Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Le plasmide de pCW-Cas9 était un cadeau de Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmide 50661 #) et le pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plasmide W du labo Yusa (plasmide #67974 de Addgene. Nous tenons à remercier le noyau de la cytométrie en flux SBP Medical Discovery Institute pour une aide opportune avec analyse en flux et tri. Nous tenons à souligner le soutien de la Lady Tata Memorial Foundation AP. j.-c. Nous tenons à remercier également les sources de financement suivantes : NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center parrainé par Grant, la Fondation-V et les San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. générer AML Cell Line Clones avec forte Expression de Cas9 Stable et Active
<ol><li>Production de Cas9 lentivirus
	<ol>
<li>Jour 0 : Plaque 4 x 106 293 t cells dans 10 mL de DMEM avec 10 % sérum fœtal (SVF) et de la pénicilline et de L-glutamine dans un plat de culture de tissu de 10 cm dans un niveau 2 de biosafety (BSL2) certifié hotte de culture cellulaire. Placer le plat dans un incubateur à 37 ° C.</li>
		<li>Jour 1 : Les cellules 293 t plaqué devraient être 70 – 80 % a...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour effectuer un test de croissance compétitive CRISPR dotés de Cas9 pour enquêter sur le rôle des gènes candidats dans des lignées cellulaires AML cytométrie-dans les cellules humaines/murin AML (Figure 5). L’objectif du test est d’identifier l’effet de la suppression du gène sur l’entretien de la prolifération cellulaire AML pendant deux à trois semaines sur une échelle de débit moyen. Certaines étapes ...

Les dernières décennies ont vu les nombreux efforts de recherche axés sur l’identification de la contribution des principales voies moléculaires dans la pathogenèse de la leucémie myéloïde aiguë (AML). Traditionnellement, disruption de génique dans les cellules de Lam a été réalisée à l’aide de la souris knock-out conditionnel ou court-hairpin RNA (Sharn). Tandis que chez des souris knockout offrent un système sophistiqué de contrôle spatio-temporelle de la délétion de gène, générant des souris knockout gène est fastidieux, long et coûteux. En outre, gène-coups de grâce à l’aide de stratégies de recombinaison n’est pas facilement évolutive ; ces stratégies ne se prêtent pas bien à l’interrogatoire de plusieurs gènes en parallèle. Après la découverte de méthodes d’interférence ARN à l’ARNm endogène de précipitation à l’aide de petits ARN interférents (siARN) ou Sharn, nombreux groupes a commencé à utiliser des techniques de RNA interference pour enquêter sur le rôle des gènes spécifiques dans AML. Puisque les cellules AML murins et humains sont notoirement difficiles à transfecter à l’aide de méthodes de transfection de lipides à base traditionnelle, la plupart des études Sharn lentivirally salarié ou codé en retrovirally pour étudier la fonction des gènes dans les cellules de l’AML. La découverte récente de cluster régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions (CRISPR) et les nucléases de Cas connexes (CRISPR-Cas9) a révolutionné les technologies de ciblage de gène1,2,3. En utilisant CRISPR-Cas9, certains gènes ou régions génomiques peuvent être supprimées, sous la direction ou le tag avec efficacité et facilité. CRISPR Cas9-gène-modification basée est en train d’émerger comme la méthode de choix pour l’étude des relations génotype-phénotype à dans les types de cellules différentes en raison de la simplicité, l’efficacité et large applicabilité de cette technique. Méthodes CRISPR dotés de Cas9 deviennent aussi la méthode de choix des AML, non seulement pour interroger des gènes individuels, mais aussi comme une façon de cibler des gènes multiples dans les écrans génétiques rangés ou centralisées visant à enquêter sur plusieurs gènes en parallèle comme potentiel AML-dépendances4,5,6.
Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un dosage simple croissance compétitive pour mesurer l’impact de la gène-perturbation sur la croissance des cellules de l’AML, selon stable CRISPR-Cas9-mediated gene édition suivie par cytométrie en flux haut débit. Cette méthode est simple, efficace et évolutive à débit moyen des expériences pour étudier le rôle de plusieurs gènes en parallèle dans les cellules de l’AML.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

Études de perturbation de gènes ont été utilisés intensivement pour enquêter sur le rôle des gènes individuels dans la pathogenèse de l’AML. Pour la réalisation complète du gène perturbation, beaucoup de ces études ont fait l’utilisation de modèles knock-out gène complexe. Bien que ces études sur des souris knockout offrent un système élégant et ayant fait leurs preuves pour enquêter sur les relations génotype-phénotype à, une méthode rapide et évolutive pour l’évaluation des gènes candidats qui jouent un rôle dans la prolifération cellulaire AML ou la survie dans les modèles AML aidera à accélérer l’interrogatoire parallèle de plusieurs gènes candidats. Les progrès récents dans les technologies de modification du génome ont amélioré considérablement notre capacité à effectuer des perturbations génétiques à une échelle sans précédent. Un tel système de modification du génome est la méthode CRISPR dotés de Cas9 qui permet d’effectuer des modifications rapides et efficaces dans le génome de cellules cibles. La simplicité et l’évolutivité des CRISPR/Cas9-mediated gene-suppression rend une des techniques plus attrayants pour l’interrogatoire d’un grand nombre de gènes dans des tests phénotypiques. Nous présentons ici un essai simple avec CRISPR/Cas9 médiée par gène-perturbation combinée à haut-débit débit-cytometry-concurrence fondée sur les dosages d’enquêter sur le rôle des gènes qui peuvent jouer un rôle important dans la prolifération ou la survie de l’homme et lignées de cellules murines AML.

Dans notre étude, nous avons tout d’abord transduites la MOLM13 humaine AML lignée qui porte la translocation de MLL-AF9 avec haut-titre virus codant le plasmide lentiviraux Cas9-blasticidine. Dans nos mains, en vrac non triées de cellules MOLM13-Cas9 ne manifestaient pas de haut niveau d’expression Cas9 Western Blot et n’a pas exécuté aussi bien quand le dosage efficace gène édition-à l’aide de la méthode décrite précédemment7. Par conséquent,...

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Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Ce manuscrit décrit une méthode de base CRISPR-Cas9 de groupés régulièrement entrecoupées court palindromique répète (CRISPR) pour une enquête rapide et simple du rôle de plusieurs gènes candidats à la prolifération des cellules de la leucémie myéloïde aiguë (AML) Parallèlement. Cette technique est évolutive et peut être appliquée dans les autres lignées cellulaires cancéreuses ainsi.

Enquête de dépendances génétiques utilisant la concurrence fondée sur les Cas9-CRISPR

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Cette vidéo démontrera une méthode simple pour étudier plusieurs gènes candidats dans AML en parallèle, en utilisant le système Crisper-Cas9 combiné avec l’analyse de croissance compétitive basée sur la cytométrie de flux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide et évolutive. La démonstration de la procédure sera Bo Rui Chen, un post-doc de notre laboratoire.Un logiciel de conception CRISPR basé sur le Web est utilisé pour concevoir quatre à six ARN guide unique pour le gène d’intérêt. Pour commencer, remplissez les informations appropriées dans les champs avec des astérisques. Sélectionnez ensuite le génome cible pour la conception d’ARN guide unique.Coller la séquence cible dans la boîte de séquence, et cliquez sur le bouton soumettre. Pour le clonage dans le plasmide d’expression d’ARN guide unique désiré, prépendez les nucléotides CACC au sens oglionucleotide et AAAC à l’oligonucléotide antisensé gratuit inverse. Le sens prémémixisé et les oligonucléotides antisens sont ensuite commandés auprès d’une entreprise dans une plaque de puits 96, étiquetée Oligo Mix.Mettez en place une plaque de puits U-Bottom 96 séparée, étiquetée Annealing Plate. Préparez un mélange maître d’un microlitre de kinase polynucléotide T4, d’un microlitre de tampon de ligature de l’ADN 10x T4 et de six microlitres d’eau par réaction annealing. Ajouter 8 microlitres du mélange maître à chaque puits de la plaque Annealing, suivi de 2 microlitres de sens prémémixisé et d’oligonucléotides antisens.Pipette deux à trois fois doucement pour bien mélanger, puis faire tourner la plaque brièvement pour obtenir les mélanges au fond des puits. Utilisez le programme d’annealage suivant dans une machine PCR. 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, 95 degrés Celsius pendant deux minutes et 30 secondes, suivi d’un refroidissement lent à 22 degrés Celsius à une vitesse de 0,1 degré Celsius par seconde.Lorsque l’annelage est terminé, préparer une assiette fraîche de 96 puits, étiquetée Mélange Oligo dilué, en diluant les oligonucléotides phosphorylatés et annelés de la réaction annealing un à 200 avec de l’eau. Linéariser le vecteur d’expression de l’ARN guide unique en digérant cinq microgrammes du vecteur avec 1,5 microlitres d’enzyme de restriction BBS1, à l’aide d’un tampon approprié à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, prenez une plaque de Ligation fraîche de 96 plaques bien étiquetées, et ajoutez 20 nanogrammes du vecteur d’expression d’ARN guide unique digéré BBS1 à un puits par ligature d’ARN guide unique désirée.À cela, ajouter 2 microlitres d’oligonucléotides annelés phosphorylatés de la plaque oligo mix diluée. Ajouter à chaque puits, un microlitre de tampon ligase 10X T4, et un microlitre d’enzyme ligase T4, et doucement pipette à mélanger. Incuber la plaque à température ambiante pendant deux heures.Environ 10 minutes avant la fin de la réaction de ligature, remplissez 90 microlitres de cellules E.coli chimiquement compétentes sur la glace. Transférer 10 aliquots microlitres des cellules compétentes dans chaque puits d’une plaque de puits séparée de 96 individuellement. Ajouter le mélange de ligature dans les puits contenant les cellules compétentes.Pipette de haut en bas doucement, et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Pipette cinq microlitres de la bactérie MÉLANGE D’ADN de chaque réaction de transformation directement dans un puits d’une plaque de 6 puits, contenant de l’agar LB avec 100 milligrammes par millilitre d’ampicilline. Ajouter environ cinq à huit perles de verre à chaque puits et secouer la plaque de 6 puits huit à dix fois dans un mouvement circulaire.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, choisissez une à deux colonies simples de chaque puits, avec une pointe stérile de pipette de 20 microlitres, et striez-la sur une tache étiquetée sur une boîte de Pétri stérile de 10 centimètres, avec une agar LB et 100 milligrammes par millilitre d’ampicilline Après striage sur la plaque LB, éjecter la pointe en trois millilitres de milieu ampicilline dans un tube de fond rond de 14 millilitres , marqué du nombre de clones bactériens correspondant. La plaque bactérienne est ensuite envoyée directement pour le séquençage sanger.Après une confirmation de séquence du guide unique cloné ARN, purifier l’ADN à partir du tube correspondant de 14 millilitres, à l’aide d’un kit miniprep selon les instructions du fabricant. Les particules lentivirales à ARN guide unique sont produites dans un format de 96 puits, tel que décrit dans le protocole de texte. Et le supernatant viral est immédiatement gelé à moins 80 degrés Celsius.Un jour avant la transduction des ARN de guide simple dans les cellules cas9 d’AML, enrober une culture non tissulaire plate de fond traitée 96 plaque de puits, avec 100 millilitres de fragment humain recombinant de fibronectine à une concentration de 10 microgrammes par millilitre. Enveloppez la plaque d’une pellicule pour éviter la perte d’évaporation et laissez-la sur le banc pendant la nuit. Le lendemain, retirez le fragment de fibronectine humaine recombinante de chaque puits de la plaque de puits 96.Décongeler le supernatant viral de chaque ARN guide unique à température ambiante. Ajouter 50 microlitres de supernatant viral de chaque tube à chaque puits enduit de la plaque de transduction. Envelopper la plaque d’une pellicule obstruée pour éviter une contamination potentielle pendant la centrifugation.Faire tourner la plaque à 1300 fois g à 35 degrés Celsius pendant 90 minutes. Vers la fin de la spinfection, comptez les hautes cellules De Cas9 exprimant le clone B3 de la fiole de culture. Après le comptage, faites tourner le nombre requis de cellules et réutilisez-les dans un milieu frais.Après la spinfection de 90 minutes, utilisez une pipette multicanal ajustée à 50 microlitres pour enlever le supernatant de tous les puits lentement en inclinant la plaque. Ajouter 100 microlitres de la culture des cellules B3 clone à chaque puits lentement, glissant vers le bas de la jante. Faites tourner la plaque à 1 300 g à 35 degrés Celsius pendant deux minutes pour laisser les cellules s’installer au fond.Transférer la plaque dans un incubateur de qualité de culture tissulaire de 37 degrés Celsius. Le lendemain, ajouter 100 microlitres de milieu frais à chaque puits contenant des cellules transduced à ARN guide unique, de sorte que le volume moyen final est de 200 microlitres. Remettre l’assiette à l’incubateur.72 heures après la transduction, vérifiez le pourcentage d’ARN guide unique contenant des cellules positives BFP dans chaque puits par cytométrie d’écoulement. Utilisez un colorant de viabilité cellulaire pour marquer et exclure les cellules mortes de l’analyse. Continuer à re-placage d’une proportion des cellules dans de nouveaux puits avec un milieu frais après chaque analyse des faits pour éviter la prolifération pendant l’analyse.Tous les deux à trois jours, répétez l’analyse des faits pour vérifier la proportion relative de cellules positives bfp par rapport aux homologues négatifs BFP. Analyser le pourcentage de cellules positives BFP pour chaque point de temps, à l’aide d’un logiciel d’analyse des faits. La clé du succès de l’essai de prolifération concurrentiel est d’utiliser les techniques de gating appropriées pour s’assurer que les nombres éventuels de cellules vivantes sont exacts.Faites glisser les fichiers FCS pour chaque échantillon dans le logiciel. Double clic sur n’importe quel fichier d’échantillon, et tracer une parcelle de point de dispersion vers l’avant par rapport à la dispersion latérale, avec scatter vers l’avant sur l’axe x, et la dispersion latérale sur l’axe y. Portez toutes les cellules.Double clic sur les cellules fermée, et tracez la tache de viabilité sur l’axe y par rapport à la hauteur de dispersion avant ou à la parcelle de point de zone. Portez la tache de viabilité des cellules négatives. Double clic sur les cellules vivantes fermées, et tracer BFP sur l’axe y par rapport à la dispersion vers l’avant sur l’axe x.Portez les cellules positives BFP. Appliquez toutes ces barrières à tous les échantillons en faisant glisser l’échantillon sélectionné sur tous les échantillons sous l’onglet groupe. Cliquez sur l’éditeur de table pour faire une table d’analyse de tous les échantillons.Faites glisser le compte positif BFP d’un échantillon à la table, et cliquez sur le bouton d’affichage dans l’éditeur de table pour créer un rapport de lot de tous les échantillons, avec la table affichant le pourcentage de cellules positives BFP. Enregistrez la table en tant que fichier Excel. Ce système a été utilisé pour étudier le rôle des gènes qui peuvent jouer un rôle dans la prolifération ou la survie des lignées cellulaires humaines et murines de la LAM.Cibler le lieu de refuge AAVS1 avec deux ARN à guide unique distinct n’a eu aucun effet sur la prolifération des cellules humaines MOM13 Cas9 En revanche, lorsque le gène associé à la réplication de l’ADN, RPA3, a été ciblé, on a observé une baisse progressive et significative du pourcentage de cellules positives BFP par rapport aux homologues négatifs non traduits du BFP. De même, les effets des ARN à guide unique ciblant Dot1l, un régulateur épigénétique, et rhodopsine, le gène de pigmentation oculaire, ont été testés dans les cellules MLL-AF9 Cas9 de souris. Les ARN à guide unique ciblant Dot1l ont montré une baisse spectaculaire et progressive de la prolifération de la concurrence, contrairement aux ARN à guide unique ciblant la rhodopsine.Ces résultats démontrent la vulnérabilité de la MLL-AF9 exprimant les cellules leucémiques de masse à l’épuisement de Dot1l, confirmant des résultats précédemment édités. En supposant que quatre à six ARN guides par gène, cette méthode est bien adaptée pour être utilisée pour tester au moins 16 à 24 gènes en parallèle, et elle peut également être appliquée pour tester les dépendances génétiques dans n’importe quelle lignée cellulaire cancéreuse. Dans le cas d’un plus grand nombre de gènes, tels qu’une voie moléculaire entière qui doit être testée dans les cellules de la LAM, les écrans à base de CRISPR-Cas9 seront plus utiles.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Développement et maintenance d&#39;une tumeur du patient Préclinique dérivé modèle de xénogreffe de l&#39;enquête de Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Épreuves d’imagerie de cellules vivantes pour étude glioblastome Brain Tumor Stem Cell Migration et Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for la Variation génétique chez un Patient sporadiques de la polypose adénomateuse familiale en utilisant le Format de puce-in-a-tube

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Levure comme un châssis pour le développement des essais fonctionnels pour étudier l'homme P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Modèle de xénogreffe hétérogène dérivé par le patient du cancer du pancréas à l'aide de larves de poisson zèbre comme hôtes pour l'évaluation comparative des médicaments

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...