Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Das pCW-Cas9-Plasmid war ein Geschenk von Eric Lander & David Sabatini (Addgene Plasmid # 50661) und die pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W-Plasmid aus dem Labor Yusa (Addgene Plasmid #67974. Wir möchten die Durchflusszytometrie Kern bei SBP Medical Discovery Institute für rechtzeitige Hilfe mit Flow-Analyse und Sortierung zu danken. Wir würden gerne die Unterstützung der Lady Tata Memorial Foundation n. anerkennen Wir möchten auch die Unterstützung der folgenden Finanzierungsquellen anerkennen: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center gesponsert Grant, der V-Stiftung und der San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. Erzeugung von AML Linie Zellklonen mit hohe Expression von stabilen und aktive Cas9
<ol><li>Produktion von Cas9 lentivirus
	<ol>
<li>Tag 0: Platte 4 x 106 293T Zellen in 10 mL DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und Penicillin und L-Glutamin in einer 10 cm Gewebe Kulturschale in einem Biosafety Level 2 (BSL2) zertifiziert Zelle Kultur Haube. Legen Sie die Schale in einem Inkubator 37 ° C.</li>
		<li>Tag 1: Die vergoldeten 293T Zellen sollte 70 – 80 % Zusammenfluss am 1. Tag. Führ...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

In diesem Manuskript beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Durchführung eines CRISPR-Cas9-basierte Konkurrenzfähigkeit Assays untersucht die Rolle von Kandidatengenen in AML Zelllinien mit Flow-Zytometrie in Human/Murine AML Zellen (Abbildung 5). Das Ziel des Tests ist die Wirkung des Gens Löschung auf Wartung der AML Zellproliferation über zwei bis drei Wochen im Maßstab des Medium-Durchsatz zu identifizieren. Einige wichtige Schritte müssen sorgfältig befolgt werden, ...

Die letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Forschungsanstrengungen konzentriert sich auf die Ermittlung des Beitrags der wichtigsten molekularen Signalwege in der Pathogenese der akuten myeloischen Leukämie (AML) gesehen. Traditionell wurde gen-Störung in AML Zellen mit bedingter Knockout-Mäusen oder kurze Haarnadel RNA (ShRNA) durchgeführt. Knockout-Mäusen bieten ein ausgeklügeltes System für die räumlich-zeitliche Steuerung von gen-Löschung, ist Generierung von gen-Knockout-Mäusen arbeitsintensiv, zeitaufwändig und teuer. Darüber hinaus gen-Knockouts mit Rekombination Strategien ist nicht leicht skalierbar; Diese Strategien eignen nicht sich gut für die Befragung mehrerer Gene parallel. Nach der Entdeckung der RNA Interferenz-Methoden, um Knock-down endogenen mRNAs mit kleinen interferierende RNA (SiRNA) oder ShRNA begannen viele Gruppen mit RNA Interferenz Techniken, um die Rolle bestimmter Gene in AML zu untersuchen. Da murine und menschlichen AML-Zellen sind notorisch schwierig zu transfizieren, mit traditionellen Lipid-basierte Transfektion Methoden, die meisten Studien angestellt lentivirally oder retrovirally-codierte ShRNA für Genfunktion in AML Zellen zu studieren. Die jüngste Entdeckung der gruppierten regelmäßig dazwischen kurzer palindromische Wiederholungen (CRISPR) und die zugehörigen Cas Nukleasen (CRISPR-Cas9) hat gen-targeting Technologien1,2,3revolutioniert. CRISPR-Cas9 verwenden, können bestimmte Gene oder genomische Regionen gelöscht, bearbeitet oder mit dem Stichwort Effizienz und Benutzerfreundlichkeit. CRISPR-Cas9-basierte gen-Bearbeitung taucht nun als die Methode der Wahl für die Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in unterschiedlichen Zelltypen aufgrund der Einfachheit, die Wirksamkeit und die breite Anwendbarkeit dieser Technik. CRISPR-Cas9-basierte Methoden sind auch immer die Methode der Wahl in AML, nicht nur für Abfragen einzelner Gene, sondern auch als eine Möglichkeit, mehrere Gene in angeordneten oder zusammengefasste genetische Schirme Ziel angestrebt untersucht mehrere Gene parallel als Potenzial AML-Abhängigkeiten4,5,6.
In diesem Manuskript beschreiben wir eine einfache Konkurrenzfähigkeit Test zur Messung der Auswirkungen von gen-Störung auf das Wachstum der AML Zellen, basierend auf stabile CRISPR-Cas9-vermittelten gen-Bearbeitung gefolgt von Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie. Diese Methode ist einfach, effizient und skalierbar bis Medium-Durchsatz Experimente zur Untersuchung der Rolle von mehreren Genen in AML Zellen parallel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

Gen Störung Studien sind weitgehend benutzt worden, um die Rolle einzelner Gene in AML-Pathogenese zu untersuchen. Für das komplette gen Störung erreichen, haben viele dieser Studien gemacht komplexe gen Knockout Modelle verwenden. Während dieser Studien mit Knockout-Mäusen eine elegante und bewährte System zur Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehung bieten, eine schnelle und skalierbare Methode zur Bewertung von Kandidatengenen, die spielen eine Rolle bei der AML Zellproliferation oder Überleben in AML Modelle hilft die parallele Abfrage des mehrere Kandidaten-Gene zu beschleunigen. Jüngste Fortschritte in der Genom-Bearbeitung Technologien haben unsere Leistungsfähigkeit genetische Störungen in nie gekanntem Ausmaß dramatisch verbessert. Ein solches System der Genom-Bearbeitung ist die CRISPR-Cas9-basierte Methode, die rasche und wirksame Änderungen im Genom Ziel-Zelle verwendet werden kann. Die Einfachheit und Skalierbarkeit der CRISPR/Cas9-vermittelte gen-Löschung macht es eine der attraktivsten Techniken für die Befragung einer Vielzahl von Genen in phänotypische Tests. Hier stellen wir einen einfache Assay mit CRISPR/Cas9 vermittelte gen-Störung kombiniert mit Hochdurchsatz-Flow-Zytometrie-based Wettbewerb Assays, um die Rolle der Gene, die eine wichtige Rolle bei der Verbreitung spielen kann oder das Überleben der Menschen zu untersuchen und murine AML-Zell-Linien.

In unserer Studie ausgestrahlt wir zuerst die MOLM13 menschlichen AML-Zelllinie, die die MLL-AF9 Translokation mit hoher Titer Virus Codierung der Cas9-Blasticidin Lentivirale Plasmids trägt. In unseren Händen beschriebenen Schüttgut unsortierte MOLM13-Cas9-Zellen wurden hohe Niveau Cas9 Ausdruck durch westliche Beflecken nicht angezeigt und auch nicht ausführen wenn für effiziente gen bearbeiten-mit der Methode untersucht zuvor7. Daher gingen wir zu einzelnen...

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Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Dieses Manuskript beschreibt eine gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt (CRISPR) CRISPR-Cas9-basierte Methode für eine einfache und rasche Untersuchung der Rolle der mehrere Kandidaten-Gene in der akuten myeloischen Leukämie (AML) Zellproliferation in Parallel. Diese Technik ist skalierbar und kann in anderen Krebszelllinien angewendet werden.

Untersuchung der genetischen Abhängigkeiten mit CRISPR-Cas9-Wettbewerb-Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Dieses Video zeigt eine einfache Methode zur parallelen Untersuchung mehrerer Kandidatengene in AML unter Verwendung des Crisper-Cas9-Systems in Kombination mit dem strömungszytometriebasierten Wettbewerbswachstumstest. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie schnell und skalierbar ist. Demonstrieren sie das Verfahren wird Bo Rui Chen, ein Post-Doc aus unserem Labor.Eine webbasierte CRISPR-Designsoftware wird verwendet, um vier bis sechs einzelne Führungs-RNAs für das Gen von Interesse zu entwerfen. Geben Sie zunächst die entsprechenden Informationen in die Felder mit Sternchen ein. Wählen Sie dann das Zielgenom für das RNA-Design mit einer einzigen Führung aus.Fügen Sie die Zielsequenz in das Sequenzfeld ein, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Absenden". Zum Klonen im gewünschten Single-Guide-RNA-Expressionsplasmid setzen Die Nukleotide CACC dem Sinnesoglionukleotid und AAAC dem umgekehrten komplementären Antisense-Oligonukleotid voran. Vorgemischte Sinn- und Antisense-Oligonukleotide werden dann bei einer Firma in einer 96-Well-Platte mit der Bezeichnung Oligo Mix bestellt.Legen Sie eine separate U-Bottom 96 Well Platte mit der Bezeichnung Annealing Plate fest. Bereiten Sie eine Master-Mischung aus einem Mikroliter T4-Polynukleotidkinase, einem Mikroliter 10x T4 DNA-Ligationspuffer und sechs Mikroliter Wasser pro Glühreaktion vor. Fügen Sie 8 Mikroliter der Master-Mischung zu jedem Brunnen der Glühenden Platte hinzu, gefolgt von 2 Mikrolitern vorgemischten Sinnessinns und Antisense-Oligonukleotiden.Pipette zwei bis dreimal sanft gut zu mischen, und dann drehen Sie die Platte kurz, um die Mischungen auf den Boden der Brunnen zu bekommen. Verwenden Sie das folgende Glühprogramm in einer PCR-Maschine. 37 Grad Celsius für 30 Minuten, 95 Grad Celsius für zwei Minuten und 30 Sekunden, gefolgt von langsamer Abkühlung auf 22 Grad Celsius bei einer Geschwindigkeit von 0,1 Grad Celsius pro Sekunde.Wenn das Glühen abgeschlossen ist, bereiten Sie eine frische 96 Brunnenplatte mit der Bezeichnung Diluted Oligo Mix vor, indem Sie die phosphorylierten und geglühten Oligonukleotide aus der Glühreaktion eins bis 200 mit Wasser verdünnen. Linearisieren Sie den single guide RNA Expression Vector, indem Sie fünf Mikrogramm des Vektors mit 1,5 Mikroliter n.B. BBS1-Restriktionsenzym verdauen und dabei einen geeigneten Puffer bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden verwenden. Als nächstes nehmen Sie eine frische 96 Well Platte mit der Bezeichnung Ligation Plate, und fügen Sie 20 Nanogramm des BBS1 verdaute Single Guide RNA Expressions Vektor zu einem gut pro gewünschten Single Guide RNA Ligation hinzu.Dazu 2 Mikroliter phosphorylierte gegonukleotide aus der verdünnten Oligo-Mix-Platte. Fügen Sie zu jedem Brunnen, einen Mikroliter 10X T4 Ligase Puffer, und ein Mikroliter T4 Ligase-Enzym, und sanft Pipette zu mischen. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Stunden.Etwa 10 Minuten vor der Ligationsreaktion 90 Mikroliter chemisch kompetenter E.coli-Zellen auf Eis füllen. 10 Mikroliter-Aliquots der zuständigen Zellen einzeln in jeden Brunnen einer separaten 96-Wellplatte übertragen. Fügen Sie die Ligationsmischung in die Brunnen, die die zuständigen Zellen enthalten.Pipette sanft auf und ab und bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren. Pipette fünf Mikroliter der Bakterien DNA mischen aus jeder Transformationsreaktion direkt in einen Brunnen einer 6-Well-Platte, enthält LB Agar mit 100 Milligramm pro Milliliter Ampicillin. Fügen Sie etwa fünf bis acht Glasperlen zu jedem Brunnen hinzu und schütteln Sie die 6 Wellplatte acht- bis zehnmal in einer kreisförmigen Bewegung.Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Am nächsten Tag, wählen Sie ein bis zwei einzelne Kolonien aus jedem Brunnen, mit einer sterilen 20 Mikroliter Pipettenspitze, und streifen Sie es auf eine beschriftete Stelle auf einer sterilen 10 Zentimeter Petrischale, mit LB Agar und 100 Milligramm pro Milliliter Ampicillin Nach dem Streichen auf die LB-Platte, werfen Sie die Spitze in drei Milliliter Ampicillin Medium in einem 14 Milliliter runden Unterrohr , mit der entsprechenden bakteriellen Klonnummer gekennzeichnet. Die Bakterienplatte wird dann direkt zur Sanger-Sequenzierung geschickt.Nach einer Sequenzbestätigung der geklonten Single Guide RNAs, reinigen Sie die DNA aus dem entsprechenden 14 Milliliter Rohr, mit einem Miniprep-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Single Guide RNA lentivirale Partikel werden in einem 96-Well-Format produziert, wie im Textprotokoll beschrieben. Und der virale Überstand wird sofort bei minus 80 Grad Celsius eingefroren.Einen Tag vor der Transduktion von Single Guide RNAs in AML Cas9-Zellen, beschichten Sie eine flache Boden nicht Gewebekultur behandelt 96 Brunnenplatte, mit 100 Milliliter rekombinanten menschlichen Fibronectin-Fragment in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter. Wickeln Sie die Platte mit Klebefolie, um Verdunstungsverlust zu vermeiden, und lassen Sie es über Nacht auf der Bank. Entfernen Sie am nächsten Tag das rekombinante menschliche Fibronectin-Fragment aus jedem Brunnen der 96-Well-Platte.Den viralen Überstand jeder einzelnen Führungs-RNA bei Raumtemperatur auftauen. Fügen Sie 50 Mikroliter viralen Überstand aus jedem Rohr zu jedem beschichteten Brunnen der Transduktionsplatte hinzu. Wickeln Sie die Platte mit Klebefolie, um eine mögliche Kontamination während der Zentrifugation zu vermeiden.Drehen Sie die Platte bei 1, 300 mal g bei 35 Grad Celsius für 90 Minuten. Gegen Ende der Spritzinfektion zählen Sie die hohen Cas9-Ausdrückel-Klon-B3-Zellen aus dem Kulturkolben. Drehen Sie nach dem Zählen die erforderliche Anzahl von Zellen herunter, und setzen Sie sie in frischem Medium wieder auf.Verwenden Sie nach der 90-minütigen Spritzinfektion eine auf 50 Mikroliter eingestellte Mehrkanalpipette, um den Überstand langsam aus allen Brunnen zu entfernen, indem Sie die Platte kippen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Kultur der Klon-B3-Zellen zu jedem Brunnen langsam, gleiten von der Felge nach unten. Drehen Sie die Platte bei 1, 300 mal g bei 35 Grad Celsius für zwei Minuten, damit sich die Zellen nach unten absetzen.Übertragen Sie die Platte auf einen 37 Grad Celsius Gewebekultur Grad Inkubator. Am nächsten Tag 100 Mikroliter frisches Medium zu jedem Brunnen hinzufügen, der einzelne RNA-transduzierte Zellen enthält, so dass das endgültige mittlere Volumen 200 Mikroliter beträgt. Geben Sie die Platte an den Inkubator zurück.72 Stunden nach der Transduktion, überprüfen Sie den Prozentsatz der Single-Guide-RNA, die BFP-positive Zellen in jedem Brunnen durch Durchflusszytometrie enthält. Verwenden Sie einen Zelllebensfähigkeitsfarbstoff, um abgestorbene Zellen zu markieren und aus der Analyse auszuschließen. Setzen Sie nach jeder Faktenanalyse einen Teil der Zellen in neue Brunnen mit frischem Medium zurück, um ein Überwuchern während des Assays zu vermeiden.Wiederholen Sie alle zwei bis drei Tage die Faktenanalyse, um den relativen Anteil der BFP-positiven Zellen im Vergleich zu den negativen BFP-Gegenstücken zu überprüfen. Analysieren Sie den Prozentsatz der BFP-positiven Zellen für jeden Zeitpunkt mithilfe einer Faktenanalysesoftware. Der Schlüssel zum Erfolg des wettbewerbsfähigen Proliferations-Assays besteht darin, die richtigen Gating-Techniken zu verwenden, um sicherzustellen, dass die letztendlichen Anzahl von Lebenden Zellen korrekt ist.Ziehen Sie FCS-Dateien für jedes Beispiel in die Software. Doppelklicken Sie auf eine beliebige Beispieldatei, und zeichnen Sie ein Punktdiagramm mit Vorwärtsstreuung versus Seitenstreuung mit Vorwärtsstreuung auf der x-Achse und Seitenstreuung auf der y-Achse. Tor alle Zellen.Doppelklicken Sie auf die gated Cells, und zeichnen Sie den Flecken für die Lebensfähigkeit auf der y-Achse im Vergleich zur Punkthöhe oder flächenpunktförmigen Fläche nach vorne. Gate die Lebensfähigkeit Fleck negative Zellen. Doppelklicken Sie auf die abgesperrten Live-Zellen, und zeichnen Sie BFP auf der y-Achse im Vergleich zur Vorwärtsstreuung auf der x-Achse.Gate die BFP-positiven Zellen. Wenden Sie alle diese Gates auf alle Beispiele an, indem Sie das ausgewählte Beispiel auf alle Samples unter der Registerkarte Gruppe ziehen. Klicken Sie auf den Tabelleneditor, um eine Analysetabelle aller Stichproben zu erstellen.Ziehen Sie die positive BFP-Anzahl von einem Beispiel auf die Tabelle, und klicken Sie auf die Anzeigeschaltfläche im Tabelleneditor, um einen Batchbericht aller Stichproben zu erstellen, wobei die Tabelle den Prozentsatz der BFP-positiven Zellen anzeigt. Speichern Sie die Tabelle als Excel-Datei. Dieses System wurde verwendet, um die Rolle von Genen zu untersuchen, die eine Rolle bei der Proliferation oder dem Überleben menschlicher und muriner AML-Zelllinien spielen können.Die Ausrichtung auf den AAVS1 Safe-Harbor-Lokus mit zwei separaten Single-Guide-RNAs hatte keinen Einfluss auf die Proliferation menschlicher MOM13 Cas9-Zellen Im Gegensatz dazu wurde bei der Zielwirkung des DNA-Replikations-assoziierten Gens RPA3 ein progressiver und signifikanter Rückgang des Anteils der BFP-positiven Zellen im Vergleich zu den negativen nicht transduzierten BFP-Gegenstücken beobachtet. In ähnlicher Weise wurden die Auswirkungen von Single Guide RNAs, die auf Dot1l, einen epigenetischen Regulator, und Rhodopsin, das Augenpigmentierungsgen, abzielen, in Maus-MLL-AF9-Cas9-Zellen getestet. Einzelne-Guide-RNAs, die auf Dot1l abzielen, zeigten einen dramatischen und fortschreitenden Rückgang der wettbewerbsorientierten Proliferation im Gegensatz zu einzelnen-Guide-RNAs, die auf Rhodopsin abzielen.Diese Ergebnisse zeigen die Verwundbarkeit der MLL-AF9, die Massenleukämiezellen gegen Dot1l-Erschöpfung ausdrückt, und bestätigen zuvor veröffentlichte Ergebnisse. Unter der Annahme von vier bis sechs Führungs-RNAs pro Gen eignet sich diese Methode gut für die parallele Prüfung von mindestens 16 bis 24 Genen und kann auch zur Erprobung von Genabhängigkeiten in jeder Krebszelllinie eingesetzt werden. Im Falle einer größeren Anzahl von Genen, wie z. B. einem gesamten molekularen Pfad, der in AML-Zellen getestet werden muss, werden Pool-CRISPR-Cas9-basierte Bildschirme nützlicher sein.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Forschung

Krebsforschung

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Entwicklung und Wartung eines Präklinische Patienten gewonnen Tumorxenotransplantates Modell für die Untersuchung von neuartigen Anti-Krebs-Therapien

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...