Name: investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays at JoVE.com

O plasmídeo pCW-Cas9 foi um presente de Eric Lander & David Sabatini (plasmídeo Addgene # 50661) e o pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plasmídeo W do laboratório Yusa (plasmídeo Addgene #67974. Gostaríamos de agradecer o núcleo de citometria de fluxo no SBP Medical Discovery Institute ajuda oportuna com análise de fluxo e triagem. Nós gostaríamos de reconhecer o apoio da Fundação Memorial Lady Tata a A.D. Gostaríamos de agradecer também o apoio das seguintes fontes de financiamento: NIH/ICN P30 CA030199 Cancer Center patrocinado Grant, a V-Fundação e centros de câncer NCI de San Diego (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. gerar Clones de linha celular AML com alta expressão de Cas9 estável e ativo
<ol><li>Produção de lentivirus Cas9
	<ol>
<li>Dia 0: Placa de 4 x 106 293T células em 10 mL de DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) e a penicilina e a L-glutamina em um prato de cultura de tecido de 10 cm em um nível 2 de biossegurança (BSL2) certificado capa de cultura de células. Coloque o prato em uma incubadora de 37 ° C.</li>
		<li>Dia 1: As células 293T chapeado devem ser confluente de 70 a 80%...

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia.">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li><li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia.">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR/Cas9+editing.">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).</li><li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation.">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes &amp; Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li><li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L.">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li><li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor.">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li><li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation.">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L,+the+H3K79+methyltransferase,+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis.">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li><li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi.">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells.">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li></ol>

Este manuscrito, descrevemos um protocolo detalhado para a realização de um ensaio de crescimento competitivo CRISPR-Cas9-baseado para investigar o papel de genes candidatos em linhas de células de LMA usando citometria de fluxo em células de LMA murino/humano (Figura 5). O objetivo do ensaio é identificar o efeito de supressão do gene na manutenção da proliferação celular AML mais de duas a três semanas em uma escala de rendimento médio. Alguns passos críticos precisam ser segu...

Nas últimas décadas tem visto inúmeros esforços de pesquisa focados em identificar a contribuição das principais vias moleculares na patogênese da leucemia mieloide aguda (LMA). Tradicionalmente, gene-interrupção nas células da LMA foi realizado utilizando camundongos knockout condicional ou RNA curto-gancho de cabelo (shRNA). Enquanto ratos do KO oferecem um sistema sofisticado para controle espaço-temporal de gene-exclusão, gerar os ratos nocaute do gene é trabalhoso, demorado e caro. Além disso, gene-nocautes usar estratégias de recombinação não é facilmente escalável; Estas estratégias não se prestam bem para o interrogatório de vários genes em paralelo. Após a descoberta de métodos de interferência do RNA de mRNAs endógenos de knock-down usando o RNA de interferência pequeno (siRNA) ou shRNA, muitos grupos começaram a usar técnicas de interferência do RNA para investigar o papel de genes específicos na LMA. Desde que as células de LMA murino e humanas são notoriamente difíceis de transfect usando métodos tradicionais baseados em lipídios transfeccao, maioria estuda shRNA trabalhador assalariado, lentivirally ou retrovirally-codificado para estudar a função dos genes em células de LMA. A recente descoberta do cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) e as associado nucleases de Cas (CRISPR-Cas9) revolucionou a gene-alvo tecnologias1,2,3. Usando CRISPR-Cas9, genes específicos ou regiões genômicas podem ser excluídas, edição ou marcadas com facilidade e eficiência. CRISPR Cas9-gene-edição baseada está a emergir como o método de escolha para investigar relações genótipo-para-fenótipo em tipos de células diferentes devido a simplicidade, eficácia e ampla aplicabilidade desta técnica. Métodos baseados em CRISPR-Cas9 também estão se tornando o método de escolha na LMA, não só para interrogar os genes individuais, mas também como uma maneira de atingir múltiplos genes na matriz ou em pool genéticos telas destinadas a investigar vários genes em paralelo como potencial AML-dependências4,5,6.
Este manuscrito, descrevemos um ensaio de crescimento competitivo simples para medir o impacto do gene-perturbação no crescimento de células da LMA, com base em estável CRISPR Cas9-mediada por gene-edição seguido por citometria de fluxo elevado-throughput. Este método é simples, eficiente e escalável para médio-taxa de transferência experiências para investigar o papel de vários genes em paralelo nas células da LMA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FLAG-M2 Antibody</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>F3165, lot # SLBS3530V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31446, lot # TA2514341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single gRNA vector</td>
			<td>Addgene #67974</td>
			<td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic Nuclear extraction kit</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>NXTRACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XtremeGENE 9</td>
			<td>sigma-alorich</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligation buffer</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase enzyme</td>
			<td>NEBioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP9731-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen mini-prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable competent cells</td>
			<td>NEBiolabs</td>
			<td>C3040I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA hydration solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbSI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>42-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2956100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of genetic dependencies using crispr-cas9-based competition assays

Estudos de perturbação do gene têm sido amplamente utilizados para investigar o papel dos genes individuais na patogênese da LMA. Para alcançar a interrupção completa do gene, muitos desses estudos fizeram uso de modelos de complexo gene nocaute. Enquanto estes estudos com camundongos knockout para oferecer um sistema elegante e já testado para investigar as relações genótipo-para-fenótipo, um método rápido e escalável para avaliar genes candidatos que jogar um papel na proliferação celular de LMA ou sobrevivência em modelos de LMA ajudará a acelerar o interrogatório paralelo de múltiplos genes candidatos. Recentes avanços em tecnologias de edição de genoma melhoraram drasticamente nossa capacidade de executar perturbações genéticas em uma escala sem precedentes. Um tal sistema de edição de genoma é o método CRISPR Cas9-baseada que pode ser usado para fazer alterações rápidas e eficazes no genoma de célula de destino. A facilidade e a escalabilidade do gene-exclusão CRISPR/Cas9-mediada torna uma das técnicas mais atraentes para o interrogatório de um grande número de genes em ensaios fenotípicos. Aqui, apresentamos um ensaio simples usando CRISPR/Cas9 mediada gene-interrupção combinado com alta produtividade fluxo cytometry-concorrência baseada nos ensaios para investigar o papel dos genes que podem desempenhar um papel importante na proliferação ou sobrevivência de humanos e linhas de célula murino AML.

Em nosso estudo, nós primeiro transfectadas MOLM13 humana AML linhagem celular que leva a translocação de MLL-AF9 com vírus de alta-Título codificação o plasmídeo de Lentivirus Cas9-blasticidin. Em nossas mãos, em massa de células de MOLM13-Cas9 não seleccionadas não exibir alto nível Cas9 expressão pela mancha ocidental e também não executou bem quando analisada por gene eficiente edição-usando o método descrito anteriormente7. Por conseguinte, ...

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Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Este manuscrito descreve um método de CRISPR-Cas9-baseado em cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repete (CRISPR) para investigação célere e simples do papel dos vários genes candidatos na proliferação de células de leucemia mieloide aguda (LMA) em paralelo. Esta técnica é escalável e pode ser aplicada em outras linhas de células de câncer também.

Investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Este vídeo demonstrará um método simples para investigar múltiplos genes candidatos em LMA em paralelo, usando o sistema Crisper-Cas9 combinado com o ensaio de crescimento competitivo baseado em citometria de fluxo. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida e escalável. Demonstrando o procedimento será Bo Rui Chen, um pós-doutor do nosso laboratório.Um software de design CRISPR baseado na Web é usado para projetar RNAs de quatro a seis guias únicos para o gene de interesse. Para começar, preencha as informações apropriadas nos campos com asteriscos. Em seguida, selecione o genoma alvo para o design de RNA de guia único.Cole a sequência de destino na caixa de sequência e clique no botão enviar. Para clonagem no guia único desejado plasmídeo de expressão RNA, prepend os nucleotídeos CACC para o sentido oglionucleotídeo e AAAC para o oligonucleotídeo antissamparado reverso. O sentido pré-misturado e oligonucleotídeos antissamo-americanos são então encomendados de uma empresa em uma placa de 96 poços, rotulada Oligo Mix.Coloque uma placa de poço U-Bottom 96 separada, rotulada placa de annealing. Prepare uma mistura mestre de um microliter de T4 polinucleotídeo quinase, um microliter de 10x T4 tampão de ligadura de DNA, e seis microliters de água por reação de ressarcimento. Adicione 8 microliters da mistura mestre a cada poço da Placa de Enraizamento, seguido por 2 microliters de sentido pré-x e oligonucleotídeos antissamonucleotídeos.Pipeta duas a três vezes suavemente para misturar bem, e, em seguida, gire a placa brevemente para obter as misturas para o fundo dos poços. Use o seguinte programa de ressarção em uma máquina PCR. 37 graus Celsius durante 30 minutos, 95 graus Celsius por dois minutos e 30 segundos, seguido de resfriamento lento a 22 graus Celsius a uma taxa de 0,1 graus Celsius por segundo.Quando o ressarcimento estiver completo, prepare uma placa fresca de 96 poços, rotulada de Mistura Oligo Diluída, diluindo os oligonucleotídeos fosforilados e enlatados da reação de ressarcimento de um a 200 com água. Linearize o vetor de expressão RNA de guia único digerindo cinco microgramas do vetor com 1,5 microliters de enzima de restrição BBS1, usando um buffer apropriado a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, pegue uma placa de ligation fresca de 96 bem rotulada, e adicione 20 nanogramas do vetor de expressão RNA de guia único do BBS1 a um bem por ligadura de guia único desejada.Para isso, adicione 2 microliters de oligonucleotídeos relados fosfoilados da placa Oligo Mix diluída. Adicione a cada poço, um microliter de tampão de ligase 10X T4, e um microliter de enzima ligase T4, e pipeta suavemente para misturar. Incubar a placa em temperatura ambiente por duas horas.Cerca de 10 minutos antes da reação de ligadura ser feita, encha 90 microliters de células E.coli quimicamente competentes no gelo. Transfira 10 alíquotas de microliter das células competentes para cada poço de uma placa de 96 bem separada individualmente. Adicione a mistura de ligadura nos poços que contêm as células competentes.Pipeta para cima e para baixo suavemente, e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Pipeta cinco microliters da bactéria DNA misturam-se de cada reação de transformação diretamente em um poço de uma placa de 6 poços, contendo ágar LB com 100 miligramas por mililitro de ampicillina. Adicione aproximadamente cinco a oito contas de vidro a cada poço, e agite a placa de 6 poços oito a dez vezes em um movimento circular.Incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, escolha uma a duas colônias únicas de cada poço, com uma ponta de pipeta de 20 microliteres estéril, e coloque-a em um ponto rotulado em uma placa de petri de 10 centímetros estéril, com ágar LB e 100 miligramas por mililitro de ampicillina Depois de estiliar na placa LB, ejete a ponta em três mililitros de ampicillina média em um tubo de 14 mililitros em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros. , marcado com o número correspondente do clone bacteriano. A placa bacteriana é então enviada diretamente para sequenciamento Sanger.Após uma confirmação sequencial do guia único clonado RNAs, purifique o DNA do tubo correspondente de 14 mililitros, usando um kit miniprep de acordo com as instruções do fabricante. As partículas lentiviras de RNA guia única são produzidas em um formato de poço 96, conforme descrito no protocolo de texto. E o supernante viral é imediatamente congelado a menos 80 graus Celsius.Um dia antes da transdução de RNAs guia único em células AML Cas9, cubra uma cultura plana de fundo não tecido tratada 96 placas de poço, com 100 mililitros de fragmento de fibronectina humana recombinante a uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Enrole a placa com envoltório de aderência para evitar a perda de evaporação e deixe-a no banco durante a noite. No dia seguinte, remova o fragmento de fibronectina humana recombinante de cada poço da placa do poço 96.Descongele o supernatante viral de cada RNA guia a temperatura ambiente. Adicione 50 microliters de supernascer viral de cada tubo a cada poço revestido da placa de transdução. Enrole a placa com envoltório de aderência para evitar contaminação potencial durante a centrifugação.Gire a placa a 1.300 vezes g a 35 graus Celsius por 90 minutos. No final da spinfecção, conte o alto Cas9 expressando células B3 do frasco de cultura. Após a contagem, abaixe o número necessário de células e resuspense em meio fresco.Após a 90 minutos de spinfection, use uma pipeta multicanal ajustada a 50 microliters para remover o sobrenante de todos os poços lentamente inclinando a placa. Adicione 100 microliter da cultura das células B3 clones a cada poço lentamente, deslizando para baixo da borda. Gire a placa a 1.300 vezes g a 35 graus Celsius por dois minutos para deixar as células se acomodarem até o fundo.Transfira a placa para uma incubadora de grau de cultura de tecido de 37 graus Celsius. No dia seguinte, adicione 100 microliters de meio fresco a cada poço contendo células transduzidas por RNA de guia único, de tal forma que o volume médio final seja de 200 microliters. Devolva a placa para a incubadora.72 horas após a transdução, verifique a porcentagem de RNA guia único contendo células positivas de BFP em cada poço por citometria de fluxo. Use um corante de viabilidade celular para marcar e excluir células mortas da análise. Continue reescarando uma proporção das células em novos poços com meio fresco após cada análise de fatos para evitar o crescimento excessivo durante o ensaio.A cada dois ou três dias, repita a análise dos fatos para verificar a proporção relativa de células positivas de BFP em comparação com as contrapartes negativas do BFP. Analisar a porcentagem de células positivas de BFP para cada ponto de tempo, utilizando um software de análise de fatos. A chave para o sucesso do ensaio de proliferação competitiva é usar as técnicas adequadas de gating para garantir que os eventuais números de células vivas sejam precisos.Arraste arquivos FCS para cada amostra no software. Clique duas vezes em qualquer arquivo de amostra e plote um gráfico de ponto de dispersão para a frente versus dispersão lateral, com dispersão para a frente no eixo x e dispersão lateral no eixo y. Portão todas as células.Clique duas vezes nas células fechadas e local de vibilidade do gráfico no eixo y versus altura de dispersão dianteira ou gráfico de ponto de área. Portão a viabilidade mancha células negativas. Clique duas vezes nas células ao vivo fechadas e plote BFP no eixo y versus dispersão para a frente no eixo x.Portão das células positivas BFP. Aplique todos esses portões a todas as amostras arrastando a amostra selecionada para todas as amostras sob a guia do grupo. Clique no editor de tabela para fazer uma tabela de análise de todas as amostras.Arraste a contagem positiva do BFP de uma amostra para a tabela e clique no botão de exibição no editor de tabela para criar um relatório em lote de todas as amostras, com a tabela exibindo a porcentagem de células positivas de BFP. Salve a tabela como um arquivo excel. Este sistema foi usado para investigar o papel dos genes que podem desempenhar um papel na proliferação ou sobrevivência das linhas celulares humanas e murinas da LMA.O alvo do lócus de porto seguro AAVS1 com dois RNAs guia único separado não teve efeito na proliferação de células humanas MOM13 Cas9 Em contraste, quando o gene associado à replicação de DNA, RPA3, foi direcionado, observou-se um declínio progressivo e significativo no percentual de células positivas de BFP em comparação com as contrapartes negativas não traduzidas do BFP. Da mesma forma, os efeitos das RNAs de guia única visando Dot1l, um regulador epigenético, e Rhodopsin, o gene de pigmentação ocular, foram testados em células MLL-AF9 Cas9 do mouse. O guia único RNAs visando o Dot1l, mostrou um declínio dramático e progressivo na proliferação competitiva em contraste com o guia único RNAs visando Rhodopsin.Esses resultados demonstram a vulnerabilidade do MLL-AF9 expressando células de leucemia em massa ao esgotamento do Dot1l, confirmando resultados publicados anteriormente. Assumindo quatro a seis RNAs guia por gene, este método é bem adequado para ser usado para testar pelo menos 16 a 24 genes em paralelo, e também pode ser aplicado para testar dependências genéticas em qualquer linha celular cancerosa. No caso de um número maior de genes, como toda uma via molecular que precisa ser testada em células AML, as telas baseadas em pool CRISPR-Cas9 serão mais úteis.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Co-cultura Ensaios para estudar macrófagos e Microglia Estimulação do Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Pesquisa do câncer

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Desenvolvimento e manutenção de um tumor do paciente pré-clínica Derivado Xenoenxerto Modelo de Investigação de Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Avaliação do perfil metabólico das células de leucemia primária

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Fermento como um chassi para desenvolver ensaios funcionais para estudar p53 humano

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Modelo de Xenoenxerto heterogêneo derivado do paciente do câncer pancreático usando larvas de zebrafish como hospedeiros para avaliação comparativa de fármacos

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...