Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

بلازميد pCW-Cas9 وكان هدية من إريك لاندر & ديفيد ساباتيني (بلازميد أدجيني # 50661) و (بسي)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 ث بلازميد من مختبر يوسا (بلازميد أدجيني #67974. نود أن أشكر الأساسية "التدفق الخلوي" في معهد الاستراتيجية والخطة الاستشرافية الاكتشاف الطبي للمساعدة في الوقت المناسب مع تحليل تدفق والفرز. ونود أن نعترف بالدعم من "مؤسسة النصب التذكاري تاتا سيدة" إلى ميلادي ونود أن نعترف أيضا بدعم مصادر التمويل التالية: المعاهد الوطنية للصحة/NCI P30 CA030199 السرطان مركز رعاية منحة، والخامس-المؤسسة ومراكز السرطان NCI سان دييغو (C3) #PTC2017to A.J.D.

1-خلية مكافحة غسل الأموال توليد خط الحيوانات المستنسخة مع التعبير عالية من Cas9 مستقر ونشط
<ol><li>إنتاج لينتيفيروس Cas9
	<ol>
<li>اليوم 0: لوحة 4 × 106 293T الخلايا في 10 مل دميم مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين ولام الجلوتامين في طبق استنبات الأنسجة 10 سم في السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) ...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

في هذه المخطوطة، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة للقيام فحص كريسبر-Cas9-تعتمد نمو تنافسي التحقيق في دور الجينات المرشحة في خطوط خلية مكافحة غسل الأموال باستخدام التدفق الخلوي في الخلايا البشرية/الفاري مكافحة غسل الأموال (الشكل 5). الهدف المتمثل التحليل تحديد تأثير حذف الجينات في ?...

وشهدت العقود القليلة الماضية جهود بحثية عديدة ركزت على تحديد مساهمة رئيسية المسارات الجزيئية في أمراض سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). تقليديا، تم أداء تعطيل الجينات في خلايا مكافحة غسل الأموال باستخدام الفئران خروج المغلوب الشرطي أو دبوس الشعر القصير الحمض النووي الريبي (شرنا). بينما الفئران خروج المغلوب توفر نظام متطور لمراقبة الزمانية للجينات-الحذف، توليد جينات الفئران خروج المغلوب ذات العمالة الكثيفة، وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة. وعلاوة على ذلك، جين-الضربة القاضية باستخدام استراتيجيات جزئ ليست قابلة للتطوير بسهولة؛ هذه الاستراتيجيات لا تصلح أيضا لاستجواب جينات عدة بالتوازي. وبعد اكتشاف أساليب تدخل الجيش الملكي النيبالي إلى مرناس الذاتية تدق لأسفل باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA) أو شرنا، بدأت العديد من المجموعات باستخدام تقنيات الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في دور جينات محددة في مجال مكافحة غسل الأموال. منذ خلايا مكافحة غسل الأموال مورين والبشرية على السواء، يصعب ترانسفيكت باستخدام الأساليب التقليدية تعداء على أساس المادة الدهنية، معظم الدراسات شرنا العاملين لينتيفيرالي أو ترميز ريتروفيرالي لدراسة وظيفة الجينات في خلايا مكافحة غسل الأموال. الاكتشاف الأخير لتجمع يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) وثورة nucleases Cas المرتبطة بها (كريسبر-Cas9) استهداف الجين التكنولوجيات1،،من23. استخدام كريسبر-Cas9، جينات معينة أو مناطق الجينوم يمكن حذف، وتحرير أو الموسومة بكفاءة وسهولة. كريسبر-Cas9-تعتمد تحرير الجينات يظهر الآن كأسلوب الاختيار للتحقيق في علاقات التركيب الوراثي للنمط الظاهري في أنواع الخلايا المختلفة بسبب البساطة والفعالية، وانطباق واسع النطاق لهذا الأسلوب. كما أصبحت أساليب كريسبر-Cas9-تعتمد الأسلوب المفضل في مكافحة غسل الأموال، ليس فقط لاستجواب الجينات الفردية، ولكن أيضا كوسيلة لاستهداف جينات متعددة في الشاشات الوراثية المنتشرة أو المجمعة بهدف التحقيق في جينات عدة بالتوازي إمكانات مكافحة غسل الأموال-تبعيات4،،من56.
في هذه المخطوطة، يصف لنا مقايسة نمو تنافسي بسيطة لقياس أثر اضطراب الجينات في نمو خلايا مكافحة غسل الأموال، استناداً إلى مستقر كريسبر-Cas9-بوساطة الجينات تحرير تليها الفائق التدفق الخلوي. هذا الأسلوب بسيطة وفعالة، وقابلة للتطوير للتجارب الإنتاجية المتوسطة للتحقيق في دور الجينات عدة بالتوازي في خلايا مكافحة غسل الأموال.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

وقد استخدمت الدراسات اضطراب الجينات على نطاق واسع التحقيق في دور الجينات الفردية في أمراض مكافحة غسل الأموال. لتحقيق اضطراب الجينات كاملة، قد جعلت العديد من هذه الدراسات استخدام نماذج خروج المغلوب الجينات المعقدة. في حين تقدم هذه الدراسات مع خروج المغلوب الفئران نظاما للتحقيق في علاقات التركيب الوراثي للنمط الظاهري أنيقة واجتازت اختبار الزمن، طريقة سريعة وقابلة للتطوير لتقييم المرشح الجينات التي تلعب دوراً في انتشار خلية مكافحة غسل الأموال أو البقاء على قيد الحياة في نماذج مكافحة غسل الأموال سيساعد على التعجيل باستجواب موازية متعددة الجينات المرشحة. وعززت التقدم الذي أحرز مؤخرا في تكنولوجيا الجينوم تحرير كبير قدرتنا على أداء الاضطرابات الوراثية على نطاق لم يسبق له مثيل. واحد مثل هذا النظام لتحرير الجينوم هو الأسلوب كريسبر-Cas9-تعتمد التي يمكن استخدامها لإجراء تغييرات سريعة وفعالة في جينوم الخلية المستهدفة. بسهولة وقابلية لحذف الجينات كريسبر/Cas9-بوساطة يجعلها واحدة من التقنيات الأكثر جاذبية لاستجواب عدد كبير من الجينات في فحوصات المظهرية. هنا، فإننا نعرض مقايسة بسيطة باستخدام كريسبر/Cas9 بوساطة الجينات-تعطل جنبا إلى جنب مع المنافسة القائمة على التدفق الخلوي الفائق فحوصات للتحقيق في دور الجينات التي قد تلعب دوراً هاما في انتشار أو البقاء على قيد الحياة للإنسان و موريني خطوط خلية مكافحة غسل الأموال.

وفي دراستنا، نحن أولاً ترانسدوسيد MOLM13 البشرية AML الخلية السطر الذي يحمل إزفاء MLL AF9 مع الفيروس عالية-عيار ترميز بلازميد لينتيفيرال Cas9-بلاستيسيدين. في أيدينا، جل المفرز MOLM13-Cas9 الخلايا لم يتم عرض التعبير Cas9 مستوى عال من النشاف الغربية وأيضا لم يكن أداؤها جيدا عند جزيئي للجي?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

هذه المخطوطة وصف أسلوب كريسبر-Cas9-تعتمد متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر (كريسبر) للتحقيق بسيطة وسريعة لدور متعددة الجينات المرشحة في سرطان الدم النقوي الحاد (AML) انتشار الخلايا في موازية. هذه التقنية قابلة للتطوير ويمكن تطبيقها في خطوط خلايا السرطان الأخرى كذلك.

تحقيق تبعيات الجينية باستخدام فحوصات كريسبر-Cas9-تعتمد المنافسة

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

هذا الفيديو سوف تظهر طريقة بسيطة للتحقيق في الجينات مرشح متعددة في مكافحة غسل الأموال في موازاة ذلك، وذلك باستخدام نظام كريسبر كاس9 جنبا إلى جنب مع تحليل التدفق أساس قياس النمو التنافسي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وقابلة للتطوير. إثبات الإجراء سيكون بو روي تشن، وثيقة وظيفة من مختبرنا.يتم استخدام برنامج تصميم CRISPR على الويب لتصميم أربعة إلى ستة RNAs دليل واحد للجين من الفائدة. للبدء، قم بتعبئة المعلومات المناسبة في الحقول باستخدام العلامات النجمية. ثم حدد الجينوم الهدف لتصميم RNA دليل واحد.الصق التسلسل المستهدف في مربع التسلسل، وانقر على زر الإرسال. الاستنساخ في المطلوب دليل واحد RNA التعبير plasmid، prepend النيوكليوتيدات CACC إلى oglionucleotide الشعور وAAAC إلى بقية اديونوكليوتيد العكسية مجانية. ثم يتم طلب الشعور الممززج والمعادية للحس القلاغن من شركة في لوحة 96 بئر ، وصفت Oligo Mix.تعيين منفصلة يو القاع 96 لوحة جيدا، وصفت لوحة الهاليينغ. إعداد مزيج رئيسي من ميكرولتر واحد من T4 متعددة النوكليوتيد كيناز، وميكر واحد من 10x T4 العازلة ربط الحمض النووي، وستة ميكرولترات من الماء في رد فعل التليد. إضافة 8 ميكرولترات من المزيج الرئيسي إلى كل بئر من لوحة الهايينغ، تليها 2 ميكرولتردات من الشعور المخلط مسبقًا و oligonucleotides المضادة للحس.الماصات مرتين إلى ثلاث مرات بلطف لخلط جيدا، ثم تدور لوحة لفترة وجيزة للحصول على يمزج إلى الجزء السفلي من الآبار. استخدم برنامج الـحند التالي في جهاز PCR. 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و95 درجة مئوية لمدة دقيقتين و30 ثانية، يليها تبريد بطيء إلى 22 درجة مئوية بمعدل 0.1 درجة مئوية في الثانية.عندما يكتمل الضم، أعد لوحة 96 بئرًا جديدة، تسمى مزيج أوليغو المخفف، عن طريق تمييع القلوية الفوسفورية والمصلية من رد الفعل الصلب من واحد إلى 200 مع الماء. خطية أحادية توجيه RNA التعبير عن طريق هضم خمسة ميكروغرام من المتجه مع 1.5 ميكرولترات من BBS1 إنزيم تقييد، وذلك باستخدام المخزن المؤقت المناسب في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. المقبل، واتخاذ لوحة جديدة 96 جيدا المسمى لوحة الربط، وإضافة 20 نانوغرام من BBS1 هضم هضم 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000إلى هذا، إضافة 2 ميكرولتردات من القلاغوت المشقوق من لوحة Oligo Mix المخففة. أضف إلى كل بئر، ميكرولتر واحد من 10X T4 العازلة، وميكر واحد من انزيم T4 ligase، وماصات بلطف لخلط. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.حوالي 10 دقائق قبل أن يتم التفاعل الربط، ملء 90 ميكرولترات من الخلايا القولونية المختصة كيميائيا على الجليد. نقل 10 ميكرولتر aliquots من الخلايا المختصة في كل بئر من لوحة 96 جيدا منفصلة على حدة. يضاف خليط الربط إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا المختصة.الماصات صعودا وهبوطا بلطف، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. Pipette خمسة ميكرولترات من مزيج الحمض النووي البكتيريا من كل تفاعل تحويل مباشرة إلى بئر من 6 لوحة بئر، تحتوي على LB أجار مع 100 ملليغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين. إضافة ما يقرب من خمسة إلى ثمانية حبات الزجاج إلى كل بئر، ويهز لوحة 6 جيدا ثماني إلى 10 مرات في حركة دائرية.احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، واختيار واحد إلى اثنين من المستعمرات الفردية من كل بئر، مع تلميح الماصات ميكرولتر 20 معقم، و streak على بقعة وصفت على طبق بتري عقيمة 10 سنتيمترا، مع LB agar و 100 ملليغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين بعد streaking على لوحة LB، وإخراج تلميح في ثلاثة ملليلتر من المتوسط أمبيرلين في 14 ملليلتر أسفل الأنبوبة ، تم وضع علامة على رقم استنساخ البكتيريا المطابق. ثم يتم إرسال لوحة بكتيرية مباشرة لتسلسل سانجر.بعد تأكيد تسلسلي لـ RNAs المستنسخة، طهر الحمض النووي من أنبوب 14 ملليلتر المقابل، باستخدام مجموعة صغيرة الإعدادية وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. يتم إنتاج جزيئات RNA النادسية أحادية الدليل في شكل 96 بئرًا ، كما هو موضح في بروتوكول النص. ويتم تجميد المابير الفيروسية على الفور في ناقص 80 درجة مئوية.قبل يوم واحد من تحويل RNAs دليل واحد في الخلايا AML Cas9، معطف مسطحة أسفل غير الأنسجة الثقافة تعامل 96 لوحة جيدا، مع 100 ملليلتر من الليفية البشرية المؤتلف جزء في تركيز 10 ميكروغرام لكل ملليلتر. التفاف لوحة مع التفاف التشبث لتجنب فقدان التبخر، وتركها على مقاعد البدلاء بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إزالة جزء الليفية البشرية المؤتلف من كل بئر من لوحة 96 جيدا.ذوبان في الفيروسية افرا من كل دليل واحد RNA في درجة حرارة الغرفة. إضافة 50 ميكرولترات من الفيروسية متجاوز من كل أنبوب إلى كل بئر المغلفة من لوحة النقل. التفاف لوحة مع التفاف التشبث لتجنب التلوث المحتمل أثناء الطرد المركزي.تدور لوحة في 1, 300 مرات ز في 35 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. قرب نهاية من ال [سبينفأيشن], عدّ ال [هس 9] عال يعبر يستنسخ [ب3] خلايا من الثقافة قارورة. بعد العد، تدور أسفل العدد المطلوب من الخلايا، و resuspend في وسط جديد.بعد 90 دقيقة spinfection، استخدام ماصة متعددة القنوات تعديلها إلى 50 ميكرولترات لإزالة عظمى من جميع الآبار ببطء عن طريق إمالة لوحة. إضافة 100 ميكرولتر من ثقافة استنساخ الخلايا B3 إلى كل ببطء، والانزلاق إلى أسفل من الحافة. تدور لوحة في 1، 300 مرات ز في 35 درجة مئوية لمدة دقيقتين للسماح للخلايا تستقر إلى أسفل.نقل لوحة إلى 37 درجة مئوية زراعة الأنسجة حاضنة الصف. في اليوم التالي، إضافة 100 ميكرولترات من المتوسطة الطازجة إلى كل بئر تحتوي على دليل واحد RNA الخلايا المستحثة، بحيث يكون حجم المتوسط النهائي 200 ميكرولترات. أعيدوا الصحن إلى الحاضنة.72 ساعة بعد نقل، والتحقق من النسبة المئوية من الجيش الملكي النيبالي دليل واحد يحتوي على الخلايا الإيجابية BFP في كل بئر عن طريق تدفق عملية استئصال الخلايا. استخدام صبغة جدوى الخلية لوضع علامة على الخلايا الميتة واستبعادها من التحليل. مواصلة إعادة طلاء نسبة من الخلايا في آبار جديدة مع المتوسطة الطازجة بعد كل تحليل الحقائق لتجنب فرط النمو أثناء الفحص.كل يومين إلى ثلاثة أيام، كرر تحليل الحقائق للتحقق من النسبة النسبية للخلايا الإيجابية BFP مقارنة مع نظرائهم السلبيين BFP. تحليل النسبة المئوية للخلايا الإيجابية BFP لكل نقطة زمنية، وذلك باستخدام برنامج تحليل الحقائق. مفتاح نجاح تحليل الانتشار التنافسي هو استخدام تقنيات البوابات المناسبة لضمان دقة أرقام الخلايا الحية في نهاية المطاف.اسحب FCS الملفات لكل عينة في البرنامج. انقر نقراً مزدوجاً فوق أي ملف عينة واحد، و قم برسم رسم نقطة من مبعثر إلى الأمام مقابل تشتت الجانب، مع مبعثر إلى الأمام على المحور س، وتشتت جانبي على المحور ص. بوابة جميع الخلايا.انقر نقرا مزدوجا فوق الخلايا المسور، ومؤامرة وصمة عار على محور y مقابل ارتفاع مبعثر إلى الأمام أو منطقة نقطة مؤامرة. بوابة الخلايا السلبية البقعة البقاء. انقر نقراً مزدوجاً فوق الخلايا المباشرة المسورة، وارسم BFP على محور ص مقابل التشتت الأمامي على المحور س.بوابة الخلايا الإيجابية BFP. تطبيق كافة هذه البوابات على كافة العينات عن طريق سحب العينة المحددة إلى كافة العينات تحت علامة التبويب المجموعة. انقر على محرر الجدول لجعل جدول تحليل جميع العينات.اسحب عدد موجب BFP من عينة واحدة إلى الجدول، وانقر فوق زر العرض في محرر الجدول لإنشاء تقرير دفعي لكافة العينات، مع عرض الجدول النسبة المئوية للخلايا الإيجابية BFP. حفظ الجدول كملف Excel. وقد استخدم هذا النظام لدراسة دور الجينات التي قد تلعب دوراً في انتشار أو بقاء خطوط خلايا مكافحة غسل الأموال البشرية والمورين.استهداف AAVS1 مكان آمن الميناء مع اثنين من منفصلة دليل واحد RNAs لم يكن له أي تأثير على انتشار الخلايا البشرية MOM13 Cas9 في المقابل ، عندما تم استهداف الحمض النووي النسخ المتماثل المرتبطة الجينات ، RPA3 ، لوحظ انخفاض تدريجي وكبير في النسبة المئوية للخلايا الإيجابية BFP مقارنة مع النظراء غير المُنقلين السلبيين BFP. وبالمثل، تم اختبار آثار RNAs دليل واحد تستهدف Dot1l، وهو منظم اللاجينية، وRodopsin، جين تصبغ العين، في خلايا MLL-AF9 Cas9 الماوس. دليل واحد RNAs استهداف Dot1l، وأظهرت انخفاضا كبيرا وتدريجيا في الانتشار التنافسي على النقيض من RNAs دليل واحد يستهدف رودpsin.هذه النتائج تبين ضعف MLL-AF9 التعبير عن خلايا سرطان الدم الجماعي لاستنفاد Dot1l, تأكيد النتائج التي نشرت سابقا. على افتراض أربعة إلى ستة RNAs دليل لكل جين، وهذا الأسلوب هو مناسبة تماما لاستخدامها لاختبار ما لا يقل عن 16 إلى 24 الجينات بالتوازي، ويمكن أيضا أن تطبق لاختبار التبعيات الجينات في أي خط الخلايا السرطانية. في حالة وجود عدد أكبر من الجينات، مثل المسار الجزيئي بأكمله الذي يحتاج إلى اختبار في خلايا مكافحة غسل الأموال، سوف تجمع CRISPR-Cas9 الشاشات القائمة تكون أكثر فائدة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

تطوير وصيانة للورم المريض قبل السريرية المستمدة طعم أجنبي نموذج للتحقيق في رواية مكافحة السرطان العلاج

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

تقييم الأيضية للخلايا اللوكيميا الرئيسية

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

الخميرة كهيكل لتطوير الاختبارات الوظيفية لدراسة P53 الإنسان

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

نموذج Xenograft غير متجانس ة من سرطان البنكرياس المستمدة من المريض باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي كمضيفين للتقييم المقارن للأدوية

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...