Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Il plasmide pCW-Cas9 era un regalo da Eric Lander & David Sabatini (plasmide Addgene # 50661) e il pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plasmide W dal laboratorio Yusa (plasmide Addgene #67974. Vorremmo ringraziare il nucleo di citometria a flusso a SBP Medical Discovery Institute per il tempestivo aiuto con l'analisi di flusso e l'ordinamento. Vorremmo riconoscere il sostegno di Lady Tata Memorial Foundation a A.D. Vorremmo anche riconoscere il sostegno delle seguenti fonti di finanziamento: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponsorizzato Grant, la V-Fondazione e i centri di cancro NCI (C3) di San Diego #PTC2017to A.J.D.

1. generare cloni di linea delle cellule AML con alta espressione di Cas9 stabili e attivi
<ol><li>Produzione di Cas9 lentivirus
	<ol>
<li>Giorno 0: Piastra 4 x 106 293T cellule in 10 mL di DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS) e penicillina e L-Glutammina in un piatto di coltura del tessuto di 10cm in un livello 2 di biosicurezza (BSL2) certificata cappa di cultura cellulare. Mettere il piatto in un incubatore a 37 ° C.</li>
		<li>Giorno 1: Le cellule 293T placcato dovrebbero essere il 70...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

In questo manoscritto, descriviamo un protocollo dettagliato per lo svolgimento di un'analisi di crescita competitiva basati su CRISPR-Cas9 per studiare il ruolo di geni candidati in linee cellulari AML mediante citometria a flusso in cellule di AML umano/murino (Figura 5). L'obiettivo del test è di identificare l'effetto della delezione del gene sulla manutenzione di proliferazione delle cellule AML oltre due o tre settimane su scala medio-velocità di trasmissione. Alcuni passaggi critici...

Degli ultimi decenni hanno visto numerosi sforzi di ricerca focalizzati sull'identificazione il contributo dei principali meccanismi molecolari nella patogenesi della leucemia mieloide acuta (AML). Tradizionalmente, rottura del gene in cellule di AML è stata eseguita utilizzando topi knock-out condizionale o short hairpin RNA (shRNA). Mentre i topi knockout offrono un sofisticato sistema per il controllo spazio-temporale di omissione del gene, generazione di topi knockout del gene è laborioso, lungo e costoso. Inoltre, gene-Ko utilizzando strategie di ricombinazione non è facilmente scalabile; Queste strategie non si prestano bene per l'interrogatorio di parecchi geni in parallelo. Dopo la scoperta di metodi di interferenza del RNA di colpo mRNAs endogeno utilizzando piccolo RNA interferente (siRNA) o shRNA, molti gruppi iniziato utilizzando tecniche di interferenza del RNA per indagare il ruolo dei geni specifici in AML. Poiché le cellule AML sia murine ed umane sono notoriamente difficili a transfect utilizzando metodi di trasfezione basata sui lipidi tradizionali, la maggior parte studia lentivirally autonomo o con codifica retrovirally shRNA per lo studio della funzione del gene in cellule di AML. La recente scoperta di cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) e l'associato nucleasi Cas (CRISPR-Cas9) ha rivoluzionato la gene-targeting tecnologie1,2,3. Utilizzando CRISPR-Cas9, specifici geni o regioni genomiche possono essere eliminate, modificate o taggate con efficienza e semplicità. CRISPR Cas9-editing basato su gene ora sta emergendo come il metodo di scelta per indagare le relazioni genotipo-fenotipo in tipi cellulari diversi a causa della semplicità, efficacia e ampia applicabilità di questa tecnica. Metodi basati su CRISPR-Cas9 stanno diventando il metodo di scelta in AML, non solo per interrogare i singoli geni, ma anche come un modo di indirizzare i geni multipli in disposti o pooled schermi genetici finalizzati ad indagare diversi geni in parallelo come potenziale AML-dipendenze4,5,6.
In questo manoscritto, descriviamo un'analisi semplice crescita competitiva per misurare l'impatto della rottura del gene sulla crescita delle cellule di AML, basato sulla stabile CRISPR-Cas9-mediated gene-modifica seguita da citometria a flusso ad alta velocità. Questo metodo è semplice, efficiente e scalabile per esperimenti di media-velocità di trasmissione per investigare il ruolo di parecchi geni in parallelo in cellule AML.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

Gene perturbazione studi sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo dei singoli geni nella patogenesi AML. Per la realizzazione completa del gene, molti di questi studi hanno fatto ricorso a modelli di knockout del gene complesso. Mentre questi studi con topi knockout offrono un sistema elegante e time-tested per indagare le relazioni genotipo-fenotipo, un metodo veloce e scalabile per la valutazione di geni candidati che gioca un ruolo nella proliferazione delle cellule AML o sopravvivenza nei modelli AML aiuterà ad accelerare l'interrogatorio parallela di più geni candidati. I recenti progressi nelle tecnologie di modifica del genoma hanno drammaticamente migliorato la nostra capacità di eseguire perturbazioni genetiche in una scala senza precedenti. Uno di questi sistemi di editing genomico è il metodo di CRISPR-Cas9-based che può essere utilizzato per apportare modifiche rapide ed efficaci nel genoma della cellula bersaglio. La facilità e la scalabilità di omissione del gene per CRISPR/Cas9-mediata rende una delle tecniche più attraente per l'interrogatorio di un gran numero di geni nelle analisi fenotipiche. Qui, presentiamo un'analisi semplice utilizzando rottura CRISPR/Cas9 mediato del gene combinata con saggi di alto-rendimento flusso cytometry-concorrenza basata per indagare il ruolo dei geni che possono svolgere un ruolo importante nella proliferazione o la sopravvivenza dell'essere umano e murine linee cellulari AML.

Nel nostro studio, abbiamo transduced in primo luogo la linea umana AML cellulare di MOLM13 che porta la traslocazione MLL-AF9 con alto-titolo virus codifica il plasmide lentivirale Cas9-Consciousness. Nelle nostre mani, alla rinfusa indifferenziati MOLM13-Cas9 cellule non venivano visualizzate alto livello Cas9 espressione mediante Western blotting e inoltre non hanno eseguito bene quando analizzati per efficiente gene modifica-utilizzando il metodo descritto in precedenza<sup class="xre...

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Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Questo manoscritto descrive un cluster regolarmente intervallate breve palindromo si ripete (CRISPR) CRISPR Cas9 metodo basato per indagine semplice e rapida del ruolo di geni candidati multipli nella proliferazione delle cellule di leucemia mieloide acuta (LMA) in parallelo. Questa tecnica è scalabile e può essere applicata in altre linee cellulari di cancro pure.

Indagine delle dipendenze genetiche utilizzando dosaggi di concorrenza basati su CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Questo video dimostrerà un metodo semplice per indagare più geni candidati in AML in parallelo, utilizzando il sistema Crisper-Cas9 combinato con il test di crescita competitiva basato sulla citometria del flusso. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è rapida e scalabile. A dimostrare la procedura sarà Bo Rui Chen, un post doc del nostro laboratorio.Un software di progettazione CRISPR basato sul web viene utilizzato per progettare da quattro a sei RNA a guida singola per il gene di interesse. Per iniziare, compilare le informazioni appropriate nei campi con asterischi. Quindi selezionare il genoma di destinazione per la progettazione di RNA a guida singola.Incollare la sequenza di destinazione nella casella di sequenza e fare clic sul pulsante invia. Per la clonazione nel plasmide di espressione dell'RNA a guida singola desiderato, anteponere i nucleotidi CACC al senso di oglionucleotide e AAAC all'oligonucleotide antisenso gratuito inverso. Il senso premiscelato e gli oligonucleotidi antisenso vengono quindi ordinati da un'azienda in una piastra da 96 po po ', etichettata Oligo Mix.Impostare una piastra di pozzo U-Bottom 96 separata, etichettata piastra di ricottura. Preparare un mix master di un microlitro di polinucleotide chinasi T4, un microlitro di tampone di legatura del DNA T4 10x e sei microlitri di acqua per reazione di ricottura. Aggiungere 8 microlitri del master mix ad ogni pozzo della piastra di ricottura, seguiti da 2 microlitri di senso premiscelato e oligonucleotidi antisenso.Pipetta da due a tre volte delicatamente per mescolare bene, quindi ruotare brevemente la piastra per ottenere le miscele sul fondo dei pozzi. Utilizzare il seguente programma di ricottura in un computer PCR. 37 gradi Celsius per 30 minuti, 95 gradi Celsius per due minuti e 30 secondi, seguiti da raffreddamento lento a 22 gradi Celsius a una velocità di 0,1 gradi Celsius al secondo.Al termine della ricottura, preparare una piastra fresca da 96 porvili, etichettata Diluted Oligo Mix, diluendo gli oligonucleotidi fosforilati e ricotti dalla reazione di ricottura uno a 200 con acqua. Linearizzare il vettore di espressione dell'RNA a guida singola digerendo cinque microgrammi del vettore con 1,5 microlitri di enzima di restrizione BBS1, utilizzando un buffer appropriato a 37 gradi Celsius per due ore. Successivamente, prendi una piastra di legatura con etichetta 96 ben placcata e aggiungi 20 nanogrammi del vettore di espressione dell'RNA a guida singola digerito BBS1 a una legatura di RNA a guida singola ben per desiderata.A questo, aggiungere 2 microlitri di oligonucleotidi ricotti fosforilati dalla piastra diluita Oligo Mix. Aggiungere ad ogni pozzo, un microlitro di tampone di ligasi T4 10X e un microlitro di enzima T4 ligasi e pipetta delicatamente da mescolare. Incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore.Circa 10 minuti prima che la reazione di legatura sia fatta, riempire 90 microlitri di cellule E.coli chimicamente competenti sul ghiaccio. Trasferire 10 aliquote microliter delle cellule competenti in ogni pozzo di una piastra separata di 96 pozzetti singolarmente. Aggiungere la miscela di legatura nei pozzi contenenti le cellule competenti.Pipettare su e giù delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Pipettare cinque microlitri del dna batterico si mescolano da ogni reazione di trasformazione direttamente in un pozzo di una piastra di 6 pozzetti, contenente agar LB con 100 milligrammi per millilitro di ampicillina. Aggiungere da cinque a otto perline di vetro a ciascun pozzo e agitare la piastra da 6 pozzale da otto a 10 volte con un movimento circolare.Incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, scegli una o due singole colonie da ogni pozzo, con una punta sterile di pipetta da 20 microliter, e strisciala su un punto etichettato su una piastra di petri sterile di 10 centimetri, con agar LB e 100 milligrammi per millilitro di ampicillina Dopo aver strisciato sulla piastra LB, espellere la punta in tre millilitri di mezzo di ampicillina in un tubo inferiore rotondo da 14 millilitri , contrassegnato con il corrispondente numero di clone batterico. La piastra batterica viene quindi inviata direttamente per il sequenziamento sanger.Dopo una conferma di sequenza degli RNA a guida singola clonati, purificare il DNA dal corrispondente tubo da 14 millilitri, utilizzando un kit miniprep secondo le istruzioni del produttore. Le particelle lentivirali a RNA a guida singola sono prodotte in un formato a 96 punti, come descritto nel protocollo di testo. E il supernatante virale è immediatamente congelato a meno 80 gradi Celsius.Un giorno prima della trasduzione di RNA a guida singola nelle cellule AML Cas9, rivestire una piastra piana di coltura non tissutale trattata con 96 pozzetti, con 100 millilitri di frammento di fibronectina umana ricombinante ad una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro. Avvolgere la piastra con un involucro di aggrappamento per evitare la perdita di evaporazione e lasciarla in panchina durante la notte. Il giorno seguente, rimuovere il frammento di fibronecina umana ricombinante da ogni pozzo della piastra del pozzo 96.Scongelare il supernatante virale di ogni singolo RNA guida a temperatura ambiente. Aggiungere 50 microlitri di supernatante virale da ogni tubo a ciascun pozzo rivestito della piastra di trasduzione. Avvolgere la piastra con un involucro di aggrappamento per evitare potenziali contaminazioni durante la centrifugazione.Ruotare la piastra a 1.300 volte g a 35 gradi Celsius per 90 minuti. Verso la fine della spinfezione, contare l'alto Cas9 che esprime le cellule B3 clone dal pallone di coltura. Dopo il conteggio, spingi verso il basso il numero richiesto di cellule e ripreposi in mezzo fresco.Dopo la spinfection di 90 minuti, utilizzare una pipetta multicanale regolata a 50 microlitri per rimuovere lentamente il supernatante da tutti i pozzi inclinando la piastra. Aggiungere 100 microliter della coltura di cellule B3 clonate a ciascuna ben lentamente, scivolando giù dal bordo. Ruotare la piastra a 1.300 volte g a 35 gradi Celsius per due minuti per lasciare che le cellule si sistemino verso il basso.Trasferire la piastra in un incubatore di coltura tissutale di 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, aggiungere 100 microlitri di mezzo fresco a ogni bene contenente singole cellule trasdutte di RNA guida, in modo che il volume medio finale sia di 200 microlitri. Riportare la piastra all'incubatore.72 ore dopo la trasduzione, controllare la percentuale di SINGOLO RNA guida contenente cellule positive BFP in ogni pozzo per citometria del flusso. Utilizzare un colorante di vitalità cellulare per contrassegnare ed escludere le cellule morte dall'analisi. Continuare a ri-placcare una parte delle cellule in nuovi pozzi con mezzo fresco dopo ogni analisi dei fatti per evitare la crescita troppo durante il saggio.Ogni due o tre giorni, ripetere l'analisi dei fatti per verificare la proporzione relativa di cellule positive del BFP rispetto alle controparti negative della BFP. Analizzare la percentuale di celle positive BFP per ogni punto di tempo, utilizzando un software di analisi dei fatti. La chiave del successo del saggio di proliferazione competitiva è utilizzare le tecniche di gating appropriate per garantire che gli eventuali numeri di cellule vive siano accurati.Trascinare i file FCS per ogni campione nel software. Fare doppio clic su un file di esempio e tracciare un grafico a punti di dispersione in avanti rispetto alla dispersione laterale, con dispersione in avanti sull'asse x e dispersione laterale sull'asse y. Cancello tutte le cellule.Fare doppio clic sulle celle gated e tracciare la macchia di vitalità sull'asse y rispetto all'altezza di dispersione in avanti o al grafico a punti dell'area. Cancello la vitalità macchiare le cellule negative. Fare doppio clic sulle celle vive gated e tracciare la BFP sull'asse y rispetto alla dispersione in avanti sull'asse x.Gate le cellule positive del BFP. Applicare tutti questi gate a tutti i campioni trascinando l'esempio selezionato su tutti gli esempi sotto la scheda gruppo. Fare clic sull'editor di tabelle per creare una tabella di analisi di tutti gli esempi.Trascinare il conteggio positivo BFP da un campione alla tabella e fare clic sul pulsante di visualizzazione nell'editor di tabelle per creare un report batch di tutti gli esempi, con la tabella che visualizza la percentuale di celle positive BFP. Salvare la tabella come file di Excel. Questo sistema è stato utilizzato per studiare il ruolo dei geni che possono svolgere un ruolo nella proliferazione o sopravvivenza delle linee cellulari AML umane e murine.Prendendo di mira il locus safe-harbor AAVS1 con due RRNA a guida singola separati non ha avuto alcun effetto sulla proliferazione delle cellule umane MOM13 Cas9 Al contrario, quando è stato preso di mira il gene associato alla replicazione del DNA, RPA3, è stato osservato un calo progressivo e significativo della percentuale di cellule positive BFP rispetto alle controparti non tradotte negative della BFP. Allo stesso modo, gli effetti delle RNA a guida singola rivolte a Dot1l, un regolatore epigenetico, e rodopsina, il gene della pigmentazione oculare, sono stati testati nelle cellule del topo MLL-AF9 Cas9. Gli RNA a guida singola destinati a Dot1l, hanno mostrato un drastico e progressivo declino della proliferazione competitiva in contrasto con gli RNA a guida singola che prendono di mira il rodopsina.Questi risultati dimostrano la vulnerabilità dell'MLL-AF9 che esprime cellule di leucemia di massa all'esaurimento di Dot1l, confermando risultati pubblicati in precedenza. Supponendo da quattro a sei RNA guida per gene, questo metodo è adatto per essere utilizzato per testare almeno 16-24 geni in parallelo, e può anche essere applicato per testare le dipendenze geniche in qualsiasi linea cellulare tumorale. Nel caso di un maggior numero di geni, come un intero percorso molecolare che deve essere testato nelle cellule AML, gli schermi basati sulla piscina CRISPR-Cas9 saranno più utili.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

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Ricerca sul cancro

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