Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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PCW Cas9 プラスミドだったエリック ・ ランダー & デヴィッド ・ サバティーニ (Addgene プラスミド # 50661) と pKLV2 U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - からの贈り物 W プラスミドから遊佐ラボ (Addgene プラスミド #67974。フローの分析と並べ替えとタイムリーなヘルプ SBP 医療探索所フローサイトメトリー コアに感謝したいと思います。西暦女性タタ記念財団のサポートを確認したいと思いますまた次の資金調達のサポートを確認したいと思います: NIH/NCI P30 CA030199 がんセンター主催グラント、V 財団とサンディエゴの NCI のがんセンター (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. 生成 AML 細胞ライン クローン安定的かつアクティブな Cas9 の高発現と
<ol><li>Cas9 レンチ ウイルスの生産
	<ol>
<li>日 0: 4 x 10 DMEM のバイオ セーフティ レベル 2 の 10 cm の細胞培養用ディッシュ L-グルタミンとペニシリン 10% 牛胎児血清 (FBS) 10 mL (BSL2)6 293 t 細胞は細胞文化フードを認定されています。37 ° C の定温器に料理を配置します。</li>
		<li>1 日目: メッキ 293 t 細胞は ...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

本稿では、人間/マウス急性骨髄性白血病細胞 (図 5) でフローサイトメトリーを用いた急性骨髄性白血病細胞株における候補者の遺伝子の役割を調査する競争力のある成長の CRISPR ベース Cas9 アッセイを行うための詳しいプロトコルについて述べる。分析の目的は、中規模で 2、3 週間以上の急性骨髄性白血病細胞の増殖維持に関する遺伝子欠失の影響を識別するためにで...

過去数十年間は、急性骨髄性白血病 (AML) の病因に重要な分子経路の貢献を識別するのに焦点を当てた多くの研究努力を見てきました。伝統的に、急性骨髄性白血病細胞における遺伝子破壊は条件付きノックアウト マウスまたは短いヘアピン RNA (shRNA) を使用して行われています。ノックアウト マウスは、遺伝子欠失の時空間的制御のための洗練されたシステムを提供する間は、手間、時間がかかり、高価なは遺伝子ノックアウト マウスを生成します。さらに、遺伝子のノックアウト再結合戦略を使用して拡張が容易ではないです。これらの戦略は並列で複数の遺伝子の尋問によく自分自身を貸すか。小さい干渉の RNA (siRNA) または shRNA を使用してノック ダウン内因性 Mrna に RNA 干渉法の発見は後の多くのグループ AML の特定の遺伝子の役割を調査する RNA 干渉技術を使用し始めた。マウスとヒトの急性骨髄性白血病細胞は脂質ベースのトランスフェクションを伝統的な方法を使用して transfect に困難なのでほとんど lentivirally 採用、レトロ ウイルスでエンコードされた shRNA 急性骨髄性白血病細胞における遺伝子の機能を研究するための研究します。最近の発見は、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) をクラスター化し、関連付けられた Ca 核酸 (CRISPR Cas9) は遺伝子ターゲティング技術1,2,3に革命をもたらしました。CRISPR Cas9 を使用して、特定の遺伝子やゲノム領域削除、編集またはできますが付いた検索効率と使いやすさ。CRISPR ベース Cas9 遺伝子編集は、シンプルさ、有効性、この技術の幅広い適用性などの多様な細胞型の遺伝子型-表現型の関係を調査するための選択の方法として現れている今。CRISPR ベース Cas9 の方法も急性骨髄性白血病、個々 の遺伝子の尋問だけを目的としたアレイまたはプールされた遺伝的画面に複数の遺伝子を対象とする方法としても可能性として並列にいくつかの遺伝子の調査での選択の方法になっています。アジア ・ マイル リミテッド依存関係4,5,6。
本稿では、安定した CRISPR Cas9 仲介された遺伝子 - に続く編集高スループット フローサイトメトリーに基づく急性骨髄性白血病細胞の成長の遺伝子破壊の影響を測定するための単純な競争力のある成長アッセイをについて説明します。このメソッドは、シンプルで効率的、かつ急性骨髄性白血病細胞における並列にいくつかの遺伝子の役割を調査するため媒体スループット実験にスケーラブルです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

遺伝子摂動の研究は、急性骨髄性白血病の病因における個別遺伝子の役割を調べるため広く使用されています。これらの研究の多くをした完全な遺伝子破壊を達成するための複雑な遺伝子ノックアウト モデルを使用します。ノックアウト マウスとこれらの研究は、遺伝子型-表現型の関係を調査するためのエレガントで実績のあるシステムを提供しながら候補者の遺伝子を評価するための迅速かつスケーラブルな方法再生急性骨髄性白血病細胞増殖における役割またはアジア ・ マイル リミテッド モデルで生存複数の候補者の遺伝子の並列の尋問を加速するのに役立ちます。ゲノム編集技術の最近の進歩は、前例のない規模で遺伝的摂動を実行する当社の能力を大幅に強化しました。ゲノム編集の 1 つのようなシステムは、ターゲット細胞のゲノムに迅速かつ効果的な変更を加えるに使用することができます CRISPR ベース Cas9 の方法です。使いやすさとスケーラビリティ CRISPR/Cas9 を介した遺伝子削除のそれに 1 つ遺伝子の多数の尋問のための最も魅力的な技術表現型の試金。ここ、CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊高スループット流れ cytometry による競争の試金と組み合わせてを使用して増殖に重要な役割を果たす可能性があります遺伝子の役割や人間の生存率を調査する簡易測定法を提案し、マウスの急性骨髄性白血病細胞株。

本研究で我々 は最初高力価ウイルス Cas9 ブラストサイジン レンチ ウイルス プラスミドをエンコードと MLL AF9 転座をクマ MOLM13 ヒト急性骨髄性白血病細胞株を導入しました。私たちの手では、一括未整理 MOLM13 Cas9 セル西部にしみが付くことによって高レベル Cas9 式表示されずもしていないメソッドを編集-使用して高効率な遺伝子の場合に、7を前述?...

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Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

本稿では急性骨髄性白血病 (AML) 細胞増殖で複数の候補者の遺伝子の役割を簡単かつ迅速な捜査のためクラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す (CRISPR) CRISPR ベース Cas9 方法を記述します。並列。この手法はスケーラブル、他癌細胞を同様に適用することができます。

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

このビデオでは、フローサイトメトリーベースの競合成長アッセイと組み合わせたCrisper-Cas9システムを使用して、AML内の複数の候補遺伝子を並行して調査する簡単な方法を紹介します。この手法の主な利点は、高速でスケーラブルな点です。手順のデモンストレーションは、私たちの研究室のポストドキュメントであるBo Rui Chenです。ウェブベースのCRISPR設計ソフトウェアは、対象遺伝子用の4〜6つの単一のガイドRNAを設計するために使用されます。まず、フィールドの該当する情報にアスタリスクを入力します。次に、単一ガイドRNA設計用の標的ゲノムを選択します。シーケンスボックスにターゲットシーケンスを貼り付け、送信ボタンをクリックします。所望の単一ガイドRNA発現プラスミドでクローニングする場合、ヌクレオチドCACCをセンスオリオヌクレオチドおよびAAACに逆に無料のアンチセンスオリゴヌクレオチドに付加する。プレミックスセンスとアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴミックスとラベル付けされた96ウェルプレートで会社から注文されます。アニーリングプレートとラベル付けされた別のU-Bottom 96ウェルプレートをセットします。T4ポリヌクレオチドキナーゼの1マイクロリットル、10x T4 DNAライゲーションバッファーの1マイクロリットル、および6マイクロリットルの水パーアニーリング反応のマスターミックスを調製する。アニーリングプレートの各ウェルにマスターミックスの8マイクロリットルを加え、続いて2マイクロリットルのプレミックスセンスとアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えます。ピペットを2~3回穏やかに混ぜ合わせ、プレートを短く回転させ、ミックスを井戸の底に入れます。PCRマシンでは、次のアニーリングプログラムを使用してください。30分間摂氏37度、摂氏95度を2分30秒、続いて摂氏0.1度/秒の速度で摂氏22度までゆっくりと冷却します。アニーリングが完了したら、水で焼鈍反応1から200までリン酸化およびアニールオリゴヌクレオチドを希釈することにより、希釈オリゴミックスとラベル付けされた新鮮な96ウェルプレートを調製する。1.5マイクログラムのBBS1制限酵素でベクターを5マイクログラム消化し、摂氏37度で適切なバッファーを2時間使用して、単一ガイドRNA発現ベクターを線形化します。次に、ライゲーションプレートとラベル付けされた新鮮な96ウェルプレートを取り、BBS1消化単一ガイドRNA発現ベクターの20ナノグラムを所望の単一ガイドRNAライゲーションあたり1つのウェルに加えます。これに、希釈されたオリゴミックスプレートから2マイクロリットルのリン酸化アニールオリゴヌクレオチドを加える。各ウェルに、10X T4リガーゼバッファーの1マイクロリットル、T4リガーゼ酵素の1マイクロリットルを加え、穏やかにピペットを混合します。プレートを室温で2時間インキュベートします。ライゲーション反応が行われる約10分前に、氷上に化学的に有能な大腸菌細胞の90マイクロリットルを充填する。有能な細胞の10マイクロリットルのアリコートを、個別の96ウェルプレートの各ウェルに個別に移します。有能な細胞を含むウェルにライゲーション混合物を加える。ピペットを上下に軽くし、室温で10分間インキュベートします。各変質反応から直接6ウェルプレートのウェルに混合する細菌DNAのピペット5マイクロリットルは、アンピシリンのミリリットル当たり100ミリグラムのLB寒天を含む。各ウェルに約5〜8個のガラスビーズを加え、6ウェルプレートを8~10回円運動で振ります。一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、各井戸から1〜2つの単一のコロニーを選び、無菌20マイクロリットルピペットチップを付け、無菌10センチメートルのシャーレのラベル付きスポットにストリークし、LBプレートにストリークした後、アンピシリン1ミリリットルあたり100ミリグラム、先端を14ミリリットルの底管で3ミリリットルに排出します。、対応する細菌クローン番号でマークされます。細菌プレートは、サンガーシーケンシングのために直接送信されます。クローン化された単一ガイドRNAの配列確認後、メーカーの指示に従ってミニプレップキットを使用して、対応する14ミリリットルチューブからDNAを精製する。単一ガイドRNAレンチウイルス粒子は、テキストプロトコルに記載されているように、96ウェル形式で生成される。そして、ウイルス上清はすぐにマイナス80°Cで凍結されます。AML Cas9細胞における単一ガイドRNAの導入の1日前に、平底非組織培養処理96ウェルプレートをコーティングし、1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度で組み換えヒトフィブロネクチン断片を100ミリリットル塗布する。蒸発損失を避けるために、しがみつくラップでプレートを包み、一晩ベンチに置いておきます。翌日、96ウェルプレートの各ウェルから組換えヒトフィブロネクチン断片を除去する。各単一ガイドRNAのウイルス上清を室温で解凍する。各チューブから、トランスダクションプレートの各被覆ウェルに50マイクロリットルのウイルス上清を加えます。遠心分離時の潜在的な汚染を避けるために、プレートをしがみつくラップで包みます。1、300回で90分間摂氏35度でプレートを回転させます。スプ感染の終わりに向かって、培養フラスコからB3細胞を発現する高Cas9を数える。カウント後、必要なセル数をスピンダウンし、新鮮な培地で再中断します。90分のスプ感染後、プレートを傾けてすべてのウェルから上清をゆっくりと除去するために50マイクロリットルに調整したマルチチャンネルピペットを使用してください。クローンB3細胞の培養液を100マイクロリットルずつゆっくりと各ウェルに加え、リムから滑り落ちる。セルが底に落ち着くようにするために、摂氏35度で1、300倍gでプレートを回転させます。プレートを摂氏37度の組織培養グレードインキュベーターに移します。翌日、1つのガイドRNA導入細胞を含む各ウェルに100マイクロリットルの新鮮な培地を加え、最終的な培地容量が200マイクロリットルになるようにします。プレートをインキュベーターに戻します。72時間後の伝達は、フローサイトメトリーにより各ウェルにBFP陽性細胞を含む単一ガイドRNAの割合を確認する。細胞生存率染料を使用して、死んだ細胞を解析からマークおよび除外します。アッセイ中の過剰増殖を避けるために、すべての事実分析の後、新鮮な媒体で新しい井戸に細胞の割合を再めっきし続けます。2~3日ごとに、事実分析を繰り返し、BFP陰性細胞と比較したBFP陽性細胞の相対的割合をチェックする。事実分析ソフトウェアを使用して、各時点のBFP陽性セルの割合を分析します。競合的な増殖アッセイの成功の鍵は、最終的な生細胞数が正確であることを確認するために適切な格言技術を使用することです。各サンプルのFCSファイルをソフトウェアにドラッグします。いずれかのサンプル ファイルをダブルクリックし、X 軸に前方散布図、y 軸に横散布図を使用して、前方散布図と横散布図をプロットします。すべてのセルをゲートします。ゲートセルをダブルクリックし、y軸と前方散乱高さまたは面積ドットプロットに生存率染色をプロットします。生存率染色負の細胞をゲートします。ゲート付きのライブ セルをダブルクリックし、X 軸上の Y 軸と前方散布図に BFP をプロットします。BFP陽性細胞をゲートします。グループ タブの下のすべてのサンプルに選択したサンプルをドラッグして、すべてのゲートをすべてのサンプルに適用します。テーブルエディタをクリックして、すべてのサンプルの分析テーブルを作成します。BFP 正数を 1 つのサンプルから表にドラッグし、テーブルエディタの表示ボタンをクリックして、BFP 陽性セルの割合を表に表示して、すべてのサンプルのバッチレポートを作成します。テーブルを Excel ファイルとして保存します。このシステムは、ヒトおよびマウスAML細胞株の増殖または生存に役割を果たす可能性のある遺伝子の役割を調べるのに使用された。2つの別々の単一ガイドRNAを有するAAVS1セーフハーバー軌跡を標的にしてもヒトMOM13 Cas9細胞の増殖に影響を及ぼさなかった対照的に、DNA複製関連遺伝子RPA3が標的化された場合、BFPネガティブな未伝達の対応物と比較してBFP陽性細胞の割合が進行的かつ有意に低下することが観察された。同様に、エピジェネティックレギュレータであるDot1lを標的とする単一ガイドRNAと、眼色素沈着遺伝子であるロドプシンの効果を、マウスMLL-AF9 Cas9細胞で試験した。Dot1lを標的とした単一ガイドRNAは、ロドプシンを標的とする単一ガイドRNAとは対照的に、競争増殖の劇的かつ進歩的な減少を示した。これらの結果は、大量白血病細胞をDot1l枯渇に発現するMLL-AF9の脆弱性を示し、以前に発表された結果を確認した。遺伝子当たり4〜6個のガイドRNAを仮定すると、この方法は少なくとも16〜24個の遺伝子を並行して検査するのに適しており、また、任意の癌細胞株における遺伝子の依存性をテストするために適用することができる。AML細胞で試験する必要がある分子経路全体など、より多くの遺伝子の場合、プールCRISPR-Cas9ベースのスクリーンがより有用であろう。

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Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

共培養アッセイは、神経膠芽腫の浸潤のマクロファージとミクログリアの刺激を研究します

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

前臨床患者由来の腫瘍新規抗がん療法の調査のための異種移植モデルの開発とメンテナンス

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

ヒトP53を研究する機能アッセイを開発するシャーシとしての酵母

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

比較薬評価の宿主としてゼブラフィッシュ幼虫を用いた膵臓癌の患者由来異種異種移植片モデル

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...