrelerinin dahil süreçleri değerlendirebilirsiniz. Hücreleri ince transcriptome farklılıkları da son zamanlarda geliştirilen bioinformatic araçlar FateID gibi sonucuna göre47lineage önyargıları göstergesi olabilir. Hücreleri geçiş arasında farklar zor olabilir bu yana transkripsiyon farklılıklar tespit için ince olabilir, daha derin sıralama gerekli46olabilir. Neyse ki, kapsamı, derin sıralı bir Kütüphane Kütüphane başka bir akışı cep telefonundan yeniden çalıştırarak veri kümesi daha fazla sondalama ilgilenen varsa artırılabilir.
Birlikte ele alındığında, bu iletişim kuralı transcriptionally tek-hücreleri bir deney içinde binlerce yüzlerce profil kullanıcılarının kullanmasına izin veren bir kolay uyum iş akışı sağlar. ScRNA-Seq dataset nesnesinin son kalite en iyi duruma getirilmiş hücre izolasyon, akış sitometresi, cDNA Kütüphanesi nesil ve ham gen-barkod matrisler yorumlanması dayanmaktadır. Bu amaçla, bu protokol çalışmaları çeşitli doku tipleri etkinleştirmek için kolayca değiştirilebilir tüm anahtar adımların kapsamlı bir genel bakış sağlar.

Yüksek işlem hacmi tek hücre teknolojisi1,2 ve Kullanıcı dostu biyoinformatik araçlarını son on yılda3üzerinde gelişmeler geliştirilmesi ile yüksek çözünürlüklü gen ifade analizi yeni bir alan ortaya çıkmıştır- tek hücreli RNA sıralama (scRNA-Seq). Tek hücre gen ekspresyonu çalışmanın ilk kök hücre veya kanser hücreleri, heterojen tanımlı hücre popülasyonlarının içinde tanımlamak için ya da ulaşılamaz kullanarak olan nadir hücreleri4,5, olasılığını belirlemek için geliştirilmiştir geleneksel toplu RNA sıralama teknikleri. Bioinformatic araçları kimliği roman alt nüfus (Seurat)2, görselleştirme hücreleri bir psuedotime alanı (tek gözlük)6, tanımı içinde veya arasında nüfus (etkin sinyal ağların boyunca sipariş etkinleştirdiyseniz Doğa Manzaralı)7, tek-hücreleri bir yapay 3B alanda (Seurat ve daha fazlası) Meclisi tahmin8. Bu yeni ve heyecan verici analizler ile bilimsel topluluk için kullanılabilir, scRNA-Seq fast-gen ifade analizi için yeni standart yaklaşım haline geliyor.
ScRNA-Seq büyük potansiyel rağmen temiz bir veri kümesi üretmek ve doğru sonuçlar yorumlamak için gerekli teknik skillsets yeni gelenler için zor olabilir. Burada, temel, ancak kapsamlı bir iletişim kuralı, Bütün birincil dokulara görselleştirme tek hücre izolasyon ve yayın için verilerin sunumunu başlayarak (Şekil 1) sunulmuştur. Farklı dokuların enzimatik sindirim ve sonraki mekanik ayrışma duyarlılık onların derecesine göre değişiklik gibi ilk olarak, sağlıklı tek hücre izolasyon zorlu, kabul edilebilir. Bu iletişim kuralı aşağıdaki yalıtım adımları sağlar ve denetim sürecinde önemli kalite kontrol noktaları tanımlar. İkinci olarak, uyumluluk ve tek hücre teknolojisi ve yeni nesil sıralamanın arasında gereksinimleri anlama kafa karıştırıcı olabilir. Bu iletişim kuralı bir Kullanıcı dostu, damlacık tabanlı tek hücreli barkodlama platform uygulamak ve sıralama gerçekleştirmek için yönergeler sağlar. Son olarak, bilgisayar programlama tek hücreli transcriptomic veri analiz etmek için önemli bir önkoşuldur. Bu iletişim kuralı R programlama dili ile Başlarken kaynaklar sağlar ve iki popüler scRNA Seq özel R paketleri uygulama yönergeler sağlar. Birlikte, bu protokol yapılan açık, yorumlanabilir sonuçları elde etmek için scRNA-Seq analiz işlemlerinde yeni gelenler rehberlik eder. Bu protokolü çoğu dokulara fare ayarlanabilir ve önemlisi insan dokusu da dahil olmak üzere diğer organizmaların kullanılmak üzere değiştirilmiş olabilir. Ayarlamalar bağlı olarak doku ve kullanıcı-ecek var olmak gerekli.
Bu iletişim kuralı aşağıdaki sırada akılda tutulması gereken birkaç önemli noktalar vardır; dahil olmak üzere, 1) tüm kalite kontrol yönergeleri adım 1 ve 2 Bu protokol aşağıdaki doğru Toplam hücresini sayı sayar ( Şekil 2 özetlenen sağlarken kalıcı tek hücre süspansiyon ilgi örnek içindeki tüm hücreleri sağlamak için tavsiye edilir ). Bir kez bu sağlanır ve en iyi duruma getirilmiş koşulların tümü yerine getirilirse, kalite kontrol adımları kesilmesine (için zamandan tasarruf - RNA kalite koruyarak ve azaltılması hücre kaybı). Yüksek canlılık tek hücre ilgi dokusundan başarılı yalıtım onaylayan son derece tavsiye herhangi önce aşağı işliyor. 2) aşırı ayrışma teknikleri bazı hücre tipleri strese diğerlerinden daha duyarlı olduğundan, bu nedenle aşağı akım Analizi semptomlarıdır nüfus, farkında olmadan önyargı. Nazik ayrılma gereksiz hücresel kesme ve sindirim olmadan yüksek hücresel verimleri ve doku kompozisyon bir doğru bir şekilde temsil ulaşmak için önemlidir. Kesme kuvvetleri sırasında toz, FACS ve resuspension adımlar gerçekleşir. 3) olarak herhangi bir RNA çalışma ile bu hazırlık sırasında içine mümkün olduğunca örnek küçük ek RNase tanıtmak en iyisidir. Bu yüksek kaliteli RNA korumak yardımcı olacaktır. Temiz araçlar ve değil herhangi bir donanım için durulama ile ribonükleaz inhibitör çözümleri kullanır RNase free ama DEPC tedavi ürünler kaçının. 4) ürünleri mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirmek. Bu yüksek kaliteli RNA korumak ve hücre ölümü azaltmak yardımcı olacaktır. Doku diseksiyon uzunluğu ve hayvan sayısı bağlı olarak, aynı anda birden fazla diseksiyonlarının/hazırlıklar başlangıç düşünün. 5) hücreleri buz üzerinde mümkün yüksek kaliteli RNA korumak, hücre ölümü azaltmak ve yavaş hücre zaman sinyal gönderme ve transkripsiyon etkinlik hazırlamak. Gerçi, buz gibi işleme çoğu hücre tipleri için idealdir, bazı hücre türleri (Örneğin, nötrofiller) Oda sıcaklığında işlendiğinde daha iyi performans. 6) kalsiyum, magnezyum, EDTA ve DEPC tedavi ürünleri hücre hazırlık sırasında kaçının.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Products</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse out</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Euthanyl</td>
			<td></td>
			<td>50mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 5U/ml</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-4 125 CDU/mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Narrow bottom tube VWR&#174; High-Performance Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Orange Viability Dye</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>11320972</td>
			<td>1.3 nM/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa DNA Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer Platform</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina&#174; MiSeq SR50</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell Ranger</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/overview/welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe Cell Browser</td>
			<td>10x GENOMICS</td>
			<td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>/software/downloads/latest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>https://anaconda.org/r/r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet barcoding-based single cell transcriptomics of adult mammalian tissues

Tek hücre gen ekspresyonu doku veya microenvironment içindeki tek tek hücreleri binlerce genelinde analizidir tanımlayıcı hücre kompozisyon, ayrımcılık işlevsel Devletler ve moleküler yolları gözlenen doku temel için değerli bir araç işlevler ve hayvan davranışları. Ancak, sonraki aşağı akım tek hücre moleküler analiz için yetişkin memeli doku sağlam, sağlıklı tek hücre izolasyon zor olabilir. Bu protokol genel işlemlerini açıklar ve yüksek kalite yetişkin tek hücre hazırlıklar sinir sisteminden elde etmek veya bu cilt için gereken sonraki tarafsız tek hücre RNA sıralama ve analiz etkin kalite kontrol eder. Aşağı akım bioinformatic analiz için yönergeler de temin edilmektedir.

ScRNA-Seq veri analiz etmek için tasarlanmış açık kaynak paketlerini repertuar40 bu paketleri Kullanım R dayalı dillerde3çoğunluğu ile önemli ölçüde artmıştır. Burada, iki bu paketleri kullanarak temsilcisi sonuçları sunulmuştur: denetimsiz gruplandırması değerlendirirken tek gen ifadeye dayalı hücreleri ve hücre heterojenite ve biyolojik deconstruct sorunu çözmek için tek hücreleri bir yörünge boyunca sipariş işler.
Şekil 4 kalite kontrolleri ve aşağı akım Biyoinformatik Analizi ön işleme için Seurat kullanımını göstermektedir. İlk olarak, filtrasyon ve analiz sapkın hücrelerden kaldırılması esastır kalite kontrol etmek için. Bu yapıldı mitokondrial genler, genler (nGene) sayısı ve hücre birini ve aykırı tanımlamak için UMI (nUMI) sayısı yüzdesi görselleştirmek için keman (Şekil 4a) ve dağılım kullanarak çizer (4b rakam). Herhangi bir hücreyi açıkça aykırı birkaç genler, UMI veya mitokondriyal genlerinin yüzde Seurat'ın FilterCells işlevini kullanarak kaldırıldı. Seurat asıl bileşeni (PC) kullandığından analiz puanları dahil etmek için istatistiksel olarak anlamlı PC'ler belirleme kümeleri hücrelere önemli bir adım olduğunu. Dirsek araziler (Şekil 4 c) eksen hangi PC'ler Yaylası 'standart sapma' in PC ötesinde hariç PC seçimi için kullanılmıştır. Kümeleme çözünürlük de 4 (yüksek hücre kümeleri, Şekil 4e için önde gelen yüksek çözünürlük için küme sayısı, 0,4 (düşük çözünürlükte daha az sayıda hücre kümeleri, Şekil 4 diçin lider) arasında değişen değiştirilebilir olduğunu gösteren manipüle edildi ). Yüksek çözünürlükte bu da alt türlerinden veya geçici Birleşik bir hücre nüfusunun gösterebilir, ancak düşük çözünürlükte, bu her küme tanımlanmış hücre tipi temsil ettiğini muhtemeldir. Bu durumda, düşük çözünürlüklü küme ayarlarını daha fazla ifade heatmaps (Seurat'ın DoHeatmap işlevini kullanarak) çözümlemek için verilen küme (Şekil 4f) en çok ifade genlerinde tanımlamak için kullanılmıştır. Bu durumda, en yüksek ifade genlerin her küme benzersiz olarak tanımlanan genler tarafından temsil edildi gösteren kombine, diğer tüm kümeleri karşı belirli bir kümedeki farklı ifade değerlendirirken tarafından tespit edilmiştir. Ayrıca, tek tek aday genler Seurat'ın FeaturePlot işlevini (Şekil 4 g) kullanarak tSNE araziler üzerinde görüntülenir. Bu deşifre için makrofajlar temsil kümeleri olup izin verdi. FeaturePlot kullanarak, bulduğumuz her ikisi de 2 küme ve 4 Cd68 - pan-makrofaj marker ifade.
Tek gözlük paketi Seurat içinde tanımlanan hücre kümeleri corroborating ve hücre yörüngeleri veya pseudotemporal siparişi, oluşturma biyolojik süreçlerin (Şekil 5) özetlemek için kullanıldı. Pseudotemporal sipariş için numuneleri nerede tek hücreli ifade profilleri bir biyolojik saat ders izleyin bekleniyor kullanılabilir. Hücreleri pseudotemporal bir süreklilik ara Birleşik, iki alternatif hücre kaderi, çatallanma noktaları gidermek için sipariş edilebilir ve gen imzalar her kader edinimi temel tanımlar. Öncelikle, Seurat'ın filtrasyon, benzer kalitesiz hücreleri mRNA dağıtım tüm hücreler üzerinde günlük normal ve Şekil 5a' tanımlandığı gibi alt ve üst sınırları arasında düştü böyle çıkarıldı. Sonra tek gözlük'ın newCellTypeHierarchy işlevini kullanarak, tek hücreler sınıflandırıldı ve bilinen sülale marker gen (Şekil 5b, 5 c) kullanarak sayılır. Örneğin, PDGF reseptör Alfa veya Fibroblast belirli Protein 1 ifade hücreleri fibroblastlar tanımlamak için bir ölçüt oluşturmak için hücre türü #1 olarak atanmıştır. Daha sonra bu nüfus (hücre türü #1) fibroblast yörüngeleri deşifre değerlendirildi. Bunu yapmak için tek gözlük'ın farklı GeneTest işlev, hangi aşırı Birleşik Devletleri nüfus içinde temsil eden hücreler karşılaştırıldığında ve kalan hücreleri nüfus (Şekil 5 d) sipariş vermek için farklı genler bulundu kullanılmıştır. Bütün hücreler arasında manifoldu öğrenme yöntemleri (doğrusal olmayan dimensionality azaltma bir tür) uygulayarak, pseudotemporal bir yol boyunca bir koordinat atandı. Bu yörünge sonra hücre devlet (Şekil 5e) ve pseudotime (Şekil 5f) tarafından görüntülenmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> Şekil 1: akış şeması. Tek analiz için birkaç adım mesafede bütün hayvan hazırlık genel kullanıma sunulan bir depo için son veri gönderme için RNA-Seq veri hücre. Emülsiyon (taşlar) jel boncuklar boncuk ile binlerce tek hücre saklayan barkodlu oligonucleotides bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> Şekil 2: uygun tek hücre süspansiyon sinir dokusu oluşturma. kalite kontrol (a) karikatür bakış denetler. (b) hücreleri ve enkaz hücrelerle hala enkaz (kırmızı oklar) dahil. (c) enkaz (kırmızı oklar) serbest bırakmak hücrelere. (d) hücre izolasyon FACS tarafından. P0: enkaz kesir; P1: hücre benzeri kesir; P3: duplets dışlanması; P4: canlılık boya (Sytox turuncu) negatif kesir. (e) canlılık boya kontrol. (f) görüntü izole enkaz temsil eden P0 kesir. (g) görüntü izole hücrelerin (kırmızı oklar) temsil eden P4 kesir. (b) (c) (f) ve (g) nükleer boya görüntüleme önce 20 dakika eklendi. Ölçek çubukları: 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> Şekil 3: sığ sıralama 10 X işlenmiş örnekleri kurtarılan hücre sayısı öngörür. (a) MiSeq tarafından oluşturulan csv cep barkod ve onun karşılık gelen UMI listeleme bir örnek (örnek 1.6) güvenle eşlenen okuma tarafından belirlenen sayar. (b) Barkod rütbe Arsa örnek 1,6 için hücre barkodlar bir fonksiyonu olarak UMI sayıma bir düşüş gösterir. Kesik çizgili ve düz çizgiler kesme hücreleri görsel denetim tarafından belirlendiği gibi arka plan arasında gösterir. (c) hücre barkod cep Ranger boru hattı post-HiSeq kullanarak sığ sıralama doğru örnek 1,6 için hücre sayısı yaklaşık olarak ortaya koymaktadır görülmektedir. (d) bir örnek üzerine sığ dayandırılmış bir akış hücreli tuzak hücre tahminleri elde. Sığ sıralama 3480 hücreleri, tahmin beri örnek 1,6 için 1.17 yolları sağlamak için ayrıldı > hücre sıralama kapsamında HiSeq başına 100.000 defa okundu. Not: %100 için tüm yolları eklemeniz gerekir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> Şekil 4: kalite kontrol ve Biyoinformatik Seurat R paketi kullanarak tek hücreli RNA-Seq DataSet. (a) gen sayısı, benzersiz moleküler tanımlayıcıları (UMIs) sayısı ve mitokondrial genom eşleme transkript yüzdesi kapsayan kalite kontrol ölçümleri ve araziler. (b) örnek gen algılama hücreleri sapkın düzeyde mitokondrial transkript ve UMIs ile çizer. (c) örnek dirsek Arsa istatistiksel olarak anlamlı adet geçici belirlenmesi için kullanılan. Kesik ve nokta kesik çizgiler nerede net bir "dirsek" grafikte ortaya çıkıyor kesme gösterir. PC boyutları bu dirsek önce aşağı akım Analize dahil. (d, e) Grafik tabanlı hücre kümeleri tSNE arsa kullanarak düşük boyutlu uzayda iki farklı çözünürlüklerde görüntülenir. (f) Seurat'ın DoHeatmap işlevini kullanarak bir ifade heatmap görüntülenir üstteki işaretleyiciyi genler (sarı) her küme için. (g) ifade işareti, örneğin, makrofajlar (mor Seurat'ın FeaturePlot işlevini kullanarak) temsil eden Cd68 gen görselleştirme. Bu o küme 2 ve 4 (panel d) Bu veri kümesi temsil eden makrofajlar göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> Şekil 5: hücre kategori ve tek gözlük araç setini kullanarak peudotemporal yörünge sipariş. (a) (UMI sayar anlaşılmaktadır) mRNA dağıtım bir örnek tüm hücreler boyunca teftiş. Sadece hücreleri arasında 0 - mRNA ile ~ 20.000 aşağı akım analiz için kullanıldı. (b, c) Atama ve bilinen sülale hücre işaretleri üzerinde temel hücre tipleri devam ediyor. Örneğin, PDGF reseptör Alfa veya Fibroblast belirli Protein 1 ifade hücreleri pan-fibroblastlar temsil eden hücre türü # 1'e atanmış monokl'ın newCellTypeHierarchy işlevini kullanarak. Farklı hücre türleri bir pasta grafiği (b) ve (c) bir tablo olarak görüntülenmeyecektir. (d) hücre kullanarak bir örnek olarak, hücre görselleştirildiği gen dağılım vs kötü ifade gösterir bir dağılım çizim kullanarak sipariş vermek için kullanılan genlerin türü 1 (fibroblastlar). Kırmızı eğri kesim monokl'ın estimateDispersions işlevini kullanarak ortalama varyans modeli tarafından hesaplanan sipariş vermek için kullanılan genler için gösterir. Bu kesim karşılamak genler aşağı akım pseudotime sipariş vermek için kullanıldı. (e, f) Hücre yörüngeleri azaltılmış bir iki boyutlu uzayda hücrenin "durumu" (e) ve "Pseudotime" (f) tek gözlük tarafından atanan renkli görselleştirme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues at JoVE.com

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

Bu iletişim kuralı genel işlemlerini açıklar ve kalite kontrol sağlıklı yetişkin memeli tek hücreleri damlacık-esaslı, yüksek üretilen iş tek hücre RNA-Seq hazırlıkları hazırlanması için gerekli denetler. Sıralama parametreleri, okuma hizalama ve aşağı akım tek hücreli bioinformatic analiz da sağlanır.

Damlacık tek hücre barkodlama tabanlı Transcriptomics yetişkin memeli dokuların

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Bu yöntem, bir yaralanma veya hastalık tan sonra binlerce tek hücrede gen ekspresyonu değişikliklerini anlamak gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, karmaşık bir doku içindeki tek tek hücrelerin transkripsiyonlarını incelememize ve belirli bir popülasyondaki işlevsel dinamikleri daha iyi takdir etmemize olanak sağlamasıdır. Protokolümüzün avantajı, birincil dokularda tek hücrelerin izolasyonundan bu veri setinin analizine ve görselleştirilmesine kadar kapsamlı yöntemler sunmasıdır.Bu yöntem deri ve sinirden tek hücreli süspansiyonlar başlasa da, tanımladığımız sıralama yöntemleri herhangi bir memeli dokusunu incelemek için uygulanabilir. Bu prosedürü gösteren Elodie Labit ve Wisoo Shin, benim laboratuvar iki stajyer olacaktır. Başlamak için, önce farenin arka bölgesinden deri keserek bir ötenazi farenin siyatik sinir inceleyin.Uyluk uzunluğu boyunca bir kesi yapmak için steril bir neşter bıçak kullanın. Sonra ortaya çıkarmak ve siyatik sinir kaldırmak için ince çerkes ve makas kullanın. Dorsal arka deri incelemek için, omuz omuz, kıç boyunca ve arka aşağı kesiler yapmak için ince çerkeçler ve makas kullanın.Dokuları buz gibi HBSS ile iki kez yıkayın. Bir diseksiyon mikroskop altında, istenmeyen bağ dokusu, yağ mevduat veya enkaz kaldırın. Sadece cilt için, steril bir neşter bıçak kullanarak, ince dilimler halinde deri kesti.Cilt dermiselde etmek için, 37 santigrat derece 30 ila 40 dakika, 10 santimetrelik bir çanak HBSS, dispase deri dilimleri float. Dermis soyma ve ayırmak için ince forceps kullanın ve sonra epidermis atın. Sonra, cilt ve sinir için, bir ila iki milimetre adet halinde her örnek kıyma steril neşter bıçakları bir çift kullanın.15 mililitrelik konik tüp içinde mililitre soğuk kollajenaz-dört enzim başına iki gram, taze çözülmüş içine doku parçaları yerleştirin. Enzimdeki her numuneyi 37 derecelik santigrat banyosunda her 10 dakikada bir hafifçe sallayarak 30 dakika kuluçkaya yatırın. 30 dakika, doku 20 ila 30 kez triturate ve su banyosu dönmek için bir P1000 pipetter kullanın.Çözelti bulutlu görünene kadar her 30 dakikada bir triturasyon tekrarlayın ve doku parçaları büyük ölçüde ayrıştırılır. Sadece cilt için, kuluçka son saat içinde, cilt örneğine mililitre DNAAse başına bir miligram ekleyin. Bazı hücre tipleri mekanik strese diğerlerinden daha duyarlı olduğundan, aşırı dissosyasyon teknikleri popülasyonunuzu saptırabilir.Genel dissosilasyon yüksek hücre verimleri elde etmek için önemlidir, ve doku kompozisyonu doğru bir temsil. Bundan sonra, her doku örneğini iki kez filtrelemek için 50 mililitrelik konik tüpün üstüne 40 mikrometrelik bir filtre kullanın. Filtreyi yüzde bir BSA/HBSS ile durula.El yazmasında açıklandığı gibi örnekleri santrifüj ettikten sonra, HBSS'de yüzde bir BSA içeren hücre peletini geniş delikli bir uç kullanarak yeniden askıya alın ve buzun üzerine yerleştirin. Canlılık boyası eklenmesi, hazırlığınızı optimize etmenize yardımcı olacaktır. En az yüzde 80 canlı hücreleri hedeflemeniz gerekir.Optimize edildikten sonra, bu ve diğer kalite kontrol adımları, RNA kalitesini daha iyi koruyacak ve hücre kaybını azaltacak ayrışma sürecini hızlandırmak için atlanabilir. FACS kullanarak canlı ve sağlıklı hücreleri izole etmek için, ilk örnek koleksiyonları için buz gibi yüzde bir BSA / HBSS sekiz mililitre ile 15 mililitre dar alt tüpler hazırlamak. Sıvının yüzeyi ile tüpün içi arasındaki arabirimin nemli olmasını sağlamak ve statik ve yüzey gerilimini önlemek için, tüpleri toplamadan önce ters çevirin.FACS hücre sıralamasından hemen sonra, hücreler 15 mililitrelik bir tüpte toplandıktan sonra, tüm hücreleri tüpün yan yüzeyinden yıkamak ve itmek için yüzde bir BSA/HBSS'nin mililitresini kullanın. Sonra sekiz dakika boyunca 260 g her örnek santrifüj. Supernatant attıktan sonra, bir yüzde BSA / HBSS hücre pelet yeniden askıya almak ve bir tüp 33.8 mikrolitre ekleyin ve buz üzerinde tüp tutun.Bu adım, standart bir kitten elde edilen reaktifler kullanılarak yapılacak şekilde tasarlanmıştır. Gösterilen tüm adımlar üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilmelidir. GEM üretimine hazırlanmak için, üreticinin protokolüne göre, çip tutucuya bir çip yerleştirin, buz üzerine bir hücre ana karışımı hazırlayın.33,8 mikrolitre kendinden süspansiyon içeren bir tüpe ana karışımın 56,2 mikrolitresini ekleyin. Çip hazırlamak için, ilk olarak yüzde 50 gliserol kullanılmaz kuyulara. Sonra hücre ana karışımı 90 mikrolitre iyi bir, jel boncuk 40 mikrolitre iyi iki ve 270 mikrolitre de üç bölümleme yağı ekleyin.Çipi bir contayla kaplayın. Fişi yüklemek ve tek hücreli bir denetleyicide çalıştırmak için önce tepsiyi çıkarın. Çipi tepsiye yerleştirin.Tepsiyi geri çekve oynat tuşuna basın. Tam çalışmadan sonra, numunenin 100 mikrolitresini toplayın ve bir PCR tüpüne yerleştirin. PCR tüplerini önceden ayarlanmış bir PCR makinesine yerleştirin ve kine göre çalıştırın.Çalıştırmanın ardından, GEM'ler poliadenlated mRNA tam uzunlukta, barkodlu cDNA, içerecektir. Tüpleri bir gecede eksi 20 dereceye yerleştirin. Kitaplık oluşturma, sıralama, hizalama ve çözümleme ile devam edin.Örnekler el yazmasında açıklandığı şekilde sıralanıp hizalandıktan sonra, verileri NCBI'nin GEO'su gibi genel bir depoya yatırın. Bunu yapmak için gönderen hesabına kaydolun. İlk olarak, meta veri sayfasını indirerek GEO gönderimini tamamlayın.Proje gönderimi başına yalnızca bir meta veri sayfası eklediğinden emin olun. Elektronik tabloyu dizine yerleştirin. İkinci olarak, tüm kitaplıklar için hücre korucusu sayısı komut dosyasından oluşturulan ham veri dosyasını dizine ekleyin.Üçüncü klasör işlenir veri dosyaları. Tüm kitaplıklar için hücre korucusu sayısı komut dosyasından oluşturulan işlenmiş veri dosyalarını dizine yerleştirin. Üç bileşeni de içeren dizini aktarmak için GEO gönderenin FTP sunucu kimlik bilgilerini kullanın.Cell Ranger çalıştırdıktan sonra, analize hazır gen barkod matrisler daha gelişmiş biyoinformatik kullanılarak işlenebilir. İlk olarak, gen sayısını, benzersiz moleküler tanımlayıcıların sayısını ve hücre doublet'lerini ve aykırılarını tanımlamak için mitokondriyal genlerin yüzdesini görselleştirmek için keman ve dağılım çizimleri oluşturan Seurat R paketi kullanılarak ön işlem miktar kontrolleri yapıldı. Temel bileşenlerin veya bilgisayarların seçiminde, PC ekseninin standart sapma platosunun ötesindeki bilgisayarların dışlandığı dirsek çizimleri kullanılmıştır.Kümeleme çözünürlüğü de manipüle edildi. Düşük çözünürlük, her kümenin tanımlı bir hücre türünü temsil etmesi yle daha az hücre kümesine yol açtı. Yüksek çözünürlük, hücre popülasyonunun alt türlerini veya geçiş durumlarını temsil eden daha yüksek hücre olasılığına yol açtı.Düşük çözünürlüklü küme ayarları, belirli bir kümedeki en yüksek ifade edilen genleri tanımlamak için ifade ısı haritalarının daha fazla analizi için kullanılmıştır. Bireysel aday genler, Seurat'ın özellik çizim iþlemi kullanarak tSNE parsellerinde görselleştirildi, bu da deşifre edilmesine olanak sağlayan, örneğin makrofajlari temsil eden kümeler olup olmadigini. Her ikisi de küme iki ve dört CD68, bir pan-makrofaj belirteç ifade.Diğer paketler de kalite kontrol için araçlar sağlar, örneğin, Monocle, hücre yörüngeleri oluşturmak için kullanılan bir R paketi, düşük kaliteli hücreleri kaldırır ve tüm hücreler arasında mRNA dağılımı günlük normal olmasını sağlar ve üst ve alt sınırlar arasında düştü. Daha sonra bilinen soy belirteç genleri kullanılarak tek hücreler sınıflandırıldı ve sayıldı ve ilgi çekici işaretleri ifade eden hücreler bir numaralı hücre tipine atandı. Bir numaralı hücre tipinin fibroblast olduğu belirlendi.Bu popülasyon fibroblastlar gelişim yörüngesi oluşturmak için değerlendirildi. Bu prosedürü takiben, kantitatif PCR gibi diğer yöntemler, yerinde hibridizasyon, bir immünist kimya gen ekspresyonu sonuçlarının doğruluğunu doğrulamak için yapılmalıdır. Tek hücreli mRNA dizilimi artık birçok farklı alanda araştırmacıların hücreden hücreye heterojenliği keşfetmelerine ve homeostaz sırasında farklı dokulardaki fonksiyonel dinamikleri belirlemelerine ve bunların yaralanmadan veya hastalık gelişiminde nasıl değişebileceğini belirlemelerine yol açmıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Anaerobik büyüme ve bakım memeli hücre hatları

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Yetişkin Cilt Dokularından İnsan Melanositlerin Verimini Zenginleştirir

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...