Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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pcw-cas9 质粒是 eric lander & david sabatini (adgene 质粒 # 50661) 和来自 yusa 实验室的 pklv2-U6gRNA5(BbsI) pgkpuro2abfp-w 质粒 (adusa 基因质粒 #67974) 赠送的礼物。我们要感谢 sbp 医疗发现研究所的流式细胞仪核心在流量分析和分类方面的及时帮助。我们要感谢塔塔夫人纪念基金会对 a. d. 的支持。我们还要感谢以下资金来源的支持: nhh/nci p30 c03030199 癌症中心赞助的赠款、v 基金会和圣地亚哥 nci 癌症中心 (c3) #PTC2017to。

1. 生成具有高稳定性和活性表9表达的 aml 细胞系克隆9
<ol><li>cas9 慢病毒的生产
	<ol>
<li>第0天: 在 dmem 10 毫升中的切片 4x 10 6 293t 细胞, 在生物安全 2级 (bovine) 认证的细胞培养罩中, 用10% 的胎儿牛血清 (fbs) 以及10厘米组织培养盘中的青霉素和 l-谷氨酰胺。将盘子放入37°c 的孵化器中。</li>
		<li>第1天: 在第1天, 镀金的293t 细胞应融合 70%-80%。下午使用以下协议执行转染。</li>
		<li>将...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

在这篇手稿中, 我们描述了一个详细的协议, 用于进行基于 crispr-cas9 的竞争生长检测, 以研究候选基因在 aml 细胞系中的作用, 使用流式细胞仪在人/小鼠 aml 细胞中的作用 (图 5)。该分析的目的是在中等吞吐量的范围内, 确定基因缺失对维持两到三周反洗钱细胞增殖的影响。需要认真遵循一些关键步骤, 以促进扩大所述议定书的规模。在 cas9 慢病毒的生产中, 有必要通过0.45μm 过?...

在过去的几十年里, 已经有了许多研究工作, 重点是确定关键分子途径在急性髓系白血病 (aml) 发病机制中的贡献。传统上, aml 细胞中的基因破坏是使用有条件的敲除小鼠或短发针 rna (shrna) 进行的。虽然敲除小鼠提供了一个复杂的系统, 用于在时空上控制基因缺失, 而产生基因敲除小鼠则是劳动密集型、耗时且昂贵的。此外, 使用重组策略的基因淘汰也不容易扩展;这些策略并不适合平行地对几个基因进行审讯。在发现 rna 干扰方法以使用小干扰 rna (sirna) 或 shrna 敲除内源性 mrna 后, 许多组开始使用 rna 干扰技术来研究特定基因在 aml 中的作用。由于使用传统的脂质转染方法很难转染小鼠和人的 aml 细胞, 因此大多数研究都使用 lentiv 或逆转录病毒编码的 shrna 来研究 aml 细胞的基因功能。最近发现的聚集定期间隔的短回文重复 (crispr) 和相关的 cas 核酸酶 (crispr-cas9) 使基因靶向技术1、2、3发生了革命性的变化。使用 crispr-cas9, 可以删除、编辑或标记特定的基因或基因组区域, 高效和轻松。基于 crispr-cas9 的基因编辑由于该技术的简单性、有效性和广泛适用性, 目前正在成为研究不同细胞类型中基因组学到表型关系的首选方法。基于 crispr-cas9 的方法也正在成为 aml 中的首选方法, 这不仅是为了询问单个基因, 也是一种针对排列或汇集的基因屏幕中的多个基因的方法, 目的是将多个基因作为潜在的平行调查aml 依赖关系 4,5,6。
在这篇手稿中, 我们描述了一个简单的竞争增长分析, 用于测量基因破坏对 aml 细胞生长的影响, 基于稳定的 crispr-cas9 介导的基因编辑, 然后是高通量流式细胞术。该方法简单、高效, 可扩展到中等吞吐量实验, 用于研究多个基因在反洗钱细胞中的并行作用。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

基因摄动研究已被广泛用于研究单个基因在 aml 发病机制中的作用。为了实现完全的基因破坏, 这些研究中的许多都利用了复杂的基因敲除模型。虽然这些针对敲除小鼠的研究为研究基因组学与表型的关系提供了一个优雅且久经考验的系统, 但这是一种快速且可扩展的方法, 用于评估在 aml 模型中发挥 aml 细胞增殖或存活作用的候选基因将有助于加速对多个候选基因的平行审讯。最近在基因组编辑技术方面取得的进展大大提高了我们以前所未有的规模执行基因扰动的能力。其中一个基因组编辑系统是基于 crispr-cas9 的方法, 可用于在目标细胞基因组中进行快速有效的改变。crisprs9 介导的基因缺失的易用性和可扩展性使其成为在表型检测中询问大量基因的最有吸引力的技术之一。在这里, 我们提出了一个简单的方法, 使用 crispr/cas9 介导的基因破坏结合高通量流-细胞仪的竞争分析, 以研究基因的作用, 可能发挥重要作用, 在人类的增殖或生存和小鼠 aml 细胞系。

在我们的研究中, 我们首先转移了包含 mll-af9 病毒编码卡西-乳酸病毒质粒的 mll-af9 移位的 molm13 人 aml 细胞系。在我们手中, 散装未分类的 molm13-cas9 细胞没有显示出高水平的 cas9 表达的西方印迹, 也没有表现良好, 当检测有效的基因编辑使用上述方法7。因此, 我们开始建立单细胞克隆体, 只选择西方印迹所看到的高水平 cas9 克隆体 (图 1</strong...

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Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

这份手稿描述了一种基于群集的规则间的短半突 (crispr) crispr-cas9 方法, 用于简单而快速地调查多个候选基因在急性髓样白血病 (aml) 细胞增殖中的作用。并行。这种技术是可扩展的, 也可以应用于其他癌症细胞系。

基于 crispr-cas9 的竞争检测对遗传依赖性的调查

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

本视频将演示一个简单的方法，用于同时研究 AML 中的多个候选基因，使用 Crisper-Cas9 系统结合基于流式细胞学的竞争生长测定。这种技术的主要优点是它快速和可扩展。演示这个程序的将是博瑞陈，一个后医生从我们实验室。基于 Web 的 CRISPR 设计软件用于为感兴趣的基因设计四到六个单导 RNA。首先，在字段中用星号填写相应的信息。然后选择目标基因组进行单导RNA设计。将目标序列粘贴到序列框中，然后单击提交按钮。对于所需单导RNA表达质粒中的克隆，将核苷酸CACC预至感性蛋白核苷酸和AAAC，以反向互补的寡感寡核苷酸。预混合感和反义寡核苷酸然后从一家公司订购在96井板，标签的奥利戈混合。设置一个单独的 U-底部 96 井板，标记退体板。准备一个T4多核苷酸激酶的微升，一个10xT4 DNA结扎缓冲液的微升，以及每一个退火反应6微升水的主混合。在退火板的每个井中加入8个主混合物的微升，然后是2个预混合感和反义寡核苷酸的微升。移液两到三次轻轻地混合好，然后短暂旋转板，使混合到井底。在 PCR 机器中使用以下退火程序。37摄氏度，30分钟，95摄氏度，2分30秒，然后以0.1摄氏度/秒的速度缓慢冷却至22摄氏度。退火完成后，准备一个新的96井板，标记为稀释的Oligo混合，通过稀释磷酸和退火的寡核苷酸从退火反应1至200用水。利用BBS1限制酶的1.5微升，在37摄氏度下使用适当的缓冲液，在37摄氏度下使用适当的缓冲液，在2小时内消化5微克的载体，使单导RNA表达载体线性化。接下来，采取一个新的96井板标记结扎板，并添加20纳米的BBS1消化单导RNA表达载体到一个井每个所需的单导RNA结扎。为此，从稀释的寡糖混合板中加入2微升磷酸化退火寡核苷酸。添加到每个井中，一个微升的10X T4连体缓冲液，一个微升的T4连体酶，轻轻移液器混合。在室温下孵育板两小时。在结扎反应完成前约10分钟，在冰上填充90微升化学能力大肠杆菌细胞。将主管细胞的10微升等分分别转移到单独的96井板的每个井中。将结扎混合物加入含有称职细胞的井中。轻轻上下移液，在室温下孵育10分钟。移液5微升的细菌DNA混合从每个转化反应直接到一个6井板的井，含有LB汞与100毫克每毫升安西林。在每个井中加入大约 5 到 8 个玻璃珠，并在圆周运动中摇动 6 孔板 8 到 10 次。在37摄氏度下孵育板过夜。第二天，从每孔中挑选一到两个单菌落，用无菌的 20 微升移液器尖端，将其条纹到无菌 10 厘米培养皿上的标签点上，用 LB agar 和每毫升安皮林 100 毫克条纹到 LB 板上后，将尖端喷射成 14 毫升圆底管中的三毫升安西林介质，标有相应的细菌克隆编号。然后直接将细菌板送去进行桑格测序。克隆单导RNA的序列确认后，根据制造商的说明，使用微型试剂盒从相应的14毫升管中纯化DNA。单导RNA扁病毒粒子以96井格式产生，如文本协议中所述。病毒上一级在零下80摄氏度后立即被冻结。在 AML Cas9 细胞中转导单导RNA的一天前一天，涂上经过处理的 96 井板的平底非组织培养物，用 100 毫升重组的人类纤维素片段，浓度为每毫升 10 微克。用粘附包装板，以避免蒸发损失，并放在长凳上过夜。第二天，从96井板的每个井中去除重组的人类纤维素片段。在室温下解冻每个引导RNA的病毒上一个。将 50 微升的病毒上一液从每个管添加到转导板的每个涂层井中。用粘附包装板，以避免离心过程中的潜在污染。在35摄氏度下以1，300倍g旋转板，90分钟。在自旋感染接近尾声时，计算从培养瓶中表达克隆 B3 细胞的高 Cas9。计算后，向下旋转所需数量的细胞，并在新鲜介质中重新发送。在 90 分钟的自旋感染后，使用调整为 50 微升的多通道移液器，通过倾斜板缓慢地从所有孔中去除上流水。将克隆 B3 细胞培养的 100 微升缓慢地添加到每个井中，从边缘向下滑动。在35摄氏度下以1，300倍g旋转板两分钟，让细胞稳定到底部。将板转移到37摄氏度的组织培养等级培养箱。第二天，向每个含有单导RNA转导细胞的井中加入100微升的新鲜介质，使最终的介质体积为200微升。将盘子返回孵化器。转导后72小时，通过流式细胞测量检查每个井中含有BFP阳性细胞的单导RNA的百分比。使用细胞活力染料从分析中标记和排除死细胞。每次事实分析后，继续用新鲜介质将一部分细胞重新镀入新井中，以避免在分析过程中过度生长。每两到三天，重复事实分析，以检查BFP阳性细胞与BFP负细胞的相对比例。使用事实分析软件分析每个时间点的 BFP 阳性细胞百分比。竞争增殖检测成功的关键是使用适当的门控技术，以确保最终的活细胞数是准确的。将每个示例的 FCS 文件拖动到软件中。双击任何一个样本文件，绘制向前散射与侧散射的点图，在 x 轴上绘制向前散点，在 y 轴上绘制侧散点。门所有的细胞。双击封闭单元格，并在 y 轴上绘制可行性污渍，与向前散射高度或区域点图。门的生存能力染色阴性细胞。双击封闭活动单元，并在 y 轴上绘制 BFP，在 x 轴上绘制向前散射。门的BFP阳性细胞。通过将所选样本拖动到组选项卡下的所有样本，将所有这些门应用于所有示例。单击表编辑器，制作所有示例的分析表。将 BFP 正计数从一个样本拖动到表中，然后单击表编辑器中的显示按钮以创建所有样本的批处理报告，该表显示 BFP 正单元格的百分比。将表另存为 Excel 文件。该系统用于研究基因的作用，可能发挥作用的增殖或生存的人类和穆林ML细胞系。以AAVS1安全港位点为目标，使用两个独立的单导RNA对人类 MOM13 Cas9 细胞的增殖没有影响。同样，在小鼠MLL-AF9 Cas9细胞中测试了单导RNA针对多普1l（表观遗传调节器）和眼色素沉着基因罗多普辛（Rhodopsin）的效果。单一指南RNA针对Dot1l，显示竞争扩散的戏剧性和渐进性下降，而单一指南RNA的目标是罗多普辛。这些结果表明，MLL-AF9表示大规模白血病细胞对Dot1l耗竭的脆弱性，证实了先前公布的结果。假设每个基因有4到6个引导RNA，此方法非常适合用于同时测试至少16到24个基因，并且它也可用于测试任何癌细胞系中的基因依赖性。在更多的基因的情况下，如整个分子通路，需要在反洗钱细胞测试，池CRISPR-Cas9为基础的屏幕将更有用。

Research

JoVE Journal

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患者衍生的胰腺癌异质异种移植模型,使用斑马鱼幼虫作为比较药物评估的宿主

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...