Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

פלסמיד pCW-Cas9 הייתה מתנת אריק לנדר & דוד סבאטיני (Addgene פלסמיד # 50661), pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W פלסמיד מהמעבדה יוסה (Addgene פלסמיד #67974. ברצוננו להודות הליבה Cytometry זרימה במכון דיסקברי רפואי SBP לעזרה בזמן עם ניתוח תזרים ומיון. נשמח להכיר את התמיכה של הקרן לזכר טטה הגברת כדי לספירה נשמח להכיר גם את התמיכה של מקורות המימון הבאים: NIH/NCI P30 CA030199 סרטן מרכז בחסות גרנט, V-הקרן ומרכזים את סן דייגו NCI סרטן (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. ייצור AML תא קו שיבוטים עם ביטוי גבוהה של Cas9 פעילה ויציבה
<ol><li>הפקה של Cas9 lentivirus
	<ol>
<li>יום 0: צלחת 4 x 10 תאים6 293T ב- 10 מ"ל של DMEM עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין-גלוטמין בצלחת תרביות רקמה 10 ס מ ב אבטחה ברמה 2 (BSL2) מוסמך הוד התרבות תאים. הכנס את המאכל חממה 37 ° C.</li>
		<li>יום 1: התאים מצופה ...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לביצוע של צמיחה תחרותי המבוססות על CRISPR-Cas9 assay לחקור את התפקיד של המועמד גנים ב- AML שורות תאים באמצעות cytometry זרימה ב- AML האדם/מאתר תאים (איור 5). מטרת וזמינותו היא לזהות את ההשפעה של ג'ין מחיקה על תחזוקה של התפשטות תאים AML מעל שבועיים עד שלושה שב...

העשורים האחרונים ראינו מאמצים מחקרים רבים התמקדו בזיהוי התרומה של מסלולים מולקולריים מפתח ב פתוגנזה לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). באופן מסורתי, ג'ין-הפרעה בתאי AML בוצעה באמצעות עכברים knockout מותנה או סיכת ראש-קצרים RNA (shRNA). בעוד עכברים knockout מציעים מערכת מתוחכמת לשליטה-עתיים של ג'ין-מחיקה, יצירת עכברים knockout ג'ין הוא מהגידולים, גוזלת זמן יקר. יתר על כן, ג'ין-הסתרה באמצעות אסטרטגיות רקומבינציה אינה להרחבה בקלות; אסטרטגיות אלו אינם מתאימים עצמם טוב לחקירה של מספר גנים במקביל. לאחר הגילוי של שיטות התערבות RNA mRNAs אנדוגני דפיקה למטה בעזרת RNA קטנים מפריעות (siRNA) או shRNA, החלו קבוצות רבות באמצעות טכניקות התערבות RNA לחקור את התפקיד של גנים ספציפיים ב- AML. מאז תאים AML מאתר והן אנושי שקשה לחסלם transfect בשיטות תקנים מסורתי המבוסס על שומנים בדם, לרוב מחקרים shRNA מועסקים lentivirally או מקודד retrovirally ללמוד פונקציה גנים בתאים AML. גילוי זה התבצעה מקובצים באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR), nucleases Cas המשויך (CRISPR-Cas9) יש מהפכה פילוח ג'ין טכנולוגיות1,2,3. באמצעות CRISPR-Cas9, גנים ספציפיים או אזורים גנומית ניתן למחוק, לערוך או מתויגים עם יעילות וקלות. CRISPR Cas9-עריכת מבוססי-ג'ין עכשיו מתעוררים כמו שיטת הבחירה עבור חוקרים יחסי גנוטיפ-כדי-פנוטיפ סוגי תאים שונים עקב פשטות, יעילות, ישימות רחבה של טכניקה זו. שיטות המבוססות על CRISPR-Cas9 גם הופכים שיטת הבחירה ב- AML, לא רק עבור חוקרים גנים בודדים, אבל גם כמו דרך היעד גנים מרובים במסכים ערוכים או במאגר הגנטי שמטרתו חוקרים מספר גנים במקביל כפוטנציאל AML-תלות4,5,6.
כתב יד זה, אנו מתארים וזמינותו צמיחה תחרותי פשוטה למדידת ההשפעה של ג'ין-הפרעה על הגידול של תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה, בהתבסס על יציבה CRISPR Cas9-בתיווך גנים לעריכת ואחריו cytometry זרימה תפוקה גבוהה. שיטה זו היא פשוטה, יעילה, ניתן להרחבה עד בינוני-תפוקה ניסויים עבור חוקרים את התפקיד של מספר גנים במקביל בתאים AML.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

ג'ין ההפרעות מחקרים שימשו בהרחבה לחקור את התפקיד של גנים בודדים ב- AML פתוגנזה. להשגת שיבוש גנטי מלא, רבים ממחקרים אלה עשו שימוש מודלים נוקאאוט גנטי מורכב. בעוד מחקרים אלה עם עכברים knockout מציעים מערכת במבחן הזמן אלגנטית על חקירת יחסי גנוטיפ-כדי-פנוטיפ, שיטה מהיר ומדרגי להערכת מועמד גנים זה לשחק תפקיד התפשטות תאים AML או הישרדות AML דגמים יעזור לזרז חקירת גנים המועמד מרובים במקביל. ההתקדמות בטכנולוגיות לעריכת הגנום פופולארים באופן דרמטי את היכולת שלנו לבצע לפליטת גנטי בקנה מידה חסר תקדים. מערכת אחת כזאת של הגנום עריכה היא שיטת CRISPR-Cas9 מבוססי יכול לשמש כדי להפוך מהירה וכן שינויים בגנום תא היעד. נוחות ואת המדרגיות של מחיקה ג'ין CRISPR/Cas9-מתווכת ' עושה את זה אחת מהטכניקות האטרקטיבי ביותר עבור החקירה של מספר רב של גנים מבחני פנוטיפי. כאן, אנו מציגים וזמינותו פשוטה באמצעות גנים CRISPR/Cas9 מתווכת-בשילוב עם תפוקה גבוהה לזרום cytometry מבוססת על תחרות מבחני הפרעה לחקור את התפקיד של גנים שעשויים לשחק תפקיד חשוב התפשטות או ההישרדות של האדם, שורות תאים מאתר של AML.

במחקר שלנו, אנחנו קודם transduced את MOLM13 האנושית AML שורת התאים הנושאת רוברטסונית MLL-AF9 עם כייל גבוה וירוס קידוד פלסמיד lentiviral את Cas9-blasticidin. בידיים שלנו, בצובר ממוינת תאי MOLM13-Cas9 תציג את הביטוי Cas9 ברמה גבוהה על ידי סופג המערבי ואת גם לא לבצע היטב כאשר לבדיקה עבור ג'ין יעיל עריכה-באמצע...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

כתב יד זה מתאר שיטה CRISPR-Cas9 מבוססי מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר (CRISPR) לחקירה פשוט ומהיר של התפקיד של גנים מרובים המועמד בהתפשטות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ב במקביל. טכניקה זו היא מדרגית, יכול להיות מיושם במבנים אחרים סרטן התא גם כן.

החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

סרטון זה ידגים שיטה פשוטה לחקירת מספר גנים מועמדים ב- AML במקביל, באמצעות מערכת Crisper-Cas9 בשילוב עם מוסט הצמיחה התחרותי המבוסס על ציטומטריית זרימה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ומדרגית. הדגמת ההליך תהיה בו רוי צ'ן, פוסט דוק מהמעבדה שלנו.תוכנת תכנון CRISPR מבוססת אינטרנט משמשת לעיצוב ארבעה עד שישה RNAs מדריך יחיד עבור הגן של עניין. כדי להתחיל, מלא את המידע המתאים בשדות בכוכביות. לאחר מכן בחר את גנום היעד עבור עיצוב RNA מדריך יחיד.הדבק את רצף היעד בתיבת הרצף ולחץ על לחצן השליחה. לשיבוט בביטוי RNA המדריך היחיד הרצוי פלסמיד, הקדים את הנוקלאוטידים CACC לתחושה oglionucleotide ו- AAAC כדי להפוך את אוליגונוקלאוטיד האנטיסנס המחמיא. חוש premixed ו oligonucleotides antisense מסודרים לאחר מכן מהחברה בצלחת 96 גם, שכותרתו אוליגו מיקס.הגדר צלחת נפרדת U-Bottom 96 באר, שכותרתו צלחת חישול. הכן תערובת אב של מיקרוליטר אחד של T4 פולינוקלאוטריד קינאז, מיקרוליטר אחד של חיץ רצועות DNA 10x T4, ושישה מיקרוליטרים של מים לכל תגובה חישול. הוסף 8 microliters של תערובת האב לכל באר של צלחת חישול, ואחריו 2 microliters של חוש premixed ו antisense oligonucleotides.פיפטה פעמיים עד שלוש פעמים בעדינות כדי לערבב היטב, ולאחר מכן לסובב את הצלחת בקצרה כדי לקבל את הערבובים לתחתית בארות. השתמש בתוכנית ההתאגנות הבאה במחשב PCR. 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, 95 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות ו -30 שניות, ואחריו קירור איטי ל 22 מעלות צלזיוס בקצב של 0.1 מעלות צלזיוס לשנייה.כאשר חישול הושלם, להכין צלחת 96 באר טרי, שכותרתו תערובת אוליגו מדולל, על ידי דילול זרחן ותוסס oligonucleotides מן התגובה annealing אחד עד 200 עם מים. ליניארית וקטור ביטוי RNA מדריך יחיד על ידי עיכול חמישה מיקרוגרם של הווקטור עם 1.5 microliters של אנזים הגבלת BBS1, באמצעות מאגר מתאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן, לקחת צלחת טרי 96 גם שכותרתו לוח קשירה, ולהוסיף 20 ננוגרם של BBS1 מתעכל מדריך יחיד RNA ביטוי וקטור אחד גם לכל מחרוזת RNA מדריך אחד הרצוי.לשם כך, להוסיף 2 microliters של אוליגונוקלאוטידים זרחן annealed מצלחת תערובת אוליגו מדולל. מוסיפים לכל באר, מיקרוליטר אחד של חיץ ליגות 10X T4, ומיקרוליטר אחד של אנזים ליגס T4, ובעדינות פיפטה לערבב. דגירה הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.בערך 10 דקות לפני שתגובת הקשירה נעשית, מלאו 90 מיקרוליטרים של תאי אי-קולי מוכשרים כימית על קרח. להעביר 10 aliquots microliter של התאים המוסמכים לתוך כל באר של צלחת נפרדת 96 באר בנפרד. מוסיפים את תערובת הקשירה לתוך בארות המכילות את התאים המוסמכים.פיפטה למעלה ולמטה בעדינות, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. פיפטה חמישה microliters של תערובת DNA חיידקים מכל תגובת טרנספורמציה ישירות לתוך באר של צלחת 6 באר, המכיל אגר LB עם 100 מיליגרם למיליליטר של אמפיצילין. מוסיפים כחמש עד שמונה גם גם גם, ומנערים את צלחת ה-6 היטב שמונה עד עשר פעמים בתנועה מעגלית.דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, בחר אחת עד שתי מושבות בודדות מכל באר, עם קצה פיפטה סטרילי 20 microliter, ו streak אותו על נקודה שכותרתו על צלחת פטרי סטרילית 10 ס"מ, עם אגר LB ו 100 מיליגרם למיליליטר של אמפיצילין לאחר פסים על צלחת LB, להוציא את הקצה לתוך שלושה מיליליטר של מדיום אמפיצילין בצינור תחתון עגול 14 מיליליטר מסומן במספר השיבוט החיידקי המתאים. לוחית החיידקים נשלחת ישירות לריווח סנגר.לאחר אישור רצף של RNAs מדריך יחיד משובט, לטהר את ה-DNA מן הצינור המתאים 14 מיליליטר, באמצעות ערכת miniprep על פי הוראות היצרן. חלקיקי RNA lentiviral מדריך יחיד מיוצרים בפורמט 96 גם, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. והעל-טבעי הוויראלי קפוא מיד במינוס 80 מעלות צלזיוס.יום אחד לפני ההעתקה של RNAs מדריך יחיד בתאי AML Cas9, מצופה תחתית שטוחה שאינם רקמה תרבות מטופלים 96 צלחת היטב, עם 100 מיליליטר של שבר פיברונקטין אנושי רקומביננטי בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר. לעטוף את הצלחת עם לעטוף נצמד כדי למנוע אובדן אידוי, ולהשאיר אותו על הספסל לילה. ביום שלמחרת, להסיר את שבר פיברונקין אנושי רקומביננטי מכל באר של צלחת 96 היטב.להפשיר את העל-טבעי הוויראלי של כל מדריך RNA בטמפרטורת החדר. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של על-טבעי ויראלי מכל צינור לכל באר מצופה של צלחת ההעתקה. לעטוף את הצלחת עם לעטוף נצמד כדי למנוע זיהום פוטנציאלי במהלך צנטריפוגה.לסובב את הצלחת ב 1, 300 פעמים גרם ב 35 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לקראת סוף הספין-קצינה, ספרו את ה-Cas9 הגבוה המבטא תאי B3 משובבים מבקבוק התרבות. לאחר הספירה, סובב כלפי מטה את מספר התאים הנדרש והתן מחדש במדיום טרי.לאחר ספינפוט של 90 דקות, השתמשו בפיגט רב-ערוצי המותאם ל-50 מיקרוליטרים כדי להסיר את העל-טבעי מכל הבארים באיטיות על-ידי הטיית הצלחת. הוסף 100 microliter של התרבות של שיבוט B3 תאים לכל גם לאט, מחליק למטה מן השפה. לסובב את הצלחת ב 1, 300 פעמים גרם ב 35 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב לתחתית.מעבירים את הצלחת לאנקובטור ברמת 37 מעלות צלזיוס. ביום שלמחר, להוסיף 100 microliters של מדיום טרי לכל באר המכילה תאים RNA מדריך יחיד, כך נפח בינוני הסופי הוא 200 microliters. תחזיר את הצלחת לאנקובטור.72 שעות לאחר ההעתקה, לבדוק את אחוז RNA מדריך יחיד המכיל תאים חיוביים BFP בכל באר על ידי cytometry זרימה. השתמש בצבע יכולת הקיום של התא כדי לסמן ולהחריג תאים מתים מהניתוח. המשך לציפוי מחדש של חלק מהתאים לתוך בארות חדשות עם מדיום טרי לאחר כל ניתוח עובדות כדי למנוע צפיפות יתר במהלך ההתמדה.כל יומיים עד שלושה ימים, חזור על ניתוח העובדות כדי לבדוק את השיעור היחסי של תאים חיוביים BFP בהשוואה לעמיתיו השליליים BFP. נתח את אחוז התאים החיוביים של BFP עבור כל נקודת זמן, באמצעות תוכנת ניתוח עובדות. המפתח להצלחת ההתרבות התחרותית הוא להשתמש בטכניקות הגטינג המתאימות כדי להבטיח שמספרי התאים החיים בסופו של דבר יהיה מדויק.גרור קבצי FCS עבור כל דוגמה לתוכנה. לחץ פעמיים על כל קובץ לדוגמה אחד, והתוות עלילה נקודה של פיזור קדימה לעומת פיזור בצד, עם פיזור קדימה על ציר x, ו פיזור בצד על ציר y. שער כל התאים.לחץ פעמיים על התאים המגודרים, וכתם הכדאיות של העלילה על ציר ה- y לעומת גובה פיזור קדימה או חלקת נקודה באזור. שער הכדאיות כתם תאים שליליים. לחץ פעמיים על התאים החיים מגודרים, ועלילה BFP על ציר y לעומת פיזור קדימה על ציר x.שער התאים החיוביים BFP. החל את כל השערים האלה על כל הדוגמאות על-ידי גרירת הדוגמה שנבחרה לכל הדוגמאות תחת כרטיסיית הקבוצה. לחץ על עורך הטבלה כדי להפוך את טבלת ניתוח של כל הדוגמאות.גרור את הספירה החיובית של BFP מדגימה אחת לטבלה ולחץ על לחצן התצוגה בעורך הטבלה כדי ליצור דוח אצווה של כל הדגימות, כאשר הטבלה מציגה את אחוז התאים החיוביים של BFP. שמור את הטבלה כקובץ Excel. מערכת זו שימשה כדי לחקור את התפקיד של גנים שעשויים לשחק תפקיד התפשטות או הישרדות של קווי תאים אנושיים מורין AML.מיקוד AAVS1 נמל בטוח עם שני RNAs מדריך יחיד נפרד לא הייתה השפעה על התפשטות של תאים אנושיים MOM13 Cas9 לעומת זאת, כאשר הגן הקשורים שכפול DNA, RPA3, היה ממוקד, ירידה פרוגרסיבית ומשמעותית באחוז התאים החיוביים BFP בהשוואה לעמיתים שליליים BFP שלילי untransduced נצפתה. באופן דומה, ההשפעות של מדריך יחיד RNAs מיקוד Dot1l, ווסת אפיגנטי, ורודופסין, גן פיגמנטציה העין, נבדקו בתאי העכבר MLL-AF9 Cas9. מדריך יחיד RNAs מיקוד Dot1l, הראה ירידה דרמטית ומתקדמת התפשטות תחרותית לעומת מדריך יחיד RNAs מיקוד רודופסין.תוצאות אלה ממחישות את הפגיעות של MLL-AF9 המביעים תאי לוקמיה המוניים לדלדול Dot1l, ומאשרות תוצאות שפורסמו בעבר. בהנחה של ארבעה עד שישה RNAs מדריך לכל גן, שיטה זו מתאימה היטב לשמש לבדיקת לפחות 16 עד 24 גנים במקביל, וזה יכול להיות מיושם גם כדי לבדוק תלות בגנים בכל קו תאים סרטניים. במקרה של מספר גדול יותר של גנים, כגון מסלול מולקולרי שלם שצריך להיבדק בתאי AML, מסכים מבוססי CRISPR-Cas9 בבריכה יהיו שימושיים יותר.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

פיתוח ותחזוקה של גידול נגזר החולה פרה xenograft דגם לחקירת Novel טיפולים נגד סרטן

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...