Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

PCW-Cas9 plasmider var en gave fra Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmider # 50661) og pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmider fra Yusa lab (Addgene plasmider #67974. Vi ønsker å takke flowcytometri kjernen SBP medisinsk Discovery Institute for betimelig hjelp med flyt analyse og sortering. Vi ønsker å erkjenne støtte fra Lady Tata Memorial Foundation til A.D. Vi ønsker å erkjenne også støtte fra følgende finansiering kilder: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponset Grant, V-stiftelsen og San Diego NCI kreft sentre (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. generere AML cellen linje kloner med høy uttrykk for stabil og aktiv Cas9
<ol><li>Produksjon av Cas9 lentivirus
	<ol>
<li>Dag 0: Plate 4 x 106 293T celler i 10 mL av DMEM med 10% fosterets bovin serum (FBS) og penicillin og L-glutamin i 10 cm vev kultur parabol i en biosafety nivå 2 (BSL2) sertifisert celle kultur hette. Plass rett i en 37 ° C inkubator.</li>
		<li>Dag 1: Belagt 293T cellene skal 70 – 80% confluent på dag 1. Utføre hva bruker følgende protokollen på ettermiddagen...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

I dette manuskriptet beskrive vi en detaljert protokoll for å gjennomføre en CRISPR-Cas9-baserte konkurransedyktig vekst analysen for å undersøke rollen kandidat gener i AML cellelinjer bruke flowcytometri i menneskelige/murint AML celler (figur 5). Målet med analysen er å identifisere effekten av genet sletting på vedlikehold i AML celle spredning over to til tre uker i medium gjennomstrømming skala. Noen kritiske trinn må følges nøye for å lette skalere opp beskrevet protokolle...

De siste tiårene har sett mange forskningsinnsats fokusert på å identifisere bidrag fra viktige molekylær stier i akutt myelogen leukemi (AML) patogenesen. Tradisjonelt, er Gen-avbrudd i AML celler utført ved hjelp av betinget knockout mus eller kort-hårnål RNA (shRNA). Knockout mus tilbyr et sofistikert system for spatio-temporale kontroll av genet sletting, er genererer genet knockout mus arbeidskrevende, tidkrevende og kostbar. Videre gen-fortrenging rekombinasjon strategier er ikke lett skalerbar; disse strategiene egner ikke seg godt til avhør av flere gener parallelt. Etter oppdagelsen av RNA forstyrrelser metoder for å slå ned endogene mRNAs lite forstyrrende RNA (siRNA) eller shRNA, begynte mange grupper med RNA forstyrrelser teknikker for å undersøke hvilken rolle bestemte gener i AML. Siden både murine og menneskelige AML celler er notorisk vanskelig å transfect med tradisjonelle lipid-baserte transfection metoder, de fleste studier ansatt lentivirally eller retrovirally-kodede shRNA for å studere gen funksjon i AML celler. Den nylige oppdagelsen av gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) og de tilhørende Cas-nucleases (CRISPR-Cas9) har revolusjonert genet målretting teknologier1,2,3. Bruker CRISPR-Cas9, kan bestemte gener og genomisk regioner slettes, redigert eller merket med effektivitet og brukervennlighet. CRISPR-Cas9-baserte gen-redigering fremstår nå som metoden for valg for å undersøke genotype til fenotypen relasjoner i ulike celletyper enkelhet, effektivitet og bred anvendelse av denne teknikken. CRISPR-Cas9-baserte metoder er også blitt metoden for valg i AML, ikke bare for avhør enkelte gener, men også som en måte å målrette flere gener i plassert eller gruppert genetisk skjermer å undersøke flere gener parallelt som mulig AML-avhengigheter4,5,6.
I dette manuskriptet beskriver vi en enkel konkurransedyktig vekst analysen for å måle virkningen av gen-avbrudd på veksten av AML celler, basert på stabil CRISPR-Cas9-mediert gen-redigering etterfulgt av høy gjennomstrømming flowcytometri. Denne metoden er enkel, effektiv og skalerbar til medium gjennomstrømming eksperimenter for å undersøke rollen av flere gener parallelt i AML celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

Gene forstyrrelsene studier har blitt brukt å undersøke rollen av enkelte gener i AML patogenesen. For å oppnå fullstendig genet avbrudd, mange av disse studiene har gjort bruk av komplekse genetiske knockout modeller. Disse studiene med knockout mus tilbyr et elegant og velprøvde system for å undersøke genotype til fenotypen relasjoner, en rask og skalerbar metode for å vurdere kandidat gener som spiller en rolle i AML celle spredning eller overlevelse i AML modeller hjelpe akselerere parallelle avhør av flere kandidat gener. Nylige fremskritt innen genomet-redigering teknologiene har dramatisk forbedret vår evne til å utføre genetiske forstyrrelser i et enestående omfang. Et slikt system genomet redigering er CRISPR-Cas9-baserte metoden som kan brukes til å gjøre rask og effektiv endringer i målet cellen genomet. Den enkle og skalerbarheten til CRISPR/Cas9-mediert genet sletting gjør det en av de mest attraktive teknikkene for avhør av et stort antall gener i fenotypiske analyser. Her presenterer vi en enkel analysen bruker CRISPR/Cas9 mediert gen-avbrudd kombinert med høy gjennomstrømming flyt-cytometri-baserte konkurranse analyser for å undersøke rollen av gener som kan spille en viktig rolle for utbredelsen eller overlevelsen av menneskelige og murine AML linjer.

I vår studie transduced vi først MOLM13 menneskelige AML celle linjen som bærer MLL-AF9 translokasjon med høy-titer virus koding Cas9-blasticidin lentiviral plasmider. I våre hender beskrevet bulk usortert MOLM13-Cas9-celler ikke vise høyt nivå Cas9 uttrykk av vestlige blotting og også utførte ikke bra når assayed for effektiv genet redigering-ved hjelp av metoden tidligere7. Derfor fortsatte vi å etablere enkeltcelle kloner og bare velge clones med høy...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Dette manuskriptet beskriver en gruppert regelmessig Interspaced kort Palindromic gjentar (CRISPR) CRISPR-Cas9-basert metode for enkel og rask undersøkelse av rollen som flere kandidat gener i akutt myelogen leukemi AML celle spredning i parallell. Denne teknikken er skalerbar og kan brukes i andre kreftcelle linjer også.

Undersøkelse av genetisk avhengigheter ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte konkurranse analyser

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Denne videoen vil demonstrere en enkel metode for å undersøke flere kandidatgener i AML parallelt, ved hjelp av Crisper-Cas9-systemet kombinert med strømningscytometribasert konkurransedyktig vekstanalyse. Den største fordelen med denne teknikken er at den er rask og skalerbar. Demonstrere prosedyren vil være Bo Rui Chen, et innlegg doc fra vår lab.En nettbasert CRISPR designprogramvare brukes til å designe fire til seks enkeltguide-RNA-er for genet av interesse. Fyll ut riktig informasjon i feltene med stjerner for å begynne med. Velg deretter målgenomet for RNA-design med én veiledning.Lim inn målsekvensen i sekvensboksen, og klikk på send-knappen. For kloning i ønsket enkeltguide RNA uttrykk plasmid, prepend nukleotider CACC til den forstand oglionukletid og AAAC til omvendt gratis antisense oligonucleotide. Premixed sense og antisense oligonucleotides blir deretter bestilt fra et selskap i en 96 brønnplate, merket Oligo Mix.Sett ut en separat U-Bottom 96 brønnplate, merket Annealing Plate. Forbered en masterblanding av en mikroliter T4 polynukleotid kinase, en mikroliter på 10x T4 DNA ligation buffer, og seks mikroliter vann per glødereaksjon. Tilsett 8 mikroliter av masterblandingen til hver brønn av Annealing Plate, etterfulgt av 2 mikroliter premixed følelse og antisense oligonucleotides.Pipetten to til tre ganger forsiktig for å blande godt, og deretter spinne platen kort for å få blandingene til bunnen av brønnene. Bruk følgende glødeprogram i en PCR-maskin. 37 grader Celsius i 30 minutter, 95 grader Celsius i to minutter og 30 sekunder, etterfulgt av langsom kjøling til 22 grader Celsius med en hastighet på 0,1 grader Celsius per sekund.Når glødet er fullført, lag en frisk 96 brønnplate, merket Fortynnet Oligo Mix, ved å fortynne fosforylert og glødet oligonukleotider fra glødereaksjonen en til 200 med vann. Linearize enkelt guide RNA uttrykk vektor ved å fordøye fem mikrogram av vektoren med 1,5 mikroliter av BBS1 begrensning enzymet, ved hjelp av en passende buffer på 37 grader Celsius i to timer. Deretter tar du en frisk 96 brønnplate merket Ligation Plate, og legger til 20 nanogram av BBS1 fordøyd enkeltguide RNA uttrykk vektor til en brønn per ønsket enkelt guide RNA ligation.Til dette, tilsett 2 mikroliter fosforylert glødet oligonukleotider fra den fortynnede Oligo Mix-platen. Legg til hver brønn, en mikroliter på 10X T4 ligase buffer, og en mikroliter T4 ligase enzym, og forsiktig pipette å blande. Inkuber platen ved romtemperatur i to timer.Omtrent 10 minutter før ligationreaksjonen er ferdig, Fyll 90 mikroliter av kjemisk kompetente E.coli-celler på is. Overfør 10 mikroliter aliquots av de kompetente cellene til hver brønn av en egen 96 brønnplate individuelt. Tilsett ligationblandingen i brønnene som inneholder de kompetente cellene.Pipetten opp og ned forsiktig, og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. Pipette fem mikroliter av bakteriene DNA blanding fra hver transformasjon reaksjon direkte inn i en brønn av en 6 brønnplate, som inneholder LB agar med 100 milligram per milliliter ampicillin. Tilsett omtrent fem til åtte glassperler til hver brønn, og rist 6-brønnplaten åtte til 10 ganger i en sirkulær bevegelse.Inkuber platene ved 37 grader Celsius over natten. På neste dag, plukke en til to enkle kolonier fra hver brønn, med en steril 20 mikroliter pipette tips, og strek den på et merket sted på en steril 10 centimeter petriskål, med LB agar og 100 milligram per milliliter ampicillin Etter striping på LB plate, kaste spissen i tre milliliter ampicillin medium i en 14 milliliterrundt bunnrør , merket med tilsvarende bakteriell klonenummer. Bakterieplaten sendes deretter direkte til Sanger-sekvensering.Etter en sekvensbekreftelse av klonet enkelt guide RNA, rense DNA fra tilsvarende 14 milliliter rør, ved hjelp av en miniprep kit i henhold til produsentens instruksjoner. Enkeltguide RNA lentiviralpartikler produseres i et 96-brønnformat, som beskrevet i tekstprotokollen. Og den virale supernatanten fryses umiddelbart ved minus 80 grader Celsius.En dag før transduksjon av enkelt guide RNA i AML Cas9 celler, belegge en flat bunn ikke vev kultur behandlet 96 brønnplate, med 100 milliliter rekombinant humant fibronectin fragment i en konsentrasjon på 10 mikrogram per milliliter. Pakk platen med plastfolie for å unngå fordampningstap, og la den stå på benken over natten. På neste dag fjerner du det rekombinante humane fibronectinfragmentet fra hver brønn av 96-brønnplaten.Tin den virale supernatanten til hver enkelt guide RNA ved romtemperatur. Tilsett 50 mikroliter virale supernatant fra hvert rør til hver belagt brønn av transduksjonsplaten. Pakk platen med plastfolie for å unngå potensiell kontaminering under sentrifugering.Spinn platen på 1, 300 ganger g ved 35 grader Celsius i 90 minutter. Mot slutten av spinfection, telle den høye Cas9 uttrykker klone B3 celler fra kulturen kolbe. Etter telling, spinn ned det nødvendige antall celler, og resuspend i friskt medium.Etter 90 minutters spinfection, bruk en flerkanals pipette justert til 50 mikroliter for å fjerne supernatant fra alle brønnene sakte ved å vippe platen. Tilsett 100 mikroliter av kulturen av klone B3 celler til hver godt sakte, glir ned fra felgen. Spinn platen på 1, 300 ganger g ved 35 grader Celsius i to minutter for å la cellene bosette seg til bunnen.Overfør platen til en 37 grader Celsius vev kultur klasse inkubator. På neste dag legger du til 100 mikroliter friskt medium til hver brønn som inneholder enkeltguide RNA-transduserte celler, slik at det endelige mellomvolumet er 200 mikroliter. Sett platen tilbake til inkubatoren.72 timer etter transduksjon, sjekk prosentandelen av enkelt guide RNA som inneholder BFP positive celler i hver brønn ved flytcytometri. Bruk en celle levedyktighet fargestoff for å markere og utelukke døde celler fra analysen. Fortsett å omdet en andel av cellene til nye brønner med friskt medium etter hver faktaanalyse for å unngå overvekst under analysen.Hver to til tre dager gjentar du faktaanalysen for å sjekke den relative andelen BFP-positive celler sammenlignet med BFP-negative kolleger. Analyser prosentandelen av BFP positive celler for hvert tidspunkt, ved hjelp av en faktaanalyseprogramvare. Nøkkelen til suksessen til den konkurransedyktige spredningsanalysen er å bruke de riktige gating teknikkene for å sikre at de endelige levende celletallene er nøyaktige.Dra FCS-filer for hvert eksempel inn i programvaren. Dobbeltklikk på en hvilken som helst eksempelfil, og plott en prikkplott med fremoversp punktdiagram versus sidesp punktdiagram, med fremoversp utvalg på x-aksen, og sidesped på y-aksen. Gate alle cellene.Dobbeltklikk på de inngjerdede cellene, og plott levedyktighet flekk på y-aksen versus fremover scatter høyde eller område dot plot. Gate levedyktigheten flekk negative celler. Dobbeltklikk på de inngjerdede levende cellene, og plott BFP på y-aksen versus fremover scatter på x-aksen.Gate BFP positive celler. Bruk alle disse portene på alle eksemplene ved å dra det valgte eksemplet til alle eksemplene under gruppefanen. Klikk på tabellredigeringsprogrammet for å lage en analysetabell for alle eksemplene.Dra BFP-positivtellingen fra ett eksempel til tabellen, og klikk på visningsknappen i tabellredigeringsprogrammet for å opprette en satsvis rapport over alle eksemplene, med tabellen som viser prosentandelen av BFP-positive celler. Lagre tabellen som en Excel-fil. Dette systemet ble brukt til å undersøke rollen til gener som kan spille en rolle i spredning eller overlevelse av menneskelige og murine AML cellelinjer.Rettet mot AAVS1 safe-harbor locus med to separate enkeltguide RNA hadde ingen effekt på spredning av menneskelige MOM13 Cas9-celler I motsetning, da DNA-replikeringsrelatert gen, RPA3, var målrettet, ble en progressiv og betydelig nedgang i prosentandelen av BFP positive celler sammenlignet med BFP negative utransduserte kolleger observert. Tilsvarende ble effekten av enkeltguide RNA-er rettet mot Dot1l, en epigenetisk regulator, og Rhodopsin, øyepigmenteringsgenet, testet i mus MLL-AF9 Cas9-celler. Single guide RNAs rettet mot Dot1l, viste en dramatisk og progressiv nedgang i konkurransespredning i motsetning til enkelt guide RNA rettet mot Rhodopsin.Disse resultatene viser sårbarheten til MLL-AF9 som uttrykker masseleukemiceller til Dot1l depletion, som bekrefter tidligere publiserte resultater. Forutsatt fire til seks guide RNA per gen, er denne metoden godt egnet til å brukes til å teste minst 16 til 24 gener parallelt, og den kan også brukes til å teste genavhengigheter i en hvilken som helst kreftcellelinje. Når det gjelder et større antall gener, for eksempel en hel molekylær vei som må testes i AML-celler, vil pool CRISPR-Cas9-baserte skjermer være mer nyttige.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser å studere macrophage og Microglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Utvikling og vedlikehold av en Preklinisk Pasient Avledet Tumor Xenotransplantat Modell for Undersøkelse av Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Gjær som et chassis for å utvikle funksjonelle analyser for å studere Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Pasient-avledet heterogen Xenograft modell av bukspyttkjertelen Cancer bruke sebrafisk larver som verter for sammenlignende Drug Assessment

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...