Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

PCW-Cas9 plasmid var en gave fra Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmid # 50661) og pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmid fra Yusa lab (Addgene plasmid #67974. Vi vil gerne takke flowcytometri core på SBP medicinske opdagelse Institute for rettidig hjælp med flow analyse og sortering. Vi vil gerne anerkende støtten af Lady Tata Memorial Foundation til A.D. Vi vil gerne også anerkender støtten fra de følgende finansieringskilder: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponsoreret Grant, V-Foundation og San Diego NCI Cancer Centre (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. generere AML celle linje kloner med højt udtryk af stabile og aktiv Cas9
<ol><li>Produktion af Cas9 lentivirus
	<ol>
<li>Dag 0: Plade 4 x 106 293T celler i 10 mL af DMEM med 10% føtal bovint serum (FBS) og penicillin og L-glutamin i en 10 cm vævskultur fad i en biosikkerhed niveau 2 (BSL2) certificeret celle kultur hætte. Placer fadet i et 37 ° C inkubator.</li>
		<li>Dag 1: Forgyldt 293T celler bør være 70 – 80% sammenflydende på dag 1. Udføre Transfektion ved hjælp af følge...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

I dette manuskript beskriver vi en detaljeret protokol til at foretage en CRISPR-Cas9-baserede konkurrencedygtig vækst analyse for at undersøge rollen af kandidat gener i AML cellelinjer hjælp flowcytometri fra human/murine AML celler (figur 5). Målet med analysen er at identificere effekten af gen sletning på vedligeholdelse af AML celleproliferation over to til tre uger på en medium-overførselshastighed skala. Nogle kritiske trin skal følges nøje for at lette optrapning af den bes...

De sidste par årtier har set talrige forskningsindsats fokuseret på at identificere centrale molekylære veje i akut myeloid leukæmi (AML) patogenese bidrag. Gen-forstyrrelser i AML celler har traditionelt udført ved hjælp af betingede knockout mus eller kort-hårnål RNA (shRNA). Mens knockout mus tilbyder et sofistikeret system for spatio-temporale kontrol af gen-sletning, er generere gen knockout mus arbejdskrævende, tidskrævende og dyrt. Desuden gen-udskæringer ved hjælp af rekombination strategier er ikke let skalerbare; disse strategier egner ikke sig godt til afhøring af flere gener i parallel. Efter opdagelsen af RNA interferens metoder til knock-down endogene mRNAs ved hjælp af små interfererende RNA (siRNA) eller shRNA, begyndte mange grupper ved hjælp af RNA interferens teknikker til at undersøge rollen af specifikke gener i AML. Da både murine og menneskelige AML celler er notorisk vanskeligt at transfect ved hjælp af traditionelle lipid-baserede Transfektion metoder, de fleste undersøgelser ansat lentivirally eller Retroviralt kodet shRNA for at studere genfunktion i AML celler. Den nylige opdagelse af grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) og de tilknyttede Cas nukleaser (CRISPR-Cas9) har revolutioneret gen-targeting teknologier1,2,3. Ved hjælp af CRISPR-Cas9, kan specifikke gener eller genomisk regioner slettes, redigeres eller markeret med effektivitet og lethed. CRISPR-Cas9-baseret gen-redigering er nu fremstår som den foretrukne metode til undersøgelse af genotype-fænotype relationer i forskellige celletyper på grund af enkelhed, effektivitet og bred anvendelighed af denne teknik. CRISPR-Cas9-baserede metoder bliver også metoden til valg i AML, ikke kun for spørgekriterierne enkelte gener, men også som en måde til at målrette flere gener i klædt eller poolede genetiske skærme med henblik på at undersøge flere gener parallelt som potentielle AML-afhængigheder4,5,6.
I dette manuskript beskriver vi en simpel konkurrencedygtig vækst assay for måling af virkningen af gen-forstyrrelser på væksten af AML celler, baseret på stabile CRISPR-Cas9-medieret gen-redigering efterfulgt af høj overførselshastighed flowcytometri. Denne metode er enkel, effektiv og skalerbar til medium-overførselshastighed eksperimenter for at undersøge rollen af flere gener parallelt i AML celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

Gen undertrykkelse af netbårne undersøgelser har været flittigt brugt til at undersøge rollen af enkelte gener i AML patogenese. For at opnå komplet gen forstyrrelser, mange af disse studier har gjort brug af komplekse gen knockout modeller. Mens disse undersøgelser med knockout mus tilbyder en elegant og tid-testet systemet for at undersøge genotype-fænotype relationer, en hurtig og skalerbar metode til vurdering af kandidat gener, spille en rolle i AML celledelingen eller overlevelse i AML modeller vil medvirke til at fremskynde den parallelle forhør af flere kandidat gener. De seneste fremskridt i genom-redigering teknologier har dramatisk forbedret vores evne til at udføre genetiske forstyrrelser på et hidtil uset omfang. Et sådant system af genom-redigering er den CRISPR-Cas9-baseret metode, der kan bruges til at foretage hurtige og effektive ændringer i target cell genom. Den lethed og skalerbarhed af CRISPR/Cas9-medieret gen-sletning gør det en af de mest attraktive teknikker for afhøring af et stort antal gener i fænotypiske assays. Her præsenterer vi en simpel analyse ved hjælp af CRISPR/Cas9 medieret gen-forstyrrelser kombineret med høj overførselshastighed flow-flowcytometri-baserede konkurrence assays til at undersøge rollen af gener, der kan spille en vigtig rolle i udbredelsen eller overlevelsen af menneskelige og murine AML cellelinjer.

I vores undersøgelse transduced vi først MOLM13 menneskelige AML cellelinje, der bærer MLL AF9 omplantning med høj titer virus kodning Cas9-blasticidin lentiviral plasmid. I vores hænder beskrevet bulk usorteret MOLM13-Cas9 celler ikke vise højt niveau Cas9 udtryk af Western blotting og også ikke udføre godt når analyseres for effektiv gen redigering-ved hjælp af metoden tidligere7. Derfor, vi fortsatte med at etablere enkelt celle kloner og kun vælge kl...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Dette manuskript beskriver en grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske gentager (CRISPR) CRISPR-Cas9-baseret metode for enkel og hurtig undersøgelse af flere kandidat gener i akut Myeloid leukæmi (AML) celledelingen i rolle parallel. Denne teknik er skalerbar og kan anvendes i andre kræft cellelinjer så godt.

Undersøgelse af genetiske afhængigheder ved hjælp af CRISPR-Cas9-baserede konkurrence Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Denne video vil demonstrere en enkel metode til at undersøge flere kandidat gener i AML parallelt, ved hjælp af Crisper-Cas9 system kombineret med flow cytometri baseret konkurrencedygtige vækst assay. Den største fordel ved denne teknik er, at det er hurtigt og skalerbart. Demonstration af proceduren vil være Bo Rui Chen, en post doc fra vores laboratorium.En webbaseret CRISPR design software bruges til at designe fire til seks enkelt guide RNAs for genet af interesse. Til at begynde med skal du udfylde de relevante oplysninger i felterne med stjerner. Vælg derefter målgenomet for enkelt guide RNA design.Indsæt målsekvensen i sekvensfeltet, og klik på knappen Send. For kloning i det ønskede enkelt guide RNA udtryk plasmid, prepend nukleotider CACC til forstand oglionucleode og AAAC til den omvendte gratis antisense oligonucleotid. Forblandet fornuft og antisense oligonukleotider bestilles derefter fra et firma i en 96 brøndplade, mærket Oligo Mix.Sæt en separat U-Bottom 96 brøndplade, mærket Annealing Plate. Forbered en master blanding af en mikroliter T4 polynukleotid kinase, en microliter af 10x T4 DNA ligation buffer, og seks mikroliter vand pr glødende reaktion. Tilføj 8 mikroliter af master mix til hver brønd af Annealing Plate, efterfulgt af 2 mikroliter af forblandet forstand og antisense oligonukleotider.Pipette to til tre gange forsigtigt at blande godt, og drej derefter pladen kort for at få blandingerne til bunden af brøndene. Brug følgende udglødningsprogram i en PCR-maskine. 37 grader Celsius i 30 minutter, 95 grader Celsius i to minutter og 30 sekunder, efterfulgt af langsom afkøling til 22 grader Celsius med en hastighed på 0,1 grader Celsius per sekund.Når udglødning er færdig, forberedes en frisk 96 brøndplade, mærket Fortyndet Oligo Mix, ved at fortynde de fosforylerede og udglødede oligonukleotider fra glødereaktionen 1 til 200 med vand. Lineariser den enkelte guide RNA-ekspressionsvektor ved at fordøje fem mikrogram vektor med 1,5 mikroliter af BBS1-begrænsningsenzym ved hjælp af en passende buffer ved 37 grader Celsius i to timer. Dernæst skal du tage en frisk 96 godt plade mærket Ligation Plate, og tilsæt 20 nanogram af BBS1 fordøjet enkelt guide RNA udtryk vektor til en brønd pr ønskede enkelt guide RNA ligation.Til dette tilsættes 2 mikroliter fosforylerede udglødede oligonukleotider fra den fortyndede Oligo Mix plade. Tilføj til hver brønd, en mikroliter af 10X T4 ligase buffer, og en microliter af T4 ligase enzym, og forsigtigt pipette til at blande. Indkube pladen ved stuetemperatur i to timer.Ca. 10 minutter før ligationsreaktionen er færdig, Fyld 90 mikroliter af kemisk kompetente E.coli celler på is. Overfør 10 mikroliter aliquots af de kompetente celler i hver brønd af en separat 96 brøndplade individuelt. Tilsæt ligationsblandingen i brøndene, der indeholder de kompetente celler.Pipette forsigtigt op og ned, og inkubere ved stuetemperatur i 10 minutter. Pipette fem mikroliter af bakterierNE DNA mix fra hver transformation reaktion direkte ind i en brønd af en 6 godt plade, der indeholder LB agar med 100 milligram pr. milliliter ampicillin. Tilføj cirka fem til otte glasperler til hver brønd, og ryst 6 brøndpladen otte til 10 gange i en cirkulær bevægelse.Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius natten over. På den følgende dag, vælge en til to enkelte kolonier fra hver brønd, med en steril 20 mikrolit pipette spids, og streak det på en mærket plet på en steril 10 centimeter petriskål, med LB agar og 100 mg pr. milliliter ampicillin Efter striber på LB plade, skubbe spidsen i tre milliliter ampicillin medium i en 14 milliliter bunddel , markeret med det tilsvarende bakterieklonnummer. Bakteriepladen sendes derefter direkte til Sanger-sekvensering.Efter en sekvens bekræftelse af den klonede enkelt guide RNA'er, rense DNA fra den tilsvarende 14 milliliter rør, ved hjælp af en miniprep kit i henhold til producentens anvisninger. Enkelt guide RNA lentivirale partikler produceres i et 96 brøndformat, som beskrevet i tekstprotokollen. Og den virale supernatant fryses straks ved minus 80 grader Celsius.En dag før transduktion af enkelt guide RNA'er i AML Cas9 celler, pels en flad bund ikke væv kultur behandlet 96 godt plade, med 100 milliliter rekombinant humanfibrinctin fragment ved en koncentration på 10 mikrogram pr milliliter. Wrap pladen med plastfolie for at undgå fordampning tab, og lad det på bænken natten over. Den følgende dag fjernes det rekombinant menneskelige fibronectinfragment fra hver brønd af 96 brøndpladen.Tø den virale supernatant af hver enkelt guide RNA ved stuetemperatur. Tilsæt 50 mikroliter viral supernatant fra hvert rør til hver belagt brønd af transduktionspladen. Wrap pladen med plastfolie for at undgå potentiel forurening under centrifugering.Drej pladen ved 1, 300 gange g ved 35 grader Celsius i 90 minutter. Mod slutningen af spinfædet skal du tælle de høje Cas9-udtryk for klon B3-celler fra kulturkolben. Efter optælling, spin ned det nødvendige antal celler, og resuspenderet i frisk medium.Efter 90 minutters spinfektion skal du bruge en multikanalpipette justeret til 50 mikroliter for at fjerne supernatanten fra alle brøndene langsomt ved at vippe pladen. Tilføj 100 mikroliter af kulturen i klon B3 celler til hver brønd langsomt, glider ned fra fælgen. Drej pladen ved 1, 300 gange g ved 35 grader Celsius i to minutter for at lade cellerne sætte sig til bunden.Overfør pladen til en 37 grader Celsius væv kultur grade inkubator. Den følgende dag tilsættes 100 mikroliter frisk medium til hver brønd, der indeholder enkelt guide RNA transduced celler, således at det endelige medium volumen er 200 mikroliter. Returner pladen til inkubatoren.72 timer efter transduktion skal du kontrollere procentdelen af enkelt guide RNA, der indeholder BFP-positive celler i hver brønd ved flowcytometri. Brug en celle levedygtighed farvestof til at markere og udelukke døde celler fra analysen. Fortsæt re-plating en del af cellerne i nye brønde med frisk medium efter hver fakta analyse for at undgå overvækst under analysen.Hver anden til tredje dag gentages faktaanalysen for at kontrollere den relative andel af BFP-positive celler sammenlignet med BFP-negative modstykker. Analysér procentdelen af BFP-positive celler for hvert tidspunktspunkt ved hjælp af en faktaanalysesoftware. Nøglen til succes for den konkurrencedygtige spredning assay er at bruge den rette gating teknikker til at sikre, at den endelige levende celle numre er korrekte.Træk FCS-filer for hvert eksempel ind i softwaren. Dobbeltklik på en prøvefil, og afbild et punktdiagram med fremadsede punkt i forhold til side scatter med fremadspedrem på x-aksen og sidespr. på y-aksen. Gate alle cellerne.Dobbeltklik på de indhegnede celler, og plot levedygtighed plet på y-akse versus fremad scatter højde eller område prik plot. Gate levedygtigheden plet negative celler. Dobbeltklik på de indhegnede levende celler, og plot BFP på y-aksen versus fremad scatter på x-aksen.Gate BFP positive celler. Anvend alle disse porte på alle prøverne ved at trække den valgte prøve til alle prøver under gruppefanen. Klik på bordeditoren for at lave en analysetabel over alle prøverne.Træk BFP-positivtaltallet fra et eksempel til tabellen, og klik på visningsknappen i tabeleditoren for at oprette en batchrapport over alle eksemplerne, hvor tabellen viser procentdelen af BFP-positive celler. Gem tabellen som en Excel-fil. Dette system blev brugt til at undersøge den rolle, som gener, der kan spille en rolle i spredning eller overlevelse af menneskelige og murine AML cellelinjer.Målretning af AAVS1 safe-harbor locus med to separate enkelt guide RNAs havde ingen effekt på spredningen af humane MOM13 Cas9 celler I modsætning, når DNA replikation associerede gen, RPA3, blev målrettet, en progressiv og betydelig nedgang i procentdelen af BFP positive celler i forhold til BFP negative utransmitterede modparter blev observeret. Tilsvarende, virkningerne af enkelt guide RNAs rettet mod Dot1l, en epigenetisk regulator, og Rhodopsin, øjet pigmentering genet, blev testet i mus MLL-AF9 Cas9 celler. Single guide RNAs rettet mod Dot1l, viste en dramatisk og progressiv nedgang i konkurrencespredning i modsætning til enkelt guide RNAs rettet mod Rhodopsin.Disse resultater viser sårbarheden af MLL-AF9 udtrykke masse leukæmi celler til Dot1l udtynding, bekræfter tidligere offentliggjorte resultater. Antages fire til seks guide RNA'er pr gen, denne metode er velegnet til at blive brugt til at teste mindst 16 til 24 gener parallelt, og det kan også anvendes til at teste genafhængigheder i enhver kræftcellelinje. I tilfælde af et større antal gener, såsom en hel molekylær vej, der skal testes i AML-celler, pool CRISPR-Cas9 baserede skærme vil være mere nyttigt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Analyser til Undersøgelse makrofag og Mikroglia Stimulering af glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Udvikling og vedligeholdelse af et præklinisk Patient Afledt Tumor xenograftmodel for undersøgelse af Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Vurdering af primære leukæmiceller metaboliske profil

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Gær som et chassis til udvikling af funktionelle assays til undersøgelse af humane P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-afledt heterogene xenograft model af kræft i bugspytkirtlen ved hjælp af Zebrafish larver som værter for sammenlignende Lægemiddelvurdering

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...