Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Het plasmide pCW-Cas9 was een geschenk van Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmide # 50661) en de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmide van de Yusa lab (Addgene plasmide #67974. We bedank de Stroom Cytometry kern bij SBP medische ontdekking Instituut voor tijdige hulp bij flow analyse en sorteren. We willen graag erkentelijk voor de steun van de Lady Tata Memorial Stichting A.D. We willen graag ook erkentelijk voor de steun van de volgende financieringsbronnen: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center gesponsord Grant, de V-Stichting en de San Diego NCI kanker centra (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. genereren AML cel lijn klonen met hoge uitdrukking van stabiele en actieve Cas9
<ol><li>Productie van Cas9 lentivirus
	<ol>
<li>Dag 0: Plaat 4 x 106 293T cellen in 10 mL DMEM met 10% foetale runderserum (FBS) en penicilline en L-glutamine in een 10 cm weefselkweek schotel in een biosafety Level 2 (BSL2) gecertificeerd cel cultuur kap. Plaats de schotel in een 37 ° C incubator.</li>
		<li>Dag 1: De vergulde 293T cellen moet 70 – 80% heuvels op dag 1. Het uitvoeren van de transfectie met...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een concurrerende groei op basis van CRISPR-Cas9-assay voor het onderzoek naar de rol van kandidaat-genen in AML cellijnen stroom cytometry, waarbij in menselijk/RattenUitrustingen AML cellen (Figuur 5). Het doel van de test is het identificeren van het effect van verwijdering van het gen op onderhoud van AML celproliferatie meer dan twee tot drie weken op de schaal van een middellange-doorvoer. Sommige kritis...

De afgelopen decennia hebben gezien tal van onderzoeksinspanningen gericht op het identificeren van de bijdrage van belangrijke moleculaire pathways in acute myeloïde leukemie (AML) pathogenese. Traditioneel, is gen-verstoring van AML cellen uitgevoerd met behulp van voorwaardelijke knock-out muizen of korte-haarspeld RNA (shRNA). Terwijl de knock-out muizen bieden een geavanceerde systeem voor spatio-temporele controle van gen-verwijdering, is het genereren van gene knock-out muizen arbeidsintensief, tijdrovend en duur. Bovendien, gen-uitsparingen met behulp van recombinatie strategieën is niet gemakkelijk schaalbare; deze strategieën doen niet lenen zich goed voor de ondervraging van meerdere genen in parallel. Na de ontdekking van RNA interferentie methoden om endogene mRNAs knock-down met Klein Mengend RNA (siRNA) of shRNA, vele groepen gestart met behulp van RNA interferentie technieken te onderzoeken van de rol van specifieke genen in AML. Aangezien zowel menselijke als lymfkliertest AML cellen zijn notoir moeilijk te transfect met behulp van traditionele lipide gebaseerde transfectie methoden, bestudeert de meeste werknemers lentivirally of retrovirally-gecodeerde shRNA voor het bestuderen van de genfunctie in AML cellen. De recente ontdekking van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) en de bijbehorende Cas nucleasen (CRISPR-Cas9) heeft een revolutie teweeggebracht in gentargeting technologieën1,2,3. Met behulp van CRISPR-Cas9, specifieke genen of genomic regio's kunnen worden verwijderd, bewerkt of gelabeld met efficiëntie en gemak. CRISPR-Cas9-gebaseerde gen-bewerken is nu in opkomst als de methode van keuze voor het onderzoeken van genotype-naar-fenotype relaties in diverse celtypen te wijten aan de eenvoud, doeltreffendheid en brede toepasbaarheid van deze techniek. CRISPR Cas9-gebaseerde methoden zijn ook steeds de methode van keuze in AML, niet alleen voor afzonderlijke genen ondervragen, maar ook als een manier om zich te richten op meerdere genen in gekleed of gegroepeerde genetische schermen gericht onderzoekt verschillende genen parallel als potentieel AML-dependencies4,5,6.
In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige concurrerende groei assay voor het meten van de impact van gen-verstoringen op de groei van AML cellen, gebaseerd op stabiele CRISPR-Cas9-gemedieerde gene bewerken gevolgd door high-throughput stroom cytometry. Deze methode is eenvoudig, efficiënt en schaalbaar tot middellange-doorvoer experimenten om de rol van meerdere genen parallel in AML cellen te onderzoeken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

Gene perturbation studies zijn uitvoerig gebruikt om de rol van afzonderlijke genen in AML pathogenese te onderzoeken. Voor het bereiken van volledige gene verstoring, hebben veel van deze studies gebruik van complexe gene knock-out modellen. Deze studies met knock-out muizen bieden een elegante en beproefde systeem voor het onderzoeken van genotype-naar-fenotype relaties, een snelle en schaalbare methode voor de beoordeling van kandidaat-genen die spelen een rol in AML celproliferatie of overleven in AML modellen zal helpen versnellen de parallelle ondervraging van meerdere kandidaat-genen. Recente vooruitgang in de genoom-bewerken technologieën hebben ons vermogen tot het uitvoeren van genetische verstoringen op een ongekende schaal dramatisch verbeterd. Een dergelijk systeem voor het bewerken van het genoom is de CRISPR-Cas9-gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het maken van snelle en effectieve wijzigingen in het genoom van de cel doelgroep. Het gemak en de schaalbaarheid van CRISPR/Cas9-gemedieerde gen-verwijdering maakt het een van de meest aantrekkelijke technieken voor de ondervraging van een groot aantal genen in fenotypische testen. Hier presenteren we een eenvoudige test met behulp van CRISPR/Cas9 gemedieerde gen-verstoring gecombineerd met hoge gegevensdoorvoer stroom cytometry-gebaseerde mededinging testen te onderzoeken van de rol van genen die een belangrijke rol in de verspreiding spelen kan of overleving van mens en lymfkliertest AML cellijnen.

In onze studie transduced we eerst de MOLM13 menselijke AML cellijn die draagt de translocatie MLL-AF9 met hoge-titer virus codering van de Cas9-blasticidin lentivirale plasmide. In onze handen beschreven bulk ongesorteerde MOLM13-Cas9 cellen ging niet hoog niveau Cas9 expressie weergeven door het westelijke bevlekken en ook presteerde niet goed wanneer vehiculumcontrolegroep efficiënte gene bewerken-met behulp van de methode eerder7. Dus overgegaan we tot het ste...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Dit manuscript wordt een geclusterde regelmatig Interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) CRISPR-Cas9-gebaseerde methode voor eenvoudige en snelle onderzoek van de rol van meerdere kandidaat-genen in Acute myeloïde leukemie (AML) celproliferatie in beschreven parallel. Deze techniek is schaalbaar en kan worden toegepast in andere kanker cel beeldlijnen.

Onderzoek naar genetische afhankelijkheden met behulp van CRISPR-Cas9-concurrentie op basis van testen

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Deze video toont een eenvoudige methode voor het onderzoeken van meerdere kandidaat-genen in AML parallel, met behulp van de Crisper-Cas9 systeem in combinatie met de stroom cytometrie gebaseerde concurrerende groeitest. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel en schaalbaar is. Het aantonen van de procedure zal Bo Rui Chen zijn, een postdoc van ons lab.Een web gebaseerde CRISPR ontwerp software wordt gebruikt om vier tot zes enkele gids RNAs ontwerpen voor het gen van belang. Vul om te beginnen de juiste informatie in de velden met sterretjes in. Selecteer vervolgens het doelgenoom voor het RNA-ontwerp met één gids.Plak de doelreeks in het volgordevak en klik op de knop Verzenden. Voor het klonen in de gewenste gids RNA expressie plasmid, prepend de nucleotiden CACC aan de zin oglionucleotide en AAAC aan de omgekeerde gratis antisense oligonucleotide. Voorgemengde zin en antisense oligonucleotiden worden vervolgens besteld bij een bedrijf in een 96 put plaat, gelabeld Oligo Mix.Zet een aparte U-Bottom 96 putplaat, gelabeld Annealing Plate. Bereid een master mix van een microliter van T4 polynucleotide kinase, een microliter van 10x T4 DNA ligatie buffer, en zes microliters van water per gloeiende reactie. Voeg 8 microliters van de master mix toe aan elke put van de Annealing Plate, gevolgd door 2 microliter voorgemengde zin en antisense oligonucleotiden.Pipette twee tot drie keer voorzichtig om goed te mengen, en draai de plaat kort om de mixen naar de bodem van de putten te krijgen. Gebruik het volgende annealing-programma in een PCR-machine. 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, 95 graden Celsius gedurende twee minuten en 30 seconden, gevolgd door langzame koeling tot 22 graden Celsius met een snelheid van 0,1 graden Celsius per seconde.Wanneer de annealing is voltooid, bereid een verse 96 put plaat, gelabeld Verdunde Oligo Mix, door het verdunnen van de fosforyleerde en geannealed oligonucleotiden uit de gloeiende reactie een tot 200 met water. Lineariseer de single guide RNA-expressievector door vijf microgram van de vector te verteren met 1,5 microliter BBS1-beperkingsenzym, met behulp van een geschikte buffer bij 37 graden Celsius gedurende twee uur. Neem vervolgens een verse 96 goed plaat gelabeld Ligation Plate, en voeg 20 nanogram van de BBS1 verteerde enkele gids RNA expressie vector aan een goed per gewenste gids RNA ligatie.Voeg hiervoor 2 microliter fosforgeyleerde geannealde oligonucleotiden toe aan de verdunde Oligo Mix-plaat. Voeg aan elke put, een microliter van 10X T4 ligase buffer, en een microliter van T4 ligase enzym, en zachtjes pipette te mengen. Broed de plaat twee uur lang op kamertemperatuur.Ongeveer 10 minuten voordat de ligatiereactie is uitgevoerd, Vul 90 microliters van chemisch competente E.coli cellen op ijs. Breng 10 microliter aliquots van de bevoegde cellen in elke put van een aparte 96 put plaat individueel. Voeg het ligatiemengsel toe aan de putten die de bevoegde cellen bevatten.Pipet op en neer zachtjes, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Pipette vijf microliters van de bacteriën DNA mix van elke transformatie reactie direct in een put van een 6 put plaat, met LB agar met 100 milligram per milliliter ampicilline. Voeg ongeveer vijf tot acht glazen kralen aan elke put, en schud de 6 put plaat acht tot 10 keer in een cirkelvormige beweging.Incubeer de platen op 37 graden Celsius 's nachts. Op de volgende dag, kies een tot twee enkele kolonies uit elke put, met een steriele 20 microliter pipette tip, en streep het op een gelabelde plek op een steriele 10 centimeter petrischaal, met LB agar en 100 milligram per milliliter van ampicilline Na strepen op de LB plaat, eject de tip in drie milliliter ampicilline medium in een 14 milliliter bodem buis , gemarkeerd met het overeenkomstige bacteriële kloonnummer. De bacteriële plaat wordt dan direct verzonden voor Sanger sequencing.Na een sequentie bevestiging van de gekloonde single guide RNAs, zuiveren het DNA van de overeenkomstige 14 milliliter buis, met behulp van een miniprep kit volgens de instructies van de fabrikant. Single guide RNA lentiviral deeltjes worden geproduceerd in een 96 put formaat, zoals beschreven in het tekstprotocol. En de virale supernatant wordt onmiddellijk bevroren bij min 80 graden Celsius.Een dag voorafgaand aan de transductie van enkele gids RNAs in AML Cas9 cellen, coat een platte bodem niet weefsel cultuur behandeld 96 put plaat, met 100 milliliter van recombinant menselijke fibronectine fragment bij een concentratie van 10 microgram per milliliter. Wikkel de plaat met vastklampen wrap om verdamping verlies te voorkomen, en laat het op de bank 's nachts. Op de volgende dag, verwijder de recombinant menselijke fibronectin fragment uit elke put van de 96 put plaat.Ontdooi de virale supernatant van elke gids RNA bij kamertemperatuur. Voeg 50 microliters virale supernatant van elke buis aan elke gecoate put van de transductieplaat. Wikkel de plaat met vastklampen wrap om mogelijke besmetting tijdens centrifugatie te voorkomen.Draai de plaat op 1, 300 keer g bij 35 graden Celsius gedurende 90 minuten. Tegen het einde van de spinfectie, tel de hoge Cas9 uitdrukken kloon B3 cellen uit de cultuur kolf. Na het tellen, spin het vereiste aantal cellen, en resuspend in vers medium.Gebruik na de spinfectie van 90 minuten een meerkanaals pipet aangepast aan 50 microliter om de supernatant langzaam uit alle putten te verwijderen door de plaat te kantelen. Voeg 100 microliter van de cultuur van kloon B3 cellen aan elke goed langzaam, naar beneden glijden van de velg. Draai de plaat op 1, 300 keer g bij 35 graden Celsius gedurende twee minuten om de cellen te laten settelen naar de bodem.Breng de plaat naar een 37 graden Celsius weefsel cultuur rang incubator. Voeg de volgende dag 100 microliter vers medium toe aan elke put met afzonderlijke RNA-transduceerde cellen, zodat het uiteindelijke gemiddelde volume 200 microliters is. Breng de plaat terug naar de couveuse.72 uur na de transductie, controleer het percentage van de enkele gids RNA met BFP positieve cellen in elke put door de stroom cytometrie. Gebruik een cel levensvatbaarheid kleurstof te markeren en uit te sluiten dode cellen van de analyse. Ga na elke feitenanalyse verder met het opnieuw plating van een deel van de cellen in nieuwe putten met vers medium om overgroei tijdens de test te voorkomen.Elke twee tot drie dagen herhaalt u de feitenanalyse om het relatieve aandeel van BFP-positieve cellen te controleren in vergelijking met de bfp-negatieve tegenhangers. Analyseer het percentage BFP-positieve cellen voor elk tijdpunt, met behulp van een analysesoftware voor feiten. De sleutel tot het succes van de concurrerende proliferatie test is het gebruik van de juiste gating technieken om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke live cel nummers nauwkeurig zijn.Sleep FCS-bestanden voor elk monster naar de software. Dubbelklik op een voorbeeldbestand en plot een puntplot van voorwaartse spreiding versus zijverstrooiing, met voorwaartse spreiding op de x-as en zijverstrooiing op de y-as. Bek je alle cellen.Dubbelklik op de gated cellen, en plot levensvatbaarheid vlek op de y-as versus voorwaartse spreiding hoogte of gebied stip plot. Poort de levensvatbaarheid vlek negatieve cellen. Dubbelklik op de gated live cellen en plot BFP op de y-as versus forward scatter op de x-as.Poort de BFP positieve cellen. Pas al deze poorten toe op alle monsters door het geselecteerde monster naar alle voorbeelden onder het groepstabblad te slepen. Klik op de tabeleditor om een analysetabel te maken van alle voorbeelden.Sleep het positieve BFP-aantal van het ene voorbeeld naar de tabel en klik op de weergaveknop in de tabeleditor om een batchrapport van alle voorbeelden te maken, waarbij de tabel het percentage BFP-positieve cellen weergeeft. Sla de tabel op als een excel-bestand. Dit systeem werd gebruikt om de rol van genen te onderzoeken die een rol kunnen spelen in de proliferatie of overleving van menselijke en murine AML-cellijnen.Gericht op de AAVS1 safe-harbor locus met twee afzonderlijke single guide RNAs had geen effect op de proliferatie van menselijke MOM13 Cas9 cellen Daarentegen, toen het DNA-replicatie geassocieerd gen, RPA3, werd gericht, een geleidelijke en significante daling van het percentage BFP-positieve cellen in vergelijking met de BFP negatieve niet-getransduceerde tegenhangers werd waargenomen. Ook de effecten van single guide RNAs gericht op Dot1l, een epigenetische regulator, en Rhodopsine, het oogpigmentatiegen, werden getest in muis MLL-AF9 Cas9 cellen. Single guide RNAs gericht op Dot1l, toonde een dramatische en progressieve daling van de concurrentie proliferatie in tegenstelling tot enkele gids RNAs gericht rhodopsine.Deze resultaten tonen de kwetsbaarheid aan van de MLL-AF9 die massa leukemiecellen uitdrukt tot Dot1l-uitputting, wat eerder gepubliceerde resultaten bevestigt. Uitgaande van vier tot zes gids RNAs per gen, deze methode is zeer geschikt om te worden gebruikt voor het testen van ten minste 16 tot 24 genen in parallel, en het kan ook worden toegepast op het testen van genafhankelijkheden in een kankercellijn. In het geval van een groter aantal genen, zoals een hele moleculaire route die moet worden getest in AML-cellen, zal pool CRISPR-Cas9 gebaseerde schermen nuttiger zijn.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Ontwikkeling en onderhoud van een preklinisch Patient Afgeleid Tumor xenograft model voor onderzoek naar nieuwe anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Door patiënten afgeleid heterogeen xenograft-model van pancreaskanker met behulp van zebravis larven als gastheer voor vergelijkende geneesmiddelenbeoordeling

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...